抗腫瘤藥物藥效學(xué)試驗方法及指導(dǎo)原則

1、抗腫瘤藥物藥效學(xué)實驗方法及指導(dǎo)原則一、基本原則1 .抗月中瘤藥物分類(1)細(xì)胞毒類藥物(cytotoxicagent)：包括干擾核酸和蛋白質(zhì)合成、抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶及作用于微管系統(tǒng)的藥物等；(2)生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(biologicalresponsemodifier)；(3)月中瘤而寸藥逆轉(zhuǎn)齊1J(resistancereversalagent)(4)月中瘤治療增敏劑(oncotherapysensitizer)(5)月中瘤血管生成抑制劑(tumorangiogenesisinhibitor)；(6) 分化誘導(dǎo)齊1J(differentiationinducingagent);生長因子抑制劑(gro

2、wthfactorinhibitor)；(8)反義寡核甘酸(antisenseoligonucleotide)。2 .抗月中瘤藥物藥效學(xué)需研究內(nèi)容2.1 包括體外抗月中瘤試驗，體內(nèi)抗月中瘤試驗。2.2 評價藥物的抗癌活性時，以體內(nèi)試驗結(jié)果為主，同時參考體外試驗結(jié)果以做出正確的結(jié)論。2.3 I類抗月中瘤新藥應(yīng)進行藥物作用機制初步研究。二、體外抗月中瘤活性試驗1 .試驗?zāi)康?.1 對候選化合物進行初步篩選；1.2 了解候選化合物的抗瘤譜；1.3 為隨后進行的體內(nèi)抗月中瘤試驗提供參考，如劑量范圍、月中瘤類別等。2 .試驗方法選用10-15株人癌細(xì)胞株，根據(jù)試驗?zāi)康倪x擇相應(yīng)細(xì)胞系及適量的細(xì)胞接種濃度，

3、按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法進行培養(yǎng)；推薦使用四氮唾鹽MTT還原法、XTT還原法、磺酰羅丹明B(SR染色法、或51Cr釋放試驗、集落形成法等測定藥物的抗癌作用。藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)時間一般為48-72小時，貼壁細(xì)胞需先貼壁24小時后再給藥。試驗應(yīng)設(shè)陽性及陰性對照組，陽性對照用一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗月中瘤藥，陰性對照為溶媒對照。3 .評價標(biāo)準(zhǔn)以同一樣品不同濃度對月中瘤細(xì)胞抑制率作圖可得到劑量效應(yīng)曲線，然后采用Logit法計算半數(shù)有效濃度（IC50值或EC50值）。體外試驗至少重復(fù)一次。附注：評價藥物抗癌活性的方法：1 .MTT還原法1.1 基本原理：四氮口坐MTT,3-（4,5-dimethylibiazol-2-y

4、l）-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide是一種能接受氫原子的染料?；罴?xì)胞線粒體中與NADP相關(guān)的脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)可將黃色的MTT轉(zhuǎn)化成不溶性的藍紫色的甲月替（formazan）,而死的細(xì)胞則無此功能。用二甲基亞諷（DMSO）溶解甲月替后，在一定波長下用酶標(biāo)儀測定光密度值，即可定量測出細(xì)胞的存活率。1.2 操作步驟：1.2.1 選用對數(shù)生長期的貼壁月中瘤細(xì)胞，用胰酶消化后，用含10%小牛血清的RPMIl640培養(yǎng)基配成5000個/ml的細(xì)胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種200晨37C,5%CO2培養(yǎng)24h。1.2.2 實驗組換新的含不同濃度被測樣品的培養(yǎng)基，對照組

5、則換含等體積溶劑的培養(yǎng)基，每組設(shè)35平行孔，37C,5%CO2培養(yǎng)45d。1.2.3 棄去上清液，每孔加入200仙新鮮配制的含0.2mg/mlMTT的無血清培養(yǎng)基.37c繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心棄上清，并加入200履DMSQ用微型超聲振蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀上以試驗波長為570nm,參比波長為450nm測定光密度值。1.3 結(jié)果評定：按下式計算藥物對月中瘤細(xì)胞生長的抑制率：月中瘤細(xì)胞生長抑制率%=（1-OD實驗/OD對照）100%以同一樣品的不同濃度對月中瘤細(xì)胞生長抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線，從中求出樣品的半數(shù)殺傷濃度IC50。合成化合物或植物提取純品的IC5010世m(xù)1或植物粗提物的IC50125

6、%時。視為有效，反之則無效。4.2 裸鼠移植瘤模型推薦使用測量瘤徑的方法，動態(tài)觀察受試物抗月中瘤的效應(yīng)。月中瘤直徑的測量次數(shù)根據(jù)移植瘤的生長情況而定，一般為每周2-3次,每次測量同時還需稱鼠重。月中瘤體積(tumorvolume,TV)的計算公式為：V=1/2aOb2或兀/6XaXbXc其中a、b、c分別表示長寬高。兩公式的相關(guān)性極好，可采用任一公式。根據(jù)測量結(jié)果計算出相對月中瘤體積(relativetumorvolume,RTV),RTV=Vt/V0O其中V0為分籠給藥時(即d0)測量所得月中瘤體積，Vt為每一次測量時的腫瘤體積?？乖轮辛龌钚栽u價指標(biāo)為相對月中瘤增殖率T/C(%)TRTVT/

7、C%=X100%CRTVTRTV:治療組RTV;CRTV:陰性對照組RTV。療效評價標(biāo)準(zhǔn)：T/C%60%為無效；T/C%060%并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理P0.05為有效。4.3 小鼠月中瘤模型生長較慢小鼠月中瘤采用與裸鼠移植瘤同樣的測量瘤徑的評價方法。生長較快小鼠月中瘤可采用稱瘤重的方法評價。試驗結(jié)束后處死動物，稱體重，解剖剝離瘤塊，稱瘤重。陰性對照組月中瘤平均瘤重小于1克，或20%月中瘤重量小于400毫克，表示月中瘤生長不良，試驗作廢。療效評價公式：給藥組平均瘤重-陰性對照組平均瘤重月中瘤生長抑制率=X100%陰性對照組平均瘤重評價標(biāo)準(zhǔn)：月中瘤生長抑制率40%為無效；月中瘤生長抑制率40%并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處

8、理P0.05為有效。4.4 原位接種模型不同原位接種模型可采用不同評價方法，主要有瘤重和生存時間評價法。如肝原位接種可用瘤重評價，顱內(nèi)接種可用生存時間評價。評價方法、標(biāo)準(zhǔn)和注意事項同腹水瘤模型和小鼠月中瘤模型。四、抗月中瘤藥物的特殊要求I類抗月中瘤新藥應(yīng)進行藥物作用機制的初步研究。非細(xì)胞毒類藥物除完成體內(nèi)外抗月中瘤試驗，還應(yīng)進行特定抗月中瘤作用研究。1 .生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑藥效學(xué)包括：體內(nèi)抗癌試驗和免疫功能研究。1.1 體內(nèi)抗癌試驗注意點：模型：裸鼠是免疫缺陷動物，一般應(yīng)用正常免疫鼠月中瘤模型。給藥時間：可按常規(guī)給藥，也可在接種前預(yù)先給藥，接種后繼續(xù)給藥或停藥。105個瘤細(xì)胞/小鼠。M月中瘤細(xì)胞接

9、種量：可比細(xì)胞毒類藥物低一個數(shù)量級，一般為(1-5)給藥方法：可單獨給藥，也可與其它抗月中瘤藥物合并使用，觀察增效或減毒作用。1.2免疫功能試驗方法具有抑瘤作用的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，還需作免疫功能測定，以明確其抑瘤作用是否與免疫功能調(diào)控有關(guān)。免疫功能測定包括細(xì)胞免疫和體液免疫兩方面。免疫功能測定有：(1)巨噬細(xì)胞功能測定(2)天然殺傷細(xì)胞(naturalkillcell)測定(3)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(4) 淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞測定(lymphocyte-activatedkillercell)(5) 各種細(xì)胞因子測定，如IL-2、IL-6、IL-12、IFN-丫TNF-a等。(6)遲發(fā)型超敏反應(yīng)檢

10、測2 .月中瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑2.1 體外抗耐藥活性試驗選才?2-3對月中瘤耐藥/敏感細(xì)胞株，采用MTT法或SRB法測定細(xì)胞毒性。一般在無毒劑量或相當(dāng)于IC10的劑量下設(shè)三個劑量，并設(shè)立相應(yīng)的陽性和陰性對照組。評價逆轉(zhuǎn)效果用逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(foldreversal,FR)表示：FR=IC50(不加逆轉(zhuǎn)劑)/IC50(加逆轉(zhuǎn)劑)。注意的方面：耐藥株的耐藥性：耐藥株因傳代，尤其是撤藥后耐藥性可改變或消失；試驗前必須對試驗?zāi)退幹赀M行耐藥倍數(shù)(FR)測定，確保試驗的可靠性。若非逆轉(zhuǎn)多藥耐藥(MDR)而是逆轉(zhuǎn)單藥耐藥，則實驗的瘤株中需有針對該藥的耐藥細(xì)胞株。陽性對照藥建議采用維拉帕米(verapamil)10環(huán)抱菌

11、素A(cyclosporinA)3的M2.2 體內(nèi)抗月中瘤耐藥活性試驗小鼠敏感和對應(yīng)的耐藥月中瘤和人癌裸鼠敏感和對應(yīng)的耐藥移植瘤2.3 耐藥基因及其表達產(chǎn)物測定可測定月中瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度變化和耐藥基因及其表達產(chǎn)物，初步明確其逆轉(zhuǎn)耐藥機制。包括多藥耐藥基因及其編碼蛋白(multidrugresistancegene/p-glycoprotein,Mdr1/Pgp)、多藥而寸藥相關(guān)蛋白(multidrugresistance-relatedprotein,MRP)、肺耐藥相關(guān)蛋白(lungresistance-relatedprotein,LRP)其它與耐藥相關(guān)的基因/蛋白及酶等。3 .抗月中瘤

12、轉(zhuǎn)移藥物月中瘤是否轉(zhuǎn)移不僅依賴于月中瘤細(xì)胞本身具有的內(nèi)在轉(zhuǎn)移潛能，而且也取決于機體抗轉(zhuǎn)移因素的消長。所以，抗轉(zhuǎn)移藥物只有在動物體內(nèi)模型上才能得出符合實際的結(jié)果。3.1 體外試驗測定候選化合物作用下月中瘤細(xì)胞對基底膜的侵襲、粘附和月中瘤細(xì)胞趨化性運動的能力。3.2 體內(nèi)試驗3.2.1 模型：小鼠B16黑色素瘤、小鼠Lewis肺癌等和人癌裸鼠移植高轉(zhuǎn)移瘤模型。3.2.2 接種方法：常用靜脈注射方法，也可用皮下接種等方法。3.2.3 評價指標(biāo)接種給藥后，觀察記錄動物死亡時間，計算生存天數(shù)。試驗結(jié)束后，稱動物體重、肺重、移植瘤重，解剖顯微鏡下計數(shù)肺轉(zhuǎn)移瘤灶、測瘤徑(計算肺轉(zhuǎn)移瘤體積)和病理組織學(xué)切片觀

13、察等；計算轉(zhuǎn)移率轉(zhuǎn)移抑制率=1-(治療組轉(zhuǎn)移率/對照組轉(zhuǎn)移率)M00%。4 .月中瘤血管生成抑制劑4.1 體外試驗體外試驗?zāi)Ｐ陀校?1)人血管內(nèi)皮細(xì)胞模型：人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞和人微血管(肺、皮膚等)內(nèi)皮細(xì)胞。(2)血管形成促進因子等刺激細(xì)胞DNA合成、增殖、遷移、血管形成(tubeformation)來觀察藥物的抗血管形成作用。如血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)或堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)(3)月中瘤細(xì)胞模型：主要應(yīng)用國內(nèi)已建立的人實體癌細(xì)胞系，確定VEGF、FGF等高

14、分泌的細(xì)胞株。檢測細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移能力及血管形成因子的基因表達狀況來評價藥物。4.2 體內(nèi)試驗4.2.1 血管抑制試驗經(jīng)典的血管形成評價方法有：雞絨毛膜尿囊和卵黃膜囊(CAM)、嚙齒動物虹膜和角膜等。也可用如皮下移植塑料或多孔的polytetrafluoroethylene管、皮下移植無菌的海綿；一些自然的或化學(xué)修飾的物質(zhì)如Matrigel和纖維凝膠等用于體內(nèi)模型。4.2.2 抗月中瘤試驗通過觀察新生血管生成抑制劑的體內(nèi)抗月中瘤效應(yīng)檢測移植瘤的血管密度、血管生成因子和抑制因子的分泌和表達，以及月中瘤的轉(zhuǎn)移情況等綜合評價月中瘤血管生成抑制劑的作用和作用機制。5 .分化誘導(dǎo)劑分化誘導(dǎo)劑的藥效學(xué)研究包

15、括體外和體內(nèi)研究模型；目前的藥物主要能對急性白血病進行有效的分化治療。陽性對照藥選用維甲酸類(retinoid)化合物。5.1 體外試驗5.1.1 白血病的分化誘導(dǎo)常用的細(xì)胞株有人急性早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60、NB4細(xì)胞、人紅白血病K562細(xì)胞等?？蛇x擇以下試驗方法研究并判斷結(jié)果：(1)四唾氮藍(NBT)還原試驗：對照組細(xì)胞的還原能力010%候選化合物的還原能力50%(2)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：可在光學(xué)顯微鏡與電鏡下觀察候選化合物作用后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，對照組的早幼粒細(xì)胞應(yīng)90%-95%,候選化合物組細(xì)胞分化，成熟粒細(xì)胞占比例越高，說明該化合物的分化效果越好。5.1.2 實體瘤細(xì)胞的分化誘導(dǎo)常用細(xì)胞株：人肝癌HepG2、SMMC7721試驗方法及評價標(biāo)準(zhǔn)：主要測定細(xì)胞的甲胎蛋白（AFP）、白蛋白含量，下谷氨酸轉(zhuǎn)移酶（-GT）、酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶（TAT）活性及觀察細(xì)胞形態(tài)。分化細(xì)胞AFP含量、TAT和yGT活性明顯降低，白蛋白含量增加，細(xì)胞胞質(zhì)增加、核縮小。5.2 體內(nèi)試驗常用人癌細(xì)胞小鼠腎囊膜下移植試驗、小鼠髓單核細(xì)胞白血病試驗和人癌細(xì)胞裸小鼠移植瘤模型等?？蛇x兩種模型，根據(jù)月中瘤鼠生存時間、月中瘤的體積及形態(tài)變化，觀察分化誘導(dǎo)效果。重復(fù)試驗一次。6 .月中瘤治療增敏劑增敏劑主要是指放射治療增敏劑，能