Sephadex LH-20

1、葡聚糖凝膠柱使用及注意事項1 SephadexG型葡聚糖凝膠只適合在水中使用，SephadexG-25丙化后就是SephadexLH-20o其既有分子篩作用，在由極性與非極性溶劑組成的溶劑中還有反相層析效果。雖然價位很高，但由于性能頗佳，可再生利用，所以倍受親睞。此外上柱樣品損失很少，對處理小樣品較好，這也是我們實驗室常用的原因之2 SephadexLH20的原理。SephadexLH20的分離原理主要有兩方面：以凝膠過濾作用為主，兼具反相分配的作用（在反相溶劑中）。因為凝膠過濾作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脫下來，小分子的化合物保留強，最后出柱。如果使用反相溶劑洗脫，Sephadex

2、LH20對化合物還起反相分配的作用，所以極性大的化合物保留弱，先被洗脫下來，極性小的化合物保留強，后出柱。如果使用正相溶劑洗脫，這主要靠凝膠過濾作用來分離。3 SephadexLH20洗脫溶劑?？赐甑?點后，就應該清楚SephadexLH20洗脫溶劑因分為兩類：反相和正相兩種。用得最多的是反相溶劑洗脫，以甲醇一一水系統最為常見，先用水，逐漸增加甲醇比例，最后用100%甲醇沖柱。正相系統以氯仿一一甲醇最為常見，先用50%氯仿一一甲醇，逐漸增加甲醇比例，最后用100%甲醇沖柱。4 SephadexLH20樣品的處理和洗脫溶劑的選擇。如果樣品極性大，這選用反相溶劑洗脫（甲醇一一水），樣品用最少體積的

3、甲醇一一水（盡可能甲醇少一些）溶解，過濾后，濕法上樣（一定要濾喔！要是把SephadexLH20堵啦，就得將SephadexLH20的柱頭部分棄去，很心痛呀)。如果樣品極性小，這選用正相溶劑洗脫(氯仿一一甲醇)，樣品用最少體積的氯仿一一甲醇溶解，過濾后，濕法上樣。5 SephadexLH-20的步驟。選擇條件：梯度洗脫在Sephadex使用中并不象在正相柱層析中那么重要。首先你的樣品須要能溶解在盡量少量的洗脫劑中。極性在的用甲醇水系統;極性小者一般用不含水的系統。我們實驗室常用正己烷二氯甲烷甲醇系統，用了很多年，效果較好。(2) 飽和層析柱:用洗脫劑將凝膠搖勻，直立柱身，讓其自然沉降，此時要防

4、止氣泡留在其中。至少半小時打開開關，流出幾個柱體種的洗脫劑，目的是使其膨脹在正確比例的洗脫劑中。(3) 樣品處理:用盡量少的洗脫劑溶解樣品，常壓過濾。(4) 濕法上柱。這也是要有技巧的步驟。洗脫：控制流速，一般ldrop/s以下，可參見廠家的一些參數;必要時更改極性(很多時一個極性就可以將樣品洗脫完畢)。再生以備下次使用。6分離的技巧，最后說說我的使用心得(1) 流速不可太快，切切不可新急，所謂欲速則不達。(2) 柱子盡可能長，SephadexLH20柱長的增加將極大地改善分離，所不要吝惜填料，寧可將填料全裝在一根大柱子中，不要將填料裝成幾根小柱。所謂集中優(yōu)勢兵力，打擊敵人。（3）憎分一定要接

5、的細，可1/10,或1/20個保留體積接成一憎分。（4）洗脫體積一般為23個保留體積，對特殊保留強的化合物，可洗脫5個保留體積。（5）隸質成分死吸附嚴重，如不在乎填料者，可用SephadexLH20分革柔質（6）SephadexLH20對黃酮類成分的分離效果極佳，方法很成型，有大量文獻參考。（7）填料反復使用，每次用完，一般可用甲醇將柱子洗干凈，然后用下一次分離的起步溶劑將甲醇替換出來，待用。SephadexLH-20是由葡聚糖G25疑丙基化加工而成，屬于分子篩凝膠，尤其適用于天然產物在有機溶劑中的純化。例如：類固醇、祜類、脂類以及小分子多肽等，PharmadexLH-20同時適用于分子類別非

6、常相似的物質的分離和工業(yè)規(guī)模的制備，既可用于初步純化步驟，也可用于最終精制步驟，如非對映同分異構體的分離。1 裝柱裝填的重要原則之一就是需要形成一個穩(wěn)定均一的柱床。膠顆粒越均一（粒徑分布越窄）,越容易獲得穩(wěn)定均一的柱床。但是對于SephadexLH-20而言，25100|im的粒徑范圍相對于許多用于制備色譜的填料而言，不能說分布均一，也就是說其粒徑分布較寬。然而當膠溶脹后就相對容易得到均一的柱床。這對于長柱（最高至250cm）而言也是同樣的。在裝柱前，層析柱和儲槽都必須進行徹底的清洗。SephadexLH-20在使用之前必須進行溶脹。在溶脹的過程中，要盡量避免過分攪拌，否則會破壞球形膠粒，且要

7、避免使用磁力攪拌器。在室溫下，將凝膠溶脹于層析溶劑中至少三小時，溶脹后膠體積的大小決定于所使用的溶劑系統，請參考后頁之干膠溶脹表計算特定柱體積所需要干膠的量。使溶脹膠體積沉淀之后占總體積的75%,上層溶劑占25%,這時，懸浮液從一個容器倒入另一容器時膠?？梢苿?。將溶脹后的凝膠根據裝柱要求均勻倒入柱內，在保證膠粒不變形的前提下，應在盡可能高的壓力下裝柱，反壓不要超過1.5bao2 平衡上樣前，用洗脫液平衡層析柱至少兩個柱體積直到基線變得平穩(wěn)為止，如改變溶劑應該注意凝膠在新溶劑中的溶脹性質，并根據性質確定柱高調節(jié)器的位置，如使用相同的溶劑，在以后的層析中柱平衡可以省略。3 洗脫液為確保延長層析柱的

8、使用壽命，所有的緩沖液都應該離心或經過0.45um的膜過濾以除去雜質。4樣品樣品體積應該占柱總體積的2%,同樣在使用之前樣品應該離心或經過0.45um的膜過濾。5 洗脫洗脫流速應根據情況而定，最大線性流速約12cm/min（反壓1.5ba）,建議流速為l-10cm/h?？傮w來說，較低的流速，具有較高的分辯率。6 再生凝膠再生通常是先用23個柱體積的洗脫液進行清洗，如更換洗脫液，則需要重新平衡。7 體積流速與線性流速的關系線性流速=體積流速/橫截面積8 溶脹體積由于SephadexLH-20的溶脹體積依賴于溶劑，所以對于不同直徑的柱可根據比例增加或減少舊柱體積以便計算出新體積。4/9新體積二舊體

9、積X（新柱體積/舊柱體積）9 膠的性質SephadexLH-20同時具備親水和親脂雙重性質，且被分離物質的極性在分離過程中起著重要作用。10.排阻極限4-5KD（與所用溶劑有關）11 .上樣量吸附模式取決于所需分辯率分子量大小小于總體積的20%正相分配小于總體積的1%12 其他膠粒形狀球形，多孔顆粒大?。ǜ桑ㄖ睆剑╊w粒大小中間值（干）70um（直徑）干膠溶漲表溶劑溶脹體積（ml/g干膠）二甲亞硯4.24.4毗噪4.0-4.3水3.8-4.2甲醇3.7-4.2二氯乙烷3.5-4.0丙醇3.4-3.8乙醇3.2-3.6異丙醇3.1-3.5四氫咲喃3.1-3.5甲苯1.5-1.61.Sephade

10、xLH-20簡介疑丙基葡聚糖凝膠LH-20是一種SephadexG-25的疑丙基衍生物，字母LH的含義是這種凝膠骨架在親脂溶劑中或在水溶劑中都能溶脹。在G-25分子中引入疑丙基以代替分子中疑基上的氫，葡聚糖凝膠分子的葡萄糖部分將與耗丙基形成醛鍵連接：R-OHR-O-CH2CH2CH20H與SephadexG相比,SephadexLH-20分了中0H總數雖無改變，但碳原子所占比例卻相對增加了，從而使葡聚糖的親脂性增大。這種凝膠既有親水性，又有親脂性，不僅可在水中應用，也可在極性有機溶劑或它們與水組成的混合溶劑中膨潤使用，如丁醇、氯仿、四氫咲喃、二氧六壞等，應用范圍增大，對黃酮、蔥醍、香豆素等成分

11、也能分離。SephadexLH-20除保留有SephadexG-25原有的分子篩特性，可按分子量大小分離物質外，在有極性與非極性溶劑組成的混合溶劑中常常起到反相分配色譜的效果，適用于不同類型有機物的分離，在天然藥物分離中得到了越來越廣泛的應用。使用注意事項：疑丙基葡聚糖凝膠SephadexLH-20雖然是一種兩性凝膠，但由于在不同溶劑中的溶脹因子各不相同（見表1）,因此在柱中直接更換溶劑是不允許的，床體積在2.5mL/g干膠以下的不能用于GPC分析。這種凝膠在有機溶劑中分離較小分子量的脂溶性化合物是十分有效的。但在使用時不允許有氧化劑存在。再生與保存：SephadexLH-20價格比較昂貴。用

12、過的SephadexLH-20可以反復再生使用，而且柱子的洗脫過程往往就是柱子的再生過程。短期不用時可以水洗T含水醇洗（醇的濃度逐步遞增）9醇洗，最后泡在醇中貯于磨口瓶中備用。如長期不用時，可在以上處理基礎上，減壓抽干，再用少量乙醯洗凈抽干，室溫充分揮散至無醯味后，6080°C干燥后保存。SephadexLH-20不僅具有親水性能，可以吸水膨脹，而且也有一定的親脂性，可以吸收有機溶劑而膨脹。在不同的溶劑中，其色譜特性也不同。表1列舉了它在不同溶劑中浸泡后吸收溶劑而膨脹的體積。表1葡聚糖凝膠LH-20在各種溶劑中的膨脹體積和吸收溶劑的能力溶脹后的體積溶劑吸收率溶劑（mL/g干凝膠）（mL/g干