植物內(nèi)生菌的分離

1、植物內(nèi)生菌的分離錢昆121140041一、實驗?zāi)康?、掌握對植物內(nèi)生菌的分離處理方法。2、熟練掌握對細菌、真菌的染色觀察技術(shù)。3、了解微生物分子實驗的基本操作流程。二、實驗原理在植物的生態(tài)環(huán)境中，存在著各種各樣的微生物，它們有的附著于植物的表面，有的則生活于植物體內(nèi)。對于附著于植物表面和根際的微生物已有很多研究，而對于植物體內(nèi)微生物的研究卻剛剛起步。但有資料顯示，一些植物內(nèi)生微生物與宿主發(fā)生關(guān)系時，可明顯增強宿主的抗病性，提高植物的生產(chǎn)力。因此，合理利用植物的內(nèi)生微生物具有重要的理論意義和實用價值。植物內(nèi)生菌作為微生物研究領(lǐng)域之一，近年來一直備受關(guān)注。內(nèi)生菌概念在1866年首先由Bary提出的

2、，指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的組織或器官內(nèi)部的微生物（主要為真菌和細菌）。其后的很長時間內(nèi)，內(nèi)生菌研究進展緩慢。直到1993年，美國蒙大拿州立大學Strobel等從短葉紅豆杉的韌皮部位分離到一株產(chǎn)新型抗癌物質(zhì)紫杉醇的內(nèi)生真菌，從而啟發(fā)人們可從植物內(nèi)生菌尋找與植物產(chǎn)生的相同或相似的化合物，由此促進了植物內(nèi)生菌的研究。植物內(nèi)生菌為植物組織內(nèi)的正常菌群，包括植物內(nèi)生真菌、內(nèi)生細菌和內(nèi)生放線菌，廣泛分布于各種陸生及水生的低等植物和高等植物中。內(nèi)生真菌是在宿主植物的莖和葉內(nèi)生存并完成生活周期的真菌。這類真菌中，有許多種類很少形成抱子，或者在宿生植物上形成抱子（或者抱子果），不容易

3、識別。真菌感染植物組織，菌絲存在于細胞內(nèi)和細胞間。與病原菌不同，這些真菌對宿主植物幾乎沒有害處，它們和植物之間或者是相互依存的共生關(guān)系，或者是不太密切的共生關(guān)系。對于現(xiàn)已分離得到的植物內(nèi)生細菌，一般可分為專性內(nèi)生細菌與兼性內(nèi)生細菌，前者指至今只能在植物體內(nèi)分離得到的細菌；后者指能在植物根際與土壤中分離得到，也能在植物體內(nèi)分離得到的細菌，而且種類居多。根據(jù)內(nèi)生細菌對宿主植物生長發(fā)育的影響可以將其分成三類：第一類對植物的作用是中性的，即尚未發(fā)現(xiàn)它們的內(nèi)生定殖對宿主植物生長與繁殖有影響；第二類對植物生長發(fā)育有促進作用，如能提高宿主植物抗病、抗逆能力，或能通過固氮與分泌激素促進植物生長發(fā)育等；第三類對

4、植物生長具有負面影響，在特別條件下接種到原宿主植物或另外的宿主植物會誘發(fā)植物病害。但需要注意的是，同種細菌定殖于不同宿主植物可能對宿主植物產(chǎn)生不同的影響。除根瘤菌外，還有放線菌侵入多種被子植物宿主，形成根瘤的共生固氮體系。早在十九世紀后期，人們就發(fā)現(xiàn)了這類非豆科的根瘤，并發(fā)現(xiàn)根瘤內(nèi)有生微生物，1881年布隆科斯特將它稱為Frankia,但當時并不知道它是什么微生物。確定內(nèi)生菌是放線菌，將它分離出來，在人工培養(yǎng)上獲得純培養(yǎng)，并回接成功，則是='1978年卡拉漢姆在楊梅科香蕨木上首次證實的。內(nèi)生菌在植物體中的生物量是很微少的，但植物內(nèi)生菌作為植物微生態(tài)系統(tǒng)中的天然組成部分，可以通過自身的代

5、謝產(chǎn)物或借助信號傳導作用對宿主產(chǎn)生影響?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌對宿主植物至少有以下幾個方面的有益作用：固氮作用、促進宿主植物生長、抗逆境、抗病原真菌和細菌以及他感作用等。三、實驗器材實驗器材：植物葉片（如冬青葉等）、燒杯（6個）、銀子、剪刀、接種環(huán)、酒精燈、滅菌鍋、光學顯微鏡、載玻片、培養(yǎng)皿、錐形瓶、PCR擴增儀、電泳槽、凝膠槽、梳子、移液槍、微離心管等；實驗試劑：75%酒精、1%次氯酸鈉溶液、無菌水、結(jié)晶紫染液、蕃紅染液、碘液、95%酉精、緩沖液、瓊脂糖等。四、方法與步驟1、培養(yǎng)基的配置需要準備3種培養(yǎng)基即牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細菌、PDA培養(yǎng)基用于培養(yǎng)真菌、高氏培養(yǎng)基用于培養(yǎng)放線菌，每種培養(yǎng)基

6、設(shè)置2次重復(fù)，即共配置6個培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配方及簡單的操作流程：牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基：配方：牛肉膏0.6g、蛋白陳2g、NaCl1g、瓊月旨4g、水200ml、pH7.4-7.6操作流程：依次稱取牛肉膏、蛋白陳、NaCl放入燒杯中，熱水溶解一加入瓊脂，熱水融化，融化后加水至所需體積一調(diào)pHPDA®養(yǎng)基：配方：馬鈴薯40g、蔗糖3g、瓊脂4g、水200ml（自然pH）操作流程：加入馬鈴薯粉末，溶解一加入瓊脂，熱水融化一加入葡萄糖，攪拌均勻一稍冷卻后，加水至所需體積高氏培養(yǎng)基：配方：可溶性淀粉4g、NaCl0.1g、KNO0.2g、K2HPO0.1g、MgSO0.1g、FeSO2mg重銘酸鉀

7、10mg瓊脂4g、水200ml操作流程：熱水溶解淀粉一依次加入各無機試劑一混勻后加入瓊脂，熱水溶解一補充水分至所需體積一調(diào)pH至7.4-7.6由于實際操作時有配置好的培養(yǎng)基固體粉末，所以將各種培養(yǎng)基粉末計算好質(zhì)量后，稱取并用定量自來水溶于錐形瓶中，混勻，編號，放入滅菌鍋中滅菌消毒，消毒完畢使培養(yǎng)液稍加冷卻后，倒平板，靜置使培養(yǎng)基凝固。2、植物葉片內(nèi)生菌的分離（1）采集新鮮植物葉片，要求葉片上無菌斑，帶回實驗室后洗凈、稍晾干；（2）將葉片剪成大塊（去掉葉柄，可將葉片沿主葉脈剪開成兩大塊），稍加修剪,使葉片能水平放入小燒杯中；（3）準備六個干凈燒杯，取三個倒入冷卻后的無菌水，另外取兩個倒入75%酒

8、精，最后一個倒入1%次氯酸鈉溶液。將處理后的葉片依次用75%酒精浸泡1min、1%次氯酸鈉浸泡10-15min、75%酒精浸泡1min（不斷攪動），然后在三個盛有無菌水的燒杯中依次浸洗，取出葉片，用無菌濾紙吸干水分；（4）葉片稍晾干后，將其剪為1cm2大小的小片，周圍均要有切口，在酒精燈旁用消毒后的銀子將小葉片放入培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放5片，放好后標記；（5）將培養(yǎng)皿置于28c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周，一周后取出觀察是否有菌落從植物材料切口內(nèi)長出至培養(yǎng)基上，并對細菌轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)斜面，編號記錄，繼續(xù)進行分離。3、內(nèi)生菌形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察（1）細菌觀察革蘭氏染色革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個步驟

9、，具體操作方法是：a）涂片固定。b）草酸俊結(jié)晶紫染1分鐘。c）自來水沖洗。d）加碘液覆蓋涂面染約1分鐘。e）水洗，用吸水紙吸去水分。f）加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進行脫色，20秒后水洗，吸去水分。g）蕃紅染色液（稀）染3到5分鐘后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。（2）真菌、放線菌觀察用解剖針或接種環(huán)挑取少量菌落涂于載玻片上，或用膠帶在菌落上粘取少量菌絲于載玻片上，再放在顯微鏡下觀察。4、PCR擴增將下列物質(zhì)加入微離心管中：Taq0.5小10XPCRbuffer5仙、1dNTP1仙、1TE104引物11P、1引物21小、1水6.5口操作時先加入TE溶液，然后用消毒的接種針挑取少量待擴增菌溶于其中，再

10、加入其它物質(zhì)。加完后混勻，放入PCR擴增儀中。5、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠的制備：用1XTAE緩沖液配制質(zhì)量濃度為0.1g/L的瓊脂糖凝膠，加EB至終濃度為0.5pg/mLo凝膠板的制備：放置梳子，趁熱倒膠，使其自然凝固。樣品的制備：選取樣品并加入1/5體積澳酚藍溶液。加樣：加樣端為負極（黑）電泳：10V/cm電泳40min。觀察：紫外燈下觀察，照相。五、實驗結(jié)果最終從葉片中分離出5種細菌、2種真菌，沒有分離到放線菌細菌革蘭氏染色觀察結(jié)果：1、形成的菌菌體呈短棒狀或桿狀，革蘭氏染色呈陽性，可以觀察到芽抱結(jié)構(gòu),落呈暗黃色。從第一次分離的較大葉片中得到2、菌體呈桿狀，為革蘭氏陰性菌，菌落呈淡黃色。

11、從視野中看到有少量陽性菌及芽抱存在，可能是由于培養(yǎng)或挑取菌時污染所致。從第二次分離的冬青葉片中得到。3、菌體呈球狀，比觀察到的其他球菌小，革蘭氏陰性菌，菌落呈橙色。從第次分離的較大葉片中得到。4、菌體呈球形，革蘭氏陰性菌，菌落呈黃色。從第二次分離的冬青葉片中得到5、菌體呈球形，革蘭氏陽性菌，菌落白色偏黃。從第一次分離的較大葉片中得到真菌觀察1、第一次分離得到的真菌菌絲（40倍物鏡觀察）：2、第二次從冬青葉中分離到的優(yōu)勢真菌菌落:挑取菌絲觀察（40倍物鏡觀察）：2013-12-2615:47局部放大:膠帶粘附抱子觀察（40倍物鏡觀察）：瓊脂糖凝膠電泳六、問題討論及注意事項1、采摘葉片時要盡量選擇

12、沒有菌斑的健康葉片，盡量不要選擇新生葉片，雖然幾乎沒有菌斑但內(nèi)生菌數(shù)量較少，不易分離。2、倒平板前培養(yǎng)液應(yīng)先冷卻至50度左右，如果倒平板時溫度過高會產(chǎn)生較多水汽，尤其在放線菌培養(yǎng)過程中要控制培養(yǎng)皿內(nèi)的濕度，濕度過高不利于放線菌的生長。倒平板時溫度過高產(chǎn)生水汽較多，使得濕度較大可能是放線菌沒有長出的原因之一。3、用酒精和次氯酸鈉進行消毒時間不宜過長，如果時間過長容易造成葉片失活，內(nèi)生菌同樣被滅活。第一次進行分離時可能由于消毒時間過長，在培養(yǎng)時部分葉片已經(jīng)完全發(fā)黑。4、將葉片剪成小塊后要保證四面均有缺口，并且已剪掉消毒后產(chǎn)生的黑邊，而且不能再用水清洗，以免內(nèi)生菌流失。5、操作過程盡量做到無菌操作，避免空氣中的雜菌進入培養(yǎng)皿。第一次分離過程中污染較嚴重，大部分培養(yǎng)基都有霉菌長出，結(jié)果使得污染較嚴重的培養(yǎng)基無法繼續(xù)培養(yǎng)。6、細菌染色過程中，如果需要挑取得菌落周圍有其他菌落，要小心操作避免沾染其他細菌，否則會使染色結(jié)果中無法分辨出哪些是目標菌。7、PCR操作過程中，微離心管中加入TE溶液再加樣品時，所挑菌量不宜過多，避免在擴增后的溶液中產(chǎn)生沉淀。8、分離真菌時由于優(yōu)勢菌落形成而抑制了其他真菌的生長，使