(整理)6種方法測定蛋白質(zhì)含量.

1、6種方法測定蛋白質(zhì)含量一、微量凱氏（kjeldahl）定氮法樣品與濃硫酸共熱。含氮有機物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：NH2CH2COOH+3H2SO42CO2+3SO2+4H2O+NH32NH3+H2SO4一一（NH4bSO4（2）（NH4）2SO4+2NaOH2H2O+Na2SO4+2NH3（3）反應(yīng)（1）、（2）在凱氏瓶內(nèi)完成，反應(yīng)（3）在凱氏蒸餾裝置中進行。為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，k2so4以提高溶液的沸點。收集氨可用硼酸溶液，

2、滴定則用強酸。實驗和計算方法這里從略。計算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以625即得。二、雙縮脲法（biuret法）（一）實驗原理雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經(jīng)180C左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為1-10m

3、g蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。（二）試劑與器材1.試劑：（1）標準蛋白質(zhì)溶液：用標準的結(jié)晶牛血清清蛋白（bsa）或標準酪蛋白，配制成10mg/ml的標準蛋白溶液，可用bsa濃度1mg/ml的a280為0.66來校正其純度。如有需要，標準蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標準蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCI配制，酪蛋白用0.05NaOH配

4、制。（2）雙縮脲試劑:稱以1.50克硫酸銅（CuSO45H2O）和6.0克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O64H2O）,用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10%NaOH溶液，用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。2.器材：可見光分光光度計、大試管15支、旋渦混合器等。（三）操作方法1.標準曲線的測定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標準蛋白質(zhì)溶液，用水補足到1毫升，然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（2025C）下放置30分鐘，于540nm處進行比色測定。用未

5、加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標，光吸收值為縱座標繪制標準曲線。2、樣品的測定：取23個試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。三、folin酚試劑法（lowry法）（一）實驗原理這種蛋白質(zhì)測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在已可以訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即folin酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中

6、的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。folin酚試劑中的磷鉬酸鹽一磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。folin酚試劑法最早由lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個測定法的優(yōu)點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾lowry反應(yīng)。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5

7、%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會色淺，則必須提高碳酸鈉氫氧化鈉溶液的濃度12倍。進行測定時，加folin一酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性ph條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在ph=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)folin一酚試劑加到堿性的銅一蛋白質(zhì)溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸一磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達5m

8、g。通常測定范圍是20250mg。二)試劑與器材1.試劑(1)試劑甲：(a) 10克Na2CO3,2克NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O64H2O)。溶解于500毫升蒸餾水中。(b) 0.5克硫酸銅(CuSO45H2O)溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份(a)與1份(b)混合，即為試劑甲。(2) 試劑乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉(Na2WO42H2O),25克鉬酸鈉(Na2MOO42H2O)及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時，回流結(jié)束時，加入150克硫酸鋰(Li2SO4)，50毫升蒸餾水

9、及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色(如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟)。稀釋至1升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標準NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1n左右。(3) 標準蛋白質(zhì)溶液：精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白或g球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9%NaCI溶液。2.器材（1）可見光分光光度計（2）旋渦混合器（3）秒表（4）試管16支（三）操作方法1.標準曲線的測定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0,0.1,0.2,

10、0.4,0.6,0.8,1.0毫升標準蛋白質(zhì)溶液（濃度為250mg/ml）。用水補足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（2025C）放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙（folin酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照，于700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標,吸光度值為縱座標,繪制出標準曲線。注意：因lowry反應(yīng)的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開始計時，1分鐘后，第2支試管加入5毫升

11、試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開始測定光吸收。每分鐘測一個樣品。進行多試管操作時，為了防止出錯，每位學(xué)生都必須在實驗記錄本上預(yù)先畫好下面的表格。表中是每個試管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計算出的每管中蛋白質(zhì)的量（微克）和測得的吸光度值。folin酚試劑法實驗表管號12345678910標準蛋白質(zhì)00.10.20.40.60.81.0（250mg/m

12、l）未知蛋白質(zhì)0.20.40.6（約250mg/ml）蒸餾水1.00.90.80.60.40.200.80.60.4試劑甲5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0試劑乙0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5每管中蛋白質(zhì)的量（mg）吸光度值（a700）2.樣品的測定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì)20250微克），按上述方法進行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也可與標準曲線的測定放在一起，同時進行。即在標準曲線測定的各試管后面，再增加3個試管。如上表中的8、9、10試管。根據(jù)所測樣品的吸光度值，在標準曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從

13、而計算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。注意:由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質(zhì)的相對濃度（相對于標準蛋白質(zhì)）。四、改良的簡易folin酚試劑法（一）試劑1試劑甲：堿性銅試劑溶液中，含0.5nNaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸鉀和0.05%硫酸銅，配制時注意硫酸銅用少量蒸餾水溶解后，最后加入。2. 試劑乙：與前面的基本法相同。臨用時加蒸餾水稀釋8倍。3. 標準蛋白質(zhì)溶液：同基本法。（二）操作步驟測定標準曲線與樣品溶液的操作方法與基本法相同。只是試劑甲改為1毫升，室溫放置10分鐘后，試劑乙改為4毫升。在55C恒溫水浴

14、中保溫5分鐘。用流動水冷卻后，在660nm下測定其吸光度值。改良的快速簡易法，可獲得與folin酚試劑法（即lowry基本法）相接近的結(jié)果。五、考馬斯亮蘭法（bradford法）（一）實驗原理雙縮脲法（biuret法）和folin酚試劑法（lowry法）的明顯缺點和許多限制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測定的方法。1976年由bradford建立的考馬斯亮蘭法（bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法?？捡R斯亮蘭g-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料

15、的最大吸收峰的位置（Imax），由465nm變?yōu)?95nm,溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測定的吸光度值a595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。bradford法的突出優(yōu)點是：（1）靈敏度高，據(jù)估計比lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達1mg。這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比lowry法要大的多。（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完

16、成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。（3）干擾物質(zhì)少。如干擾lowry法的k+、Na+、mg2+離子、tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、edta等均不干擾此測定法。此法的缺點是：（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用g球蛋白為標準蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、tritonx-100、十二烷基硫酸鈉（sds）和0.1n的NaOH。（如同0.1

17、n的酸干擾lowary法一樣）。（3）標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。(二)試劑與器材1.試劑：(1) 標準蛋白質(zhì)溶液，用g球蛋白或牛血清清蛋白(bsa),配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標準蛋白質(zhì)溶液。(2) 考馬斯亮蘭g250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭g250,溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀釋至1升。2.器材：(1)可見光分光光度計(2)旋渦混合器(3) 試管16支(三) 操作方法1.標準方法(1) 取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分別

18、加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標準蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無離子水補充到0.1ml。最后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭g250試劑，每加完一管,立即在旋渦混合器上混合(注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除)。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。(2) 加完試劑2-5分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值a595，空白對照為第1號試管，即0.1m卜2O加5.0mlg250試劑。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用

19、少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡?？捡R斯亮蘭法實驗表管號12345678910標準蛋白質(zhì)00.010.020.040.060.080.10（1.0mg/ml）未知蛋白質(zhì)0.020.040.06（約1.0mg/ml）蒸餾水0.10.090.080.060.040.0200.080.060.04考馬斯亮藍g250試劑5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0每管中的蛋白質(zhì)量（mg）光吸收值（a595）（3）用標準蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標，用吸光度值a595為縱座標，作圖，即得到一條標準曲線。由此標準曲線，根據(jù)測出的未知樣品的a595值，即可

20、查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.50。2.微量法當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時（10100mg/ml），可將取樣量（包括補加的水）加大到0.5ml或1.0ml,空白對照則分別為0.5ml或1.0mlH2O,考馬斯亮藍g250試劑仍加5.0ml，同時作相應(yīng)的標準曲線，測定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.29。六、紫外吸收法蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵

21、含量成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進行蛋白質(zhì)含量的測定。紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（nh4）2so4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因為此時只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對值。此法的特點是測定蛋白質(zhì)含量的準確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標準曲線法測定蛋白質(zhì)含量時，對那些與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。核

22、酸的干擾可以通過查校正表，再進行計算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?。但是因為不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外，進行紫外吸收法測定時，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因ph的改變而有變化，因此要注意溶液的ph值，測定樣品時的ph要與測定標準曲線的ph相一致。下面介紹四種紫外吸收法：1.280nm的光吸收法因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。測定時，將待測蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水或緩沖液）作空白對

23、照，在紫外分光度計上直接讀取280nm的吸光度值a280。蛋白質(zhì)濃度可控制在0.11.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標準石英比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液時，a280約為1.0左右。由此可立即計算出蛋白質(zhì)的大致濃度。許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長下的光吸收值（a1%1cm）有文獻數(shù)據(jù)可查，根據(jù)此光吸收值可以較準確地計算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與（a1%1cm）值（即蛋白質(zhì)溶液濃度為1%,光徑為1cm時的光吸收值）的關(guān)系。文獻值a1%1cm,稱為百分吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。蛋白質(zhì)濃度=（a28010）/a1%1cm,280nm（mg/ml）（q1%濃度？10mg/ml）例

24、：牛血清清蛋白：a1%1cm=6.3（280nm）溶菌酶：a1%1cm=22.8（280nm）若查不到待測蛋白質(zhì)的a1%1cm值，則可選用一種與待測蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白質(zhì)作為標準蛋白質(zhì)，用標準曲線法進行測定。標準蛋白質(zhì)溶液配制的濃度為1.0mg/ml。常用的標準蛋白質(zhì)為牛血清清蛋白（bsa）。標準曲線的測定：取6支試管，按下表編號并加入試劑：管號123456bsa（1.0mg/ml）01.02.03.04.05.0H2O5.04.03.02.01.00a280用第1管為空白對照，各管溶液混勻后在紫外分光光度計上測定吸光度a280,以a280為縱座標，各管的蛋白質(zhì)濃度或蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標作圖，標準曲線應(yīng)為直線，利用此標準曲線，根據(jù)測出的未知樣品的a280值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量，也可以用2至6管a280值與相應(yīng)的試管中的蛋白質(zhì)濃度計算出該蛋白質(zhì)的a1%1cm,280nm2.280nm和260nm的吸收差法核酸對紫外光有很強的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強10倍（每克），但核酸在260nm處的吸收更強，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：純蛋白質(zhì)的光吸收比值：a280/a260-1.8純核酸的光吸收比值：a280