血清γ球蛋白的分離純化與鑒定PPT學習教案

1、會計學1第1頁/共33頁-球蛋白幾乎在所有肝膽疾病時都增高。肝硬化。重型肝炎時，球蛋白可明顯升高，甚至可達到2.5g/L-3g/L。如果球蛋白增至正常的2倍以上，伴轉氨酶在正常值5倍以上且持續(xù)10周無改善者，即可肯定為亞急性重型肝炎，如果不治療，預后兇險。慢性肝炎時，-球蛋白的平均值隨病型而異。肝硬化球蛋白普遍增高，尤其在晚期或進行性失代償肝硬化，-球蛋白可極度增高。當今r-球蛋白的提取與研究已成熱門，科研用的-球蛋白來自牛。第2頁/共33頁分離純化鑒定定量層層 析析 技技 術術依據：混合物中各組分的理化性質差異吸附力、分子形狀、大小、酸堿性或分子極性、分子親和力以及分配系數。醋酸纖維素薄膜醋

2、酸纖維素薄膜電泳電泳依據：電泳的基本原理 帶電顆粒在電場中向著與其電性相反方向移動的現象稱為電泳.電泳時不同的帶電粒子在同一電場中泳動速度不同.雙縮脲法依據：血清中蛋白質的肽鍵在堿性溶液中能與2價銅離子作用生成穩(wěn)定的紫紅色絡合物。這種紫紅色絡合物在540nm處有明顯吸收峰，吸光度在一定范圍內與血清蛋白含量呈正比關系。第3頁/共33頁層析技術蛋白質的分離純化蛋白質的鑒定蛋白質的定量CONCENTSCONCENTS第4頁/共33頁第5頁/共33頁第6頁/共33頁第7頁/共33頁流動相流動相：洗脫液：洗脫液第8頁/共33頁l .分子大小不同混合物上柱；2 .洗脫開始，小分子擴散進人凝膠顆粒內，大分子

3、被排阻于顆粒之外；3 .大小分子分開： 4.大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進行中第9頁/共33頁0101第10頁/共33頁 蛋白質的分離和純化是研究蛋白質化學及其生物學功能的重要手段。不同蛋白質的相對分子質量、溶解度及在一定條件下帶電荷的情況均有所不同。利用這些性質的差別，可分離并純化各種蛋白質。 血清含有白蛋白及球蛋白，可用硫酸銨分段鹽析法初步分離。半飽和硫酸銨可使球蛋白沉淀，而白蛋白仍溶解在溶液中,經離心后可將二者分離。 分離得到的球蛋白含有大量硫酸銨,會影響蛋白質的后續(xù)純化，經葡聚糖凝膠G-25Sephadex G-25 )層析可除去硫酸銨。脫鹽后的球蛋白再經DEAE( 二乙

4、基氨基乙基)纖維素明離子交換層析而被進一步純化。 由于純化后蛋白質的體積較大，濃度較低，常需濃縮。本實驗選用聚乙醇2000 濃縮的方法。純化前后的球蛋白可用電泳方法進行比較鑒定。第11頁/共33頁1，飽和 ( NH4)2SO4,溶液 2.仙聚糖凝膠G -25 處理 3.0.0175mol/L.pH 6.3 的磷酸鹽緩沖液 4.20% 磺基水楊酸溶液5.納氏(Nessler) 試劑 6.血清醋酸纖維薄膜電泳實驗的全套試劑。7.DEAE(二乙氨基乙基)鄉(xiāng)F維索處理 8.聚乙二醇2000第12頁/共33頁1.(NH4)2SO4鹽析鹽析 a.取血清2.Oml 置于一試管中，緩慢滴人飽和( NH 4)2

5、SO4溶液2.0mL，邊加邊搖,混勻后于溫室中放置10 分鐘,3000r/min 離心10 分鐘 b.并小心傾去上清液 c.沉淀中加人0.0175moVL pH 6.3 的磷酸鹽緩沖液1ml,使之溶解，作為純化y-球蛋白用。2.葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠G-25層析柱的準備層析柱的準備 a.取層析柱垂直夾于鐵架上，關緊下端口，加蒸餾水少許 b.緩慢加人膨脹處理過的凝膠懸液，待底部凝膠沉積到1-2cm 時再打開出口 c.關閉出口，用玻璃棒插人到凝膠床表面下，輕輕攪動，繼續(xù)加人凝膠，待凝膠下沉至10 15cm 高( 防止凝膠分層和柱內混有氣泡) d.蓋一尼龍布或塑料片使表面平整 e.用0.0175mo/

6、L pH 6.3 的磷酸鹽緩沖液洗脫平衡后,即可使用。 3.上樣與洗脫上樣與洗脫 a.小心控制凝膠柱下端活塞,使柱上的緩沖液面剛好下降到凝膠床表面，第13頁/共33頁 4.洗脫液中蛋白質與洗脫液中蛋白質與NH4的檢查的檢查 a.取多孔凹玻板2 個(一個為黑色背底,另一個為白色)，按洗脫液的管號順序分別取1滴，滴于黑色皿 b.加20%磺基水楊酸2 滴，出現白色混濁或沉淀即有蛋白質析出，由此可估計蛋白質在洗脫各管中的分布及濃度 c.于另一白色多孔凹玻板中各加人納氏試劑1滴，以觀察NH4出現的情況(分光光度計） d.合并含球蛋白含量高的各管，混勻除留少量作電泳鑒定用外，其余用DEAE 纖維素陰離子交

7、換柱純化。b.關緊下端出口，用滴管吸取鹽析球蛋白液,小心緩慢地加到凝膠床表面上 c.打開下端出口，使樣品進人凝膠床 d.關閉出口,(開始收集洗脫液)小心加人少量0.0175m/LpH 6.3 的磷酸鹽緩沖液洗柱內壁,打開下端出口，待進人凝膠床后再加少量的緩沖液，如此重復3 次,以洗凈柱內壁上的樣品溶液,然后加人適量的緩沖液洗脫。(流速約0.5mL/min,每2 分鐘收集一管).5.DEAE.纖維素陰離子交換層析纖維素陰離子交換層析 a.經處理再生后的DEAE-纖維素，按上法裝柱，并用0.0175m/LpH 6.3 的磷酸緩沖液平衡 b.將脫鹽后含球蛋白的溶液加于DEAE 纖維素陰離子交換柱上用

8、同-緩沖液洗脫，分管收集洗脫液，檢查各管的蛋白質分布情況( 裝柱、上樣、洗脫，第14頁/共33頁收集及蛋白質檢查等操作步驟及有關注意事項同上)。6.蛋白浴液濃縮蛋白浴液濃縮 將待濃縮的蛋白溶液放人處理過的透析袋中，置人培養(yǎng)皿內，覆蓋適量聚乙二醇2000過-定時間后即可觀察到明顯的濃縮現象。使用后的聚乙二醇，可通過干燥回收第15頁/共33頁1硫酸銨的滴加，邊搖邊逐滴加入2流洗柱子：34個柱長3上樣：轉圈滴加，起跑線一致4防止柱上液層干涸(兩人合作）5洗脫液收集無需分步，用載玻片檢測蛋白。6G-25干膠用紙條少量多次加入，液層高0.5ml7. 用過的G-25干膠倒入收集缸，回收利用。第16頁/共3

9、3頁0202第17頁/共33頁 血清中各種蛋白質的等電點大都低于7.0在pH8.6的緩沖液中，它們大都以陰離子形式存在，在電場中向正極移動。由于各種蛋白質的pI不同，在同一pH下帶電荷量也有所差異，同時各蛋白質的分子大小與分子形狀也不相同。因此，在同一電場中泳動速度也不同，從而得到分離. 醋酸纖維素薄膜電泳( CAME)一般能將血清蛋白分離為5 條區(qū)帶，從正極端起依次為白蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、B-球蛋白及y-球蛋白。染色時染料與蛋白質特異結合而不與醋酸纖維素膜結合，染色深淺與蛋白質的量成正比，染色一段時間后將各蛋白區(qū)帶剪下經脫色、比色或經透明處理后直接用光密度計掃描，即可計算出血清

10、中各蛋白質組分的相對百分數。第18頁/共33頁鉛筆標記鉛筆標記 ，垂直點樣，垂直點樣第19頁/共33頁 清蛋清蛋白白 1 2 加樣加樣線線加樣加樣線線純化蛋純化蛋白白對照對照樣品樣品第20頁/共33頁第21頁/共33頁1點樣點樣 取經巴比妥緩沖液浸透的28cm薄膜，濾紙吸去表面多余水分，在無光澤面距一端2cm處用鉛筆劃一加樣線，寫上編號。小濾紙片蘸取血清/樣品，垂直壓在加樣線上，待樣品滲入薄膜，無光澤面向下平貼在電泳槽支架的鹽橋上，靜置510分鐘平衡。點樣端置陰極，蓋上蓋子。2通電通電 接通電源，調節(jié)電壓為4050V，通電2 2.5h，關閉電源，停止電泳。3染色染色 薄膜浸入氨基黑10B染色液

11、25分鐘。4漂洗漂洗 取出薄膜在漂洗液中漂洗45次，至無蛋白區(qū)完全脫色為止。取出，用濾紙吸干液體。觀察。第22頁/共33頁5.定量定量 氨基黑IOB 染色法:將各條蛋白區(qū)帶仔細剪下,分別置于各試管內,另從空白背景剪一塊平均大小的膜條置于空白試管中,在白蛋白管內加入0.4mol/L NaOH 溶液6mL( 計算時吸光度乘2),其余各管加人3ml,于37C水浴20 分鐘，并不斷搖動,待顏色脫凈后，取出冷卻。在620nm 處比色.以空白管調零,讀取各管吸光度值。6.計算計算第23頁/共33頁0303第24頁/共33頁 血清中蛋白質的肽鍵（-CO-NH-）在堿性溶液中能與2價銅離子作用生成穩(wěn)定的紫紅色絡合物。這種紫紅色絡合物在540nm處有明顯吸收峰，吸光度在一定范圍內與血清蛋白含量呈正比關系，經與同樣處理的蛋白質標準液比較，即可求得蛋白質含量。H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 NH3 雙縮脲第25頁/共33頁第26頁/共33頁光路第27頁/共33頁第28頁/共33頁加入物(mL)RBSU血清0.1蛋白標準液0.1蒸餾水0.1雙縮脲試劑5.05.05.02.各