13.2 基于PLGA納米粒子抗腫瘤藥物

1、基于PLGA納米粒子抗腫瘤藥物高分子納米藥物根據其制備原料的來源可分為兩大類:第一類為基于天然存在的高分子材料制備的納米藥物，包括基干蛋白質類：膠原（Collagen）,白蛋白（Albumin）,明膠（Gelatin）以及聚多糖類：瓊脂糖（Agarose）,誘明質酸（HA）,葡聚糖（Dextran）,殼聚糖（Chitosan）和環(huán)糊精（Cyclodextrins）等天然材料制備的納米藥物，如：白蛋白結合型紫杉醇（PTX）納米藥物Abraxane在2005年被批準用于治療轉移性胰腺癌和肺癌；CRLX-101是基于環(huán)糊精的喜樹堿納米藥物，目前在臨床二期研究階段。第二類是基于人工合成的高分子材料制備

2、的納米藥物，包括基于聚（丙交酯-乙交酯）（PLGA）、聚乳酸（PLA）、聚乙交酯（PGA）、聚己內酉旨（PCL）、聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVA）、聚磷酸酉旨Polv（phosphoesters）、聚氰基丙烯酸烷基酯（PACAs）、聚原酸酯（POE）、聚酰胺Poly（amides）、聚酯酰胺（PEAs）以及聚氨基酸Poly（aminoacids）等制備的納米藥物，如:PEG化的脂質體阿霉素（DOX）Doxil于1995年被USFDA批準上市，用于治療乳腺癌、卵巢癌、骨髓瘤以及艾滋病相關性卡波西肉瘤；基于PEG-PLA的PTX納米藥物Genexol-PM于2007年在韓國被批準用于乳腺癌、

3、肺癌以及卵巢癌的治療;NC-6004（Nanoplatin）是基于PEG-PGA的順鉑納米藥物，正處于臨床一期研究階段，另外其用于胰腺癌的臨床三期實驗也在進行中；NK911是基于Poly（ethyleneglycol）-b-poly（asparticacid）（PEG-PAA）的DOX前藥納米藥物；基于PEG-PLA的主動靶向性多西他賽（DTX）納米藥物BIND-014靶向到前列腺特異性膜抗原（PMSA）,用于治療前列腺癌、非小細胞肺癌、宮頸癌、膀胱癌以及頭頸癌的研究處于臨床II期。基于人工合成的高分子納米藥物由于其化學性質穩(wěn)定、可規(guī)模化生產、便于化學修飾,在癌癥的治療中取得了令人振奮的成果。

4、人工合成的高分子具有較高的均一性以及純度，使得納米藥物的制備具有較高的可重復性。在眾多的合成高分子材料中，PLGA由于具有良好的生物相容性以及生物可降解性，被廣泛應用于生物組織工程以及抗癌藥物輸送體系。1基于PLGA的納米抗癌藥物的制備PLGA是眾多聚合物中在生物醫(yī)學領域應用最為廣泛的一種合成高分子材料。由于其具有優(yōu)異的生物相容性和生物可降解性，被USFDA和歐盟醫(yī)藥管理局（EMA）批準用于制備多種藥物的體內遞送系統(tǒng)。PLGA由丙交酯和乙交酯兩種單體在辛酸亞錫或者異丙醇鋁等催化劑的催化作用下通過無規(guī)開環(huán)共聚制備得到。丙交酯和乙交酯單元通過酯鍵連接在一起，在聚合過程中調節(jié)丙交酯和乙交酯的比例可得

5、到組成不同的聚合物，例如PLGA50:50（表示聚合物由50%的丙交酯和50%的乙交酯構成），PLGA75:25、PLGA85:15等。PLGA的降解主要是聚合物鏈中酯鍵的水解引起的，不同分子量以及單體比例的PLGA的降解時間為幾天到幾個月甚至幾年不等。通常丙交酯含量較低的低分子量PLGA的降解速率較快，可能是因為乙交酯的親水性較強，容易吸收大量的水分，促進聚合物的降解。另外聚合物末端的基團也會影響其降解的速率，羧基封端的PLGA的降解速率快于羥基封端的PLGA。通過調節(jié)PLGA的分子量、丙交酯和乙交酯的比例以及其末端基團可以控制聚合物的降解速率。PLGA通過水解產生兩種代謝產物：乳酸和羥基乙

6、酸（Figure1.3）,這兩種分子在體內通過Krebs循環(huán)被代謝掉，不會產生任何系統(tǒng)副作用，保證了體內使用的安全性。HQH+PLGAGlycolifAcidMaUbcHcPthwiy*L心機睦AcidFigure1.3StructureandhydrolysisofPLGA.11常規(guī)PLGA納米藥物采用不同的制備方法，可以實現(xiàn)PLGA納米載體對多種藥物，包括小分子親水或疏水藥物、大分子蛋白類藥物、生物類的核酸藥物DNA和RNA的包載。此外，通過使用不同單體比例組成、不同分子量或者不同末端基團PLGA制備的納米抗癌藥物，可以實現(xiàn)對藥物的控制釋放°PLGA納米粒子主要通過乳化-溶劑揮發(fā)

7、法、乳化-溶劑擴散法、乳化-反向鹽析法、透析法、噴霧干燥法以及納米沉淀法制備得到。接下來將詳細介紹每種制備方法的過程、使用條件以及優(yōu)缺點。乳化-溶劑揮發(fā)法包括單乳化法和雙乳化法兩種，單乳化（水包油）法：將PLGA和藥物共同溶解在具有揮發(fā)性的有機溶劑，如二氯甲烷、氯仿或者乙腈中，然后將該溶液加入到持續(xù)攪拌的包含有表面活性劑，如聚乙烯醇（PVA）、吐溫80、泊洛沙姆188或者維生素E聚乙二醇琥珀酸酯（VitaminE-TPGS）的水溶液中，產生穩(wěn)定的乳液。隨后通過升高溫度、降低壓力或者持續(xù)磁力攪拌的方法將有機溶劑除去，適用于制備包載親脂性藥物分子如PTX、DTX、DOX等。雙乳化（水包油包水）法：

8、將藥物溶解在去離子水中并且滴加至強力攪拌的溶解有PLGA的揮發(fā)性有機相中，形成油包水的初始乳液，隨后將該乳液加入到水溶液中經磁力攪拌形成最終的乳液，最后將有機溶劑通過揮發(fā)法除去，適用于包載親水性藥物，如小分子甲氨蝶吟二鈉（MTX2Na）、蛋白類藥物，如胰島素以及疫苗等。乳化-：溶劑擴散法：通過高速勻漿將溶解有聚合物和藥物的有機相在含有表面活性劑的水溶液中進行乳化，有機相和水相在室溫條件下形成互相飽和的熱力學平衡體系，隨后在均勻攪拌下加入大量的水形成膠體納米粒子，通過揮發(fā)或者旋蒸的方法除去有機溶劑。該方法制備的納米粒子具有以下優(yōu)點：藥物包載率高、可重復性強、易于量產、納米粒子分布窄、制備簡便。缺

9、點主要是對水溶性的藥物包載不理想，容易泄露并且需要除去大量的水。乳化-反反向鹽析法：將聚合物和藥物同時溶解在與水互溶的有機溶劑中，隨后將其加入到強力攪拌的溶解有鹽析試劑和乳化劑的水溶液中，形成水包油的乳液。隨后加入大量的水，揮發(fā)性有機溶劑將會擴散至水相中，促進納米粒子的形成。殘留的有機溶劑以及鹽析試劑通過過濾的方法除去。該方法適用于對熱不穩(wěn)定的藥物如蛋白質、DNA、RNA的制備。透析法：透析法可以制備粒徑較小且分布較窄的納米粒子。將聚合物溶解在揮發(fā)性的有機相中，隨后將其轉入透析袋中，透析袋中的有機相將被置換為水，聚合物的溶解性降低，逐步聚集最終形成均一的納米粒子溶液。噴霧干燥法：該方法可以作為

10、制備聚合物納米粒子的常規(guī)方法的替代。在制備的過程中，油包水的分散液經過熱空氣流噴射形成納米粒子。該方法制備納米粒子的缺點是納米粒子將會粘附在干燥噴霧器的內壁，降低了納米粒子的回收效率。納米沉淀法：又稱溶劑置換法，這種方法簡便易操作，只需一步操作，適用于包裹疏水性的藥物分子。將聚合物和藥物分子溶解在與水互溶的極性有機相，如丙酮、乙醇、甲醇或者乙腈中，將有機相逐滴滴加到含有乳化劑或者表面活性劑的水溶液中，有機溶劑快速地擴散出來，形成納米粒子。很多研究表明PLGA納米粒子一旦經尾靜脈注射進入體內后會與血液中存在的調理素蛋白結合，隨后被巨噬細胞吞噬，最終納米粒子將會通過人體的網狀內皮系統(tǒng)（RES）清除

11、。為了避免PLGA納米粒子被RES清除，研究人員設計了不同的策略對PLGA納米粒子進行表面改性。在PLGA納米粒子的表面覆蓋一層親水性的分子或者利用生物體內本身存在的物質將PLAG納米粒子“偽裝”成體內的內源性物質，可以有效避免RES對PLGA納米粒子的清除。1.2PEG改性的PLGA納米藥物PEG是最常用于納米粒子表面改性的親水性聚合物，其具有優(yōu)異的生物相容性。PEG化作用能夠有效地降低納米粒子與血液中蛋白的結合，顯著提高納米粒子的穩(wěn)定性、延長體內循環(huán)時間，從而增加納米藥物在腫瘤組織的富集。將PLGA納米粒子表面PEG化有兩種方法，一種是通過化學鍵直接將PEG與PLGA鍵合在一起，制備雙親性

12、的聚合物如PEG-PLGA、PLGA-PEG-PLGA或者PEG-PLGA-PEG，然后通過聚合物的自組裝形成PLGA為核PEG為殼的納米粒子。例如，Haddadi報道了一種由兩嵌段聚合物PEG-PLGA通過在水溶液中組裝形成的PLGA納米粒子(PLGA-PEGNPs)。裝載DTX后納米粒子顯著延長了藥物的半衰期，其t1/2分別是PLGA包載的DTX以及自由DTX的2.62倍和3.69倍。Chen報道了PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物膠束包載穿心蓮內酯(ADG),用于藥物的細胞內遞送。膠束包載的ADG具有更高的生物利用率，相對于自由ADG，其藥時曲線下面積(AUC)和血漿平均停留時間分別

13、提高了2.7倍和2.5倍，說明包載ADG的膠束極大地改善了藥物的生物利用度。此外，載藥膠束對MDA-MB-231細胞表現(xiàn)出了較強的細胞增殖抑制作用以及促進細胞凋亡的效果。另外一種方法是將含有PEG的兩親性聚合物與PLGA通過共組裝或者后修飾的方式包被在PLGA納米粒子的表面。Zhang等報道了由PLGA、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)與mPEG-DSPE通過一步納米沉淀法制備的納米粒子(PLGA-Lipid-PEGNP)(Figure1.4)。同時制備了由PEG-PLGA自組裝形成的PLGA-PEGNP以及表面未經過修飾的PLGA納米粒子PLGANP作為對照組。在含有10%人血清白蛋白的介質

14、中孵育60min后，PLGA-Lipid-PEGNP以及PLGA-PEGNP粒徑基本保持穩(wěn)定，而PLGANP的粒徑從90nm增大至200-300nm。將PEG修飾在PLGA納米粒子表面后，顯著減少了納米粒子對蛋白的吸附，增強了其在血液中的穩(wěn)定性。nuLlpid-PEGDrug1QQnnFigure1.4Developmentoflipidpolymerhybridnanoparticles(NPs).(A)SchematicillustrationshowstheformulationoflipidpolymerhybridNPs.TheNPscompriseahydrophobicPLGA(

15、polylactic-co-glycolicacid)core，ahydrophilicPEG(polyethyleneglycol)shell，andalipid(lecithin)monolayerattheinterfaceofthehydrophobiccoreandthehydrophilicshell.(B)Transmissionelectronmicroscopy(TEM)imagedemonstratedthestructureofthehybridNPsproposedin(A).VitaminE-TPGS是一種水溶性的PEG衍生物，在制備PLGA納米粒子時通常被用做表面活

16、性劑，不僅可以增強PLGA納米粒子的穩(wěn)定性而且可以增加對藥物的包載效率。Feng報道了VitaminE-TPGS乳化制備的PLGA納米粒子用于抗癌藥物DTX的高效包載以及腫瘤遞送，PLGA-b-TPGS對DTX的包載效率為85.91%,明顯高于PLGA(78.36%),并且具有較強的抑制細胞增殖的能力其半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.33卩g/mL相對于自由DTX其細胞毒性提高了32倍。1.3多糖及蛋白改性的PLGA納米藥物將牛物相容性良好的天然聚多糖包括HA、Dextran、Chitosan等，以及一些人體內的內源性物質如人血清白蛋白(HSA)修飾到PLGA納米粒子的表面也可以改善其表面性質，

17、降低蛋白吸附，延長納米藥物的循環(huán)時間提高抗腫瘤效果。例如,Du報道了基于兩親性共聚物Dex-PLGA制備的膠束包載PTX用于腫瘤的遞送。Dex-PLGA/PTX相對于自由PTX，對多種癌細胞如SKOV-3、OVCAR-8以及MCF-7細胞表現(xiàn)出較強的抗細胞增殖作用。此外，該載藥膠束顯著提高了藥物的體內最大耐受劑量(MTD>200mgPTX/kg)，相對于自由PTX提高了8倍。體內抗腫瘤實驗結果表明，Dex-PLGA/PTX能夠有效抑制腫瘤的生長以及顯著降低藥物的毒副作用，而且在高劑量藥物作用下可以完全消除腫瘤oDinarvand報道了HSA表面修飾過的PLGA納米粒子，能夠有效地將PTX

18、運送至T47D乳腺癌細胞中。當PTX濃度為15nM時，細胞的存活率為43%，細胞殺傷力明顯強于自由PTX、未經HSA修飾的載PTX納米粒子。1.4細胞膜“偽裝”的的PLGA納米藥物將細胞膜包被在PLGA納米粒子表面制備得到細胞膜“偽裝”的PLGA納米藥物，不僅能夠顯著延長藥物的循環(huán)時間，而且可賦予納米粒子主動靶向功能，提高癌細胞對納米粒子的攝取量，進而增強PLGA納米藥物的抗腫瘤治療效果。近些年來，研究者們制備了不同細胞膜，主要包括紅細胞膜、癌細胞膜、血小板膜偽裝的PLGA納米藥物用于多種癌癥的治療。其制備過程主要包含細胞膜的提取、納米粒子的制備以及細胞膜和納米粒子的融合。例如，F(xiàn)igurel

19、.5是紅細胞膜(RBC)包被的PLGA納米藥物的制備流程圖，RBC膜“偽裝”的PLGA納米粒子的循環(huán)時間極大地得到延長，為39.6h,經過PEG進行表面修飾后的PLGA納米粒子的循環(huán)時間為15.8hoZhang報道了乳腺癌MDA-MB-435細胞膜包被的PLGA納米粒子，顯著提高了其對MDA-MB-231細胞的主動靶向能力。該納米粒子能夠高效的被MDA-MB-435細胞攝取,攝取量分別是PLGA納米粒子的40倍和紅細胞膜包被的PLGA納米粒子的20倍oLiu報道了RBC包被的包載四氟化碳的PLGA納米粒子(PFCPLGA-RBCM),經過RBC包被之后，PLGA納米粒子的穩(wěn)定性明顯得到提高，而

20、且極大地延長了體內循環(huán)時間。PFC具有極高的溶氧氣能力，相對于未經過RBC包被的PLGA納米粒子(PFCPLGA)，PFCPLGA-RBCM能夠以一種更具有持續(xù)性的方式將O2釋放出。通過TEM可以觀察到PFCPLGA-RBCM的結構在釋放O2前后沒有發(fā)生明顯地變化。藥代動力學研究表明，PFCPLGA-RBCM具有較長的體內循環(huán)時間，約為13.93h,相對于他們之前報道的白蛋白包被的PLGA納米粒子的循環(huán)時間延長了2倍。納米藥物的最終目標是將活性藥物以自由的分子形式傳遞到癌細胞內，并發(fā)揮其藥效。通常靜脈注射到生物體的納米藥物要經歷一個五級的級聯(lián)步驟才能將藥物遞送到細胞內：通過血液的長循環(huán)、由EP

21、R效應在腫瘤部位富集、滲透到腫瘤組織深處、內吞進入細胞、細胞內釋放藥物(Figure1.6)。因此，盡可能地提高每一個步驟的效率才能實現(xiàn)最佳的藥物傳遞效率。Figure1.5Redbloodcell(RBC)membrane-coatedpoly(D,L-lactide-co-glycolide)(PLGA)nanoparticles(NPs).Cellularmembranesprovidearobustnaturalfunctionalitytotheparticle.Incomparativestudieswithpolyethyleneglycol(PEG)-coatedNPs,RBC

22、membrane-coatedNPsexhibiteda39.6-hhalf-lifecomparedwith15.8hforPEGNPs.傳統(tǒng)納米藥物雖然降低了藥物的系統(tǒng)毒副作用，但是其對腫瘤的治療效果還與理想狀態(tài)相差甚遠，其原因非常復雜。PEG化的納米藥物雖然減少了蛋白的吸附，但是由于位阻作用降低了腫瘤細胞對納米藥物的內吞，納米藥物進入細胞后由于聚合物降解緩慢，導致其釋藥速率緩慢，藥效不足。基于此，研究者們設計制備了具有多功能的PLGA納米抗癌藥物如主動靶向PLGA納米抗癌藥物和刺激響應PLGA納米抗癌藥物，這些納米抗癌藥物在臨床前試驗中表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤效果，極大地促進了PLGA納米抗

23、癌藥物的發(fā)展，為其臨床轉化提供了無限的可能。CirculationPenetration島:粋JDrugffeleae/TobethereTbbefree5”班即CAP陽CawcBH哥>Q=QrXQjXQpXQjXQff心:-'於:dccumulotionTheCAPiRCascadeofCancerDrugDeliveryFigure1.6AsketchoftheCAPIRcascadeofananomedicinetodeliverafreedrugintocancercells:circulationinthebloodcompartments,tumoraccumulat

24、ionandpenetration,andsubsequentcellularinternalizationandintracellulardrugrelease.2主動靶向PLGA納米抗癌藥物通過對PLGA納米粒子進行表面改性可以減弱RES的清除作用，延長其循環(huán)時間，提高納米粒子在腫瘤組織的富集量。然而大多數(shù)藥物需要進入細胞內部才能產生作用，為了促進納米藥物快速、大量進入細胞內，研究者們在納米藥物的表面修飾具有主動靶向功能的配體來促進細胞的內吞。在納米藥物的表面修飾腫瘤特異性的配體如抗體、抗體片段、多肽、多糖、適配子、葉酸等，使納米藥物通過受體-配體結合作用介導的內吞方式進入細胞，提高其在癌

25、細胞內的富集，稱為主動靶向(Figure1.7B)。主動靶向型納米藥物通過增加與細胞的有效結合、減少非特異性的吸附和攝取以及規(guī)避細胞的耐藥等作用增加其在腫瘤細胞內的富集。r-kndkrthcluloHIfWTunw.hpnd*AodmicerI$ru<£receptorA.Pg)5-S4v&targolingdryf.Figure1.7(A)Passivetargetingofnanocarriersand(B)activetargetingstrategies.Ligandsgraftedatthesurfaceofnanocarriersbindtoreceptor

26、soverexpressedbycancercellsorangiogenicendothelialcells.近些年來，研究者們設計了不同靶向配體修飾的PLGA納米藥物用于多種腫瘤的主動靶向遞送，包括表面偶聯(lián)抗體的PLGA納米藥物、多肽分子修飾的PLGA納米藥物、適配體修飾的PLGA納米藥物64-66、小分子修飾的PLGA納米藥物以及多糖飾的PLGA納米藥物。21蛋白介導的的PLGA納米藥物近些年來，抗體、抗體片段、生長因子、轉鐵蛋白等被用作靶向配體修飾在納米藥物的表面以制備主動靶向納米藥物?？贵w及其衍生物對其靶點具有非常高的特異性親和力，在過去的幾十年中，單克隆抗體在癌癥治療中得到了廣泛地

27、應用。很多抗體被用作靶向分子，例如用于形成抗體-藥物偶聯(lián)物(ADCs)以及修飾在納米粒子表面。Benita報道了表面偶聯(lián)西妥昔單抗、包載了一種PTX前藥的PLGA納米粒子，用于EGFR過表達的非小細胞肺癌的靶向治療。CLSM結果顯示，孵育4h后，包載香豆素6的納米粒子在A549細胞的細胞質中顯示出明顯的熒光信號，相對于無靶向的納米粒子，細胞對表面偶連了西妥昔單抗的納米粒子的攝取量更多。在加入單抗對細胞進行預處理之后，納米粒子熒光強度減弱，證明細胞對納米粒子的攝取受到了抑制。荷瘤小鼠體內抑瘤實驗結果顯示，在接種之后的56天內，相對于非靶向載藥納米粒子、自由藥物，靶向載藥納米粒子具有顯著提高的腫瘤

28、抑制效果(*p<0.05)，并且顯著延長了小鼠生存率(*p<0.001)。Du制備了CA19-9抗體修飾的、基于PEG-PLGA-PLL聚合物的、包載PTX的納米粒子(PTX-NPs-antiCA19-9)，聯(lián)合超聲介導微泡摧毀(UMMD)技術用于胰腺癌的靶向治療。CCK-8實驗結果顯示，PTX-NPs-antiCA19-9對人胰腺癌Capan-1細胞具有較強的殺傷能力，孵育48h后，其IC50為6.408卩g/mL,而無靶向PTX-NPs為21.316卩g/mL。將細胞預先經過自由的抗體處理過之后，再加入PTX-NPs-antiCA19-9孵育，其IC50與無靶向組相當為26.5

29、81卩g/mL。此外，PTX-NPs-antiCA19-9聯(lián)合UMMD對細胞產生最強的殺傷作用，其IC50為3.219卩g/mL。PTX-NPs-antiCA19-9和PTX-NPs都具有較長的循環(huán)時間分別為36.10和29.20h較自由PTX顯著延長。在胰腺癌小鼠移植瘤模型體內抗腫瘤實驗中,PTX-NPs-antiCA19-9表現(xiàn)出較好的抑瘤效果，其抑瘤率為82.99%，高于PTX-NPs（62.24%）和自由PTX（16.02%）治療組，并且顯著延長了小鼠的生存時間，其中位生存期為63天，而PTX-NPs和自由PTX治療組分別為51和43天。另外，PTX-NPs-antiCA19-9聯(lián)合U

30、MMD具更好的體內抗腫瘤效果，其抑瘤率為90.51%，小鼠中位生存期為75天。2.2多肽的介導的PLGA納米藥物與蛋白相比，多肽具有更多的優(yōu)勢，例如生產成本低、穩(wěn)定性好、易于大規(guī)模生產、操作簡便以及較低的免疫原反應。而且，多肽與納米粒子的偶聯(lián)可以被精確地控制。近年來，RGD、GE11、cNGQ、iRGD、A6、T7、Angiopep-2以及Tlyp-1肽等多肽被發(fā)現(xiàn)對多種腫瘤細胞具有靶向性，被用作靶向配體修飾在納米藥物的表面。例如,Jiang設計制備了一種T7修飾的、包載卡莫司?。˙CNU）的PEG-PLGA膠束用于腦膠質瘤的靶向治療。MTT結果顯示，在U87細胞中孵育24h后，T7-PEG-

31、PLGA/BCNU的IC50值為3.902mg/mL,相對于PEG-PLGA/BCNU和自由BCNU分別低了1.89和3.90倍。體內分布實驗結果顯示，包載NIR染料（BODIPY）的T7-PEG-PLGA膠束，在腦腫瘤部位的熒光強度明顯高于PEG-PLGA膠束。在荷U87原位腦膠質瘤模型的小鼠體內研究T7-PEG-PLGA/BCNU、PEG-PLGA/BCNU以及BCNU的治療效果，通過生物發(fā)光成像實時監(jiān)測腫瘤的大小。Figure1.8顯示，在給藥治療7天后，所有治療組小鼠相對于第0天時，腦部熒光強度減弱，說明腫瘤縮小，腫瘤生長受到了抑制。在第17天，經過三次給藥治療后，T7-PEG-PLG

32、A/BCNU治療組小鼠腦部熒光強度進一步減弱，說明腫瘤得到了較好的抑制，而PEG-PLGA/BCNU和BCNU治療組，小鼠腦部熒光強度增強，腫瘤在持續(xù)生長。上述實驗結果證明，相對于無靶向組PEG-PLGA膠束，靶向T7-PEG-PLGA膠束具有更好的腫瘤治療效果。Zhang報道了Angiopep-2多肽修飾的、包載DTX的PLGAAu納米粒子（ANG/GS/PLGA/DTXNPs），用于腦膠質瘤的治療。細胞凋亡實驗結果顯示，孵育48h后，經過ANG/GS/PLGA/DTXNPs處理的U87細胞，其早期細胞凋亡比例為29.2%，相對于無靶向組以及自由DTX組分別提高了2.2和1.9倍。將包載IR

33、780熒光分子的納米粒子注射到荷瘤小鼠體內后，通過活體成像技術實時監(jiān)測其在體內的分布情況。成像結果顯示，在注射后的2h到24h內，ANG/GS/PLGA/DTXNPs在腫瘤組織維持較高的富集量，而且明顯高于非靶向GS/PLGA/DTXNPs。體內抗腫瘤實驗結果顯示,ANG/GS/PLGA/DTXNPs較GS/PLGA/DTXNPs具有顯著增強的抑瘤作用，其腫瘤抑制率提高了2倍。Chen制備了iRGD修飾的基于DSPE-PEG和末端修飾硫辛酸（LA）的LA-PLGA-TPGS兩種聚合物的還原響應交聯(lián)混合膠束（iRGD-MM）,將DTX靶向遞送到a5卩1過表達的宮頸癌Hela細胞內。流式細胞實驗結

34、果顯示，孵育6h后，細胞對iRGD-MM的攝取量相對于無靶向MM提高了4倍，iRGD-MM能夠更高效的通過受體介導的方式進入細胞中。MTT實驗結果顯示，在Hela細胞中iRGD-MM-DTX的細胞毒性顯著高于無靶向組MM-DTX以及自由DTX。在a5卩1低表達的SMMC-7721細胞中iRGD-MM-DTX和無靶向組MM-DTX的細胞毒性之間沒有明顯差別，表明了在Hela細胞中iRGD介導的腫瘤靶向作用促進了細胞對納米藥物的攝取。Figure1.8Anti-gliomaefficacyofdifferentmicellesonmodelmice.Real-timebioluminescence

35、imagesofthegliomamodelnudemiceinjectedwithsaline,freeBCNU,PEG-PLGA/BCNU,andT7-PEGPLGA/BCNUmicellesondays0,7and17.2.3多糖的介導的PLGA納米藥物癌細胞的表面會過表達不同種類的糖，其中在肝癌細胞表面有過量脫唾液酸糖蛋白受體（ASGP-R）的表達，ASGP-R成為肝癌靶向治療的重要靶點。例如，Wang制備了普魯蘭多糖衍生物（CAPL）修飾的PLGA納米粒子、同時包載考不他?。–A4）和PTX（CAPL/PBAE/PLGA），用于肝癌的靶向治療。普魯蘭多糖可以特異靶向到HepG2肝癌細

36、胞表面過表達的ASGP-R。在荷HepG2肝癌的小鼠中，CAPL/PBAE/PLGA具有良好的靶向作用，能夠顯著提高CA4和PTX的協(xié)同抗腫瘤效果。此外，天然多糖HA在靶向藥物傳遞領域引起了廣泛的關注。HA是一種具有優(yōu)異的生物相容性和生物可降解性的天然高分子。CD44和RHAMM是HA的結合受體，其在多種具有高度轉移性惡性腫瘤細胞表面過表達，因而，HA已經被廣泛地應用于多種抗癌藥的主動靶向傳遞。例如，Zhong報道了基于HA-b-PLGA的納米粒子(SANPs),將DTX靶向遞送至CD44過表達的MDA-MB-231乳腺癌細胞(Figure1.9A)。將香豆素-6(C-6)包載到納米粒子中，通

37、過CLSM實驗研究MDA-MB-231細胞對靶向納米粒子(C-6/SANPs)和無靶向納米粒子(C-6/PLGA)的攝取情況。CLSM實驗結果顯示，C-6/SANPs組細胞的熒光強度顯著高于C-6/PLGA組(*p<0.01)。加入HA對細胞表面受體進行封閉之后，C-6/SANPs組細胞內熒光強度顯著降低(*p<0.001),證明細胞對C-6/SANPs的攝取量減少。MTT實驗結果顯示DTX/SANPs對MDA-MB-231細胞具有較好的細胞殺傷能力，其IC50為9.68ng/mL,顯著低于DTX/PLGA的14.06ng/mL(*p<0.05)，說明HA介導的主動靶向作用顯

38、著提高細胞對納米粒子的內吞。小鼠活體熒光成像結果顯示，在尾靜脈注射包載DiR的納米粒子后的2到24h內，DiR/SANPs在腫瘤組織的熒光信號強度顯著高于DiR/PLGA，說明HA修飾的納米粒子對MDA-MB-231腫瘤具有較好的主動靶向性(Figure1.9B)。體內抗腫瘤實驗結果顯示，DTX/SANPs相對于DTX/PLGA顯著提高了腫瘤抑制效果(*p<0.01)(Figure1.9C)。最近，本課題組報道了包載DTX的、表面修飾HA的PLGA納米粒子(DTX-HPLGA),用于原位A549肺癌小鼠的治療。MTT實驗結果顯示，孵育48h后載藥納米粒子(DTX-HPLGA)在CD44過

39、表達的人肺癌A549細胞中的IC50為0.91g/mL。體內生物分布實驗結果顯示DTX-HPLGA在腫瘤部位的富集量達到一個極高的水平，其值為13.7%,是自由DTX富集量的4.4倍。此外，體內抗腫瘤實驗結果顯示，相對于自由DTX，DTX-HPLGA具有顯著提高的腫瘤抑制效果(*p<0.001)，并且顯著延長了小鼠的存活時間，在46天內所有小鼠均健康存活，而DTX組小鼠的中位生存期為34天。Ofganlcsolventw卿F.''jA-b-Figure1.9(A)Theschematicillustrationofthepreparationandcoreshellstr

40、uctureofDTX-loadedPLGA-b-HAnanoparticles.(B)InvivofluorescenceimagesofDiRloadedDiR/PLGAandDiR/SANPsinMDA-MB-231tumor-bearingfemalenudemiceaftertailveininjectionoftheformulations.(C)InvivoantitumoractivityinMDA-MB-231-bearingfemalenudemicetreatedwithvariousformulations.Tumorgrowthcurvesevaluatedbycha

41、ngesintumorvolumeandtheimagesofexcisedtumor.2.4適配子介導的PLGA納米藥物適配子是由單鏈的DNA或者RNA寡聚核酸折疊形成的特殊3D結構，對靶向分子具有高度的特異性和親和性。適配子由于其分子量低、不會引發(fā)免疫原性并且容易制備，成為了靶向成像和治療的優(yōu)選靶向分子。針對癌細胞表面不同的靶點，研究者們制備了多種用于癌癥靶向治療的適配子。如AS1411可以靶向到癌細胞和腫瘤新生血管內皮細胞過表達的核仁蛋白，Chen報道了包載PTX的、AS1411修飾的PEG-PLGA納米粒子(Ap-PTX-NP),用于腦膠質瘤的靶向治療。CLSM實驗熒光定量結果顯示，腦

42、膠質瘤(C6)細胞對Ap-NP的攝取量相對于無AS1411修飾的納米粒子(NP)提高了2倍，當加入過量的適配子對受體進行封閉后，細胞攝取量與NP相當(Figure1.10A)，證明細胞對Ap-NP的攝取主要通過受體介導的方式進行。荷瘤小鼠體內生物分布實驗結果顯示，Ap-PTX-NP在腫瘤組織的富集量隨時間延長逐漸增大，在0.5h達到最大值，隨后開始降低。0.25到25h內，Ap-NP在腫瘤組織的富集量均高于PTX-NP以及Taxol(Figure1.10)。以上實驗結果證明，Ap-NP通過AS1411與受體結合的介導作用顯著提高了細胞對Ap-NP的攝取，實現(xiàn)了高效的細胞內PTX遞送。Yu報道了

43、包載沙利霉素(SAL)的、A15適配子修飾的PLGA納米粒子(Ap-SAL-NP)，用于CD133過表達的骨肉瘤細胞的靶向治療。流式細胞實驗結果顯示，CD133過表達的Saos-2細胞對Ap-NP的攝取量顯著高于無靶向的NP(p<0.05)。MTT實驗結果顯示，孵育48h后Ap-SAL-NP和非靶向組SAL-NP對CD133過表達的Saos-2細胞的增殖抑制作用具有顯著性差異，Ap-SAL-NP的IC50為2.18卩g/mL,相對于SAL-NP低了4.92倍(*p<0.01)。體內治療效果顯示Ap-SAL-NP治療組小鼠腫瘤重量為0.08g，顯著低于SAL-NP組的0.31g以及對

44、照組的0.72g，證明了Ap-SAL-NP相對于無靶向SAL-NP具有顯著提高的體內外抗腫瘤作用。oJOJ7自S54321mpqjlkKidLIWLlA石us居口see色一Ap-NPg-UP*ApIdKJOlFigure1.10(A)QuantitationofcellularassociationofthenanoparticlesinC6gliomacells.Valuesobtainedfrom3000cellsperwell(n=3)andexpressedasmean±SD.*p<0.01,significantlylowerthanthecellularassoci

45、ationofcoumarin-6-loadedAp-NP.(B)PTXconcentrationsinthetumorat0.25,0.5,1,2,6,12and24hafteradministration(n=4).SignificantdifferencesfoundbetweentheAp-PTX-NP/PTX-markedas*p<0.05,*p<0.01,NPandtheTaxolgroups,and0550-5050*p<0.001respectively.2.5小分子介導的PLGA納米藥物近些年來多種具有主動靶向作用的小分子如半乳糖(Gal)、葉酸(FA)、生

46、物素(Biotin)等被用做靶向配體，用于制備主動靶向納米抗癌藥物。這些小分子制備簡便、造價低、毒性小而且其修飾和表征方法相對簡便。Gal與肝癌細胞表面過表達的脫唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)有很強的結合能力，因而被廣泛應用于肝癌主動靶向納米藥物的制備89,90。例如，例如，Duan基于mPEG-PLGA-PLL和mPEG-PLGA-PLL-Gal兩種聚合物，制備的Gal修飾的PEAL-Gal納米粒子可以靶向到肝癌。CLSM實驗結果顯示，三種不同的肝癌細胞(HepG2、Huh7、PLC)對PEAL-Gal的攝取量明顯高于無靶向PEAL。荷瘤小鼠體內成像結果顯示,經尾靜脈注射Cy5標記的PEA

47、L-Gal和PEAL后，在3到48h內,在荷HepG2、Huh7、PLC三種皮下肝癌模型小鼠的腫瘤部位都有明顯的熒光信號，而PEAL-Gal的熒光信號明顯強于PEAL。PEAL在腫瘤組織的熒光信號在12h達到最強，隨后逐漸減弱。PEAL-Gal在腫瘤組織的信號一直保持較高的強度，在48h時仍然具有較高的強度，證明PEAL-Gal對肝癌具有優(yōu)異的體外以及體內靶向性。FA是合成嘌呤和嘧啶的必要物質，其對葉酸受體具有高度的親和力。葉酸受體在癌細胞表面的表達量遠高于正常細胞，大概是正常組織表達量的100-300倍oSun報道了包載PTX和順鉑(CDDP)的、FA修飾的PEG-PLGA納米粒子，用于非小

48、細胞肺癌(M109)的協(xié)同治療。通過細胞實驗，篩選出CDDP和PTX的最佳協(xié)同治療比例為1:2oCCK-8實驗結果顯示，在總藥量是10卩g/mL時，載藥納米粒子與細胞共同孵育24h后，靶向載藥納米粒子Co-FA-NPs(CDDP:PTX=1:2)組細胞存活率僅為10%，而無靶向組Co-NPs(CDDP:PTX=1:2)約為30%。相對于Co-NPs(CDDP:PTX=1:2)，靶向組Co-FA-NPs(CDDP:PTX=1:2)具有顯著提高的抗細胞增殖作用(*p<0.01)o體內抗腫瘤實驗結果顯示，在FA受體低表達的A549皮下腫瘤模型中，經過Co-FA-NPs(CDDP:PTX=1:2

49、胎療后，腫瘤抑制率(TSR)為89.96%,對于FA高表達的M109腫瘤，其TSR為95.03%。在M109皮下腫瘤模型中，相對于Co-NPs(CDDP:PTX=1:2)，靶向Co-FA-NPs(CDDP:PTX=1:2)表現(xiàn)出顯著提高的抗腫瘤效果(*p<0.05)oBiotin是合成維生素C的必要物質，是一種細胞生長促進劑，生物素受體(biotinreceptor)在快速增殖的癌細胞表面有過表達。Zhang制備了包載表阿霉素(EPB)的、biotin修飾的基于Chitosan-PLGA的納米粒子(Bio-CS-PLGA/EPB),用于乳腺癌MCF-7細胞的靶向遞送。CLSM熒光圖片顯示

50、，MCF-7細胞中Bio-CS-PLGA/EPB的熒光信號強度明顯高于CS-PLGA/EPB。流式細胞實驗結果顯示，MCF-7細胞對Bio-CS-PLGA/EPB的內吞量是CS-PLGA/EPB的2倍。包載Cy5.5的納米粒子在荷MCF-7腫瘤的小鼠體內的熒光成像結果顯示，Bio-CS-PLGA在腫瘤組織的富集量明顯高于CS-PLGAo3生物信號刺激響應性性PLGA納米抗癌藥物近些年來，生物響應性聚合物納米藥物，因其能夠在靶點位置提高細胞的藥物攝取量或者觸發(fā)藥物快速釋放而引起人們越來越多的關注。腫瘤組織微環(huán)境以及腫瘤細胞內有很多特點，例如，腫瘤組織呈弱酸性并存在較高的酶含量，腫瘤細胞內內涵體以

51、及溶酶體內pH低、細胞質和細胞核內GSH含量高以及線粒體內活性氧(ROS)含量高等。生物響應性的納米體系具有一些獨特的特征，如不需要借助外部設備來實施刺激，通過被動或主動靶向作用富集在腫瘤組織后、能精確控制其在腫瘤組織或細胞器中的局部響應行為，而且能夠在腫瘤組織或者腫瘤細胞內部實現(xiàn)自發(fā)響應等。用1啊廣ITurrmrTksu電Eiirm1Cvtaio'pHS-7.1無1亍衽赳*aritytnnTunnerCellFigure1.11Illustrationofbiosignalsexistinginthetumorextracellularmicroenvironmentsandcanc

52、erouscells.腫瘤組織細胞外微環(huán)境以及腫瘤細胞內部環(huán)境與正常組織的微環(huán)境不同如：(1)腫瘤組織具有弱酸性(pH6.5-7.2)；(2)腫瘤組織具有高濃度的酶如基質金屬蛋白酶(MMP)等；(3)內涵體(pH5.5-6.8)和溶酶體(pH4.5-5.5)pH值低；(4)細胞質和細胞核內具有較高濃度的GSH(2-10mM)；(5)溶酶體中存在大量的降解酶；(6)線粒體內存在較高濃度的ROS等(Figure1.11)。近些年來，研究者們基于腫瘤微環(huán)境和細胞內環(huán)境設計了多種具有生物響應性的PLGA納米藥物，主要包括還原響應性PLGA納米抗癌藥物、pH響應性PLGA納米抗癌藥物以及酶響應性PLGA

53、納米抗癌藥物。3.1還原響應性性PLGA納米藥物細胞質和細胞核中較強的還原環(huán)境，一方面是由于GSH的存在引起的，另一方面在溶酶體中還存在溶酶體硫醇還原酶(GILT)和少量的Fe2+。GSH是體內含量最豐富的低分子量生物還原劑，通過NADPH和GSH還原酶維持其還原性。相對于正常細胞，腫瘤細胞質和細胞核內GSH濃度更高，大約為2-10mM,比血液中GSH的濃度高10-1000倍。研究者們利用細胞內外高GSH濃度差，設計制備了具有還原響應性的納米抗癌藥物，實現(xiàn)藥物在細胞內的快速響應釋放。還原響應性納米載體通常都含有雙硫鍵，雙硫鍵在細胞外能夠穩(wěn)定的存在，而在細胞內高濃度GSH作用下快速發(fā)生斷裂，將疏

54、水的雙硫鍵轉變?yōu)橛H水性的巰基，破壞納米載體的結構，進而實現(xiàn)藥物在細胞內的GSH觸發(fā)性釋放。文獻報道的基于PLGA的還原敏感納米載體的設計有兩種途徑，一種是通過含有雙硫鍵的基于PLGA的兩親性聚合物自組裝得到；另一種是以PLGA作為內核，通過引入含有雙硫鍵的乳化劑制備得到的。例如，Luan制備了一種含有雙硫鍵的偶聯(lián)DTX的聚合物前藥mPEG-PLGA-SS-DTX，這種兩親性的聚合物前藥經過自組裝形成含有雙硫鍵的膠束(PP-SS-DTX)，同時包載自由DTX(Figure1.12A)。在正常生理條件下，PP-SS-DTX/DTX對DTX的釋放量在12h后達到一個飽和平衡，96h后其累計釋放量仍不

55、到40%。而在模擬細胞內還原環(huán)境條件下(10mMDTT)，DTX的釋放量隨時間延長逐漸增多，在48h累計釋放量為60%。MTT結果顯示，在MCF-7細胞中，孵育24h后，PP-SS-DTX/DTX的IC50為0.83卩g/mL,比自由DTX低了10.77倍，這與PP-SS-DTX/DTX能夠快速將DTX釋放到細胞質中高效地抑制細胞的增殖有關，其與DTT和GSH的作用過程如Figure1.12B所示。Chen報道了基于甘草次酸(GA)修飾的嵌段聚合物(GA-PEG-SS-PLGA)自組裝形成還原敏感膠束，包載丹參酮IIA(TANIIA),用于肝細胞癌的靶向治療。GA-PEG-SS-PLGA膠束在

56、含有10mMDTT的介質中，經過12h納米粒子溶脹，粒徑逐漸增大，24h后納米粒子發(fā)生團聚。在不含DTT的介質中，其粒徑在24h后未發(fā)生任何變化。對于不含雙硫鍵的GA-PEG-PLGA膠束，即使在含有10mMDTT的介質中經過了24h，其粒徑也沒有發(fā)生變化。體外釋放實驗結果顯示，在含有10mMDTT的介質中，經過24h后，GA-PEG-SS-PLGA對TANIIA的累計釋放量為60%，是在不含DTT的介質中釋放量的3倍。而非還原敏感對照組PEG-PLGA膠束，其對藥物的釋放行為并沒有受到DTT的影響，24h內的累積藥物釋放量不足20%。以上結果證明，含有雙硫鍵的GA-PEG-SS-PLGA膠束

57、在正常生理條件下保持較高的穩(wěn)定性而在還原環(huán)境中能夠更快更多地將藥物釋放出來。此外Sun報道了基于HA-聚乙烯亞胺(PEISS)-PLGA嵌段共聚物的納米粒子(HPRPSP),用于DTX和siRNA的細胞內協(xié)同遞送，由于中間段含有雙硫鍵，使得HPRPSP具有還原敏感性。體內成像結果顯示，Dir標記的HPRPSP在腫瘤組織的富集量在2、4、8h時均高于非還原組(HPP),8h后的離體器官熒光成像結果顯示，HPRPSP在腫瘤組織的熒光強度也明顯高于HPP,熒光定量結果顯示HPRPSP在腫瘤組織的富集量是HPP的1.5倍，證明還原敏感納米粒子相對于非還原敏感對照組能夠更快地將藥物釋放出來。HLB.Tu

58、incrrTraofWhRILd*Suf-a«»inblemFEC-PI1-111*ruc0KF.TctiKXd胡f_/p嚴1丁曲j%_J鹽蟲h5t-K|Figure1.12Micelleformation(A)anddisulfidecleavageprocessbyDTTorGSH(B).R1andR2representformPEG-PLGAandDTX,respectively.通過引入含有雙硫鍵的乳化劑也可以制備還原敏感PLGA納米載體。例如，Huang基于含有雙硫鍵的mPEG-S-S-C16、Lecitin和PLGA三種聚合物制備了具有還原響應性的納米粒子(LP

59、NPs)(Figure1.13),用于DOX和雷公藤內酯(TPL)的協(xié)同細胞內遞送。將PLGA和DOX以及TPL同時溶解在DMF中，室溫攪拌2h后，將其滴加到mPEG-S-S-C16和Lecitin的乙醇溶液中，透析后得到具有還原敏感性的、以PLGA為核、包載DOX/TPL的納米藥物(DOX/TPL-LPNPs)。體外釋放實驗顯示，在含有10mMDTT的介質中，經過48h接近78%的DOX從DOX/TPL-LPNPs中釋放出來。在同樣條件下，TPL的釋放行為與DOX一致。Botella將含雙硫鍵的雙三乙氧基硅烷(TESPDS)包被到PLGA的表面，制備了具有還原敏感性的納米粒子(POSN-2)，經還原劑DTT刺激后可以快速釋放包載在納米粒子內部的分子，制備過程如Figure1.14A所示。體外釋放實驗顯示，在未加還原劑DT