基礎(chǔ)生物化學(xué)酶課件

1、123The Nobel Prize in Chemistry 19074The Nobel Prize in Chemistry 1946 Sumner Stanley Northropfor their preparation of enzymes and virus proteins in a pure form for his discovery that enzymes can be crystallized 1/2 of the prize 1/4 of the prize 1/4 of the prize56是活細(xì)胞合成的、對其特異是活細(xì)胞合成的、對其特異的底物起高效催化作用的的

2、底物起高效催化作用的。是近年來發(fā)現(xiàn)的對是近年來發(fā)現(xiàn)的對RNA具有高效特異催化作用的具有高效特異催化作用的，其作用主要，其作用主要參與參與RNA的剪接。的剪接。具有催化活性的具有催化活性的78 鉑：催化許多反應(yīng)，包括有機(jī)反應(yīng)鉑：催化許多反應(yīng)，包括有機(jī)反應(yīng) H+：淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)、蔗糖等：淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)、蔗糖等 酶：作用于結(jié)構(gòu)近似的分子，甚至只催化一種化酶：作用于結(jié)構(gòu)近似的分子，甚至只催化一種化合物合物9n專一性主要取決于酶的專一性主要取決于酶的活性中心活性中心的構(gòu)象和性的構(gòu)象和性質(zhì)質(zhì)101112131415L(+)乳酸通過其不對稱乳酸通過其不對稱C原子上的原子上的CH3、COOH及及OH基

3、分別與乳酸脫氫酶活性中心的基分別與乳酸脫氫酶活性中心的A、B及及C三個三個功能基團(tuán)結(jié)合，故可受酶催化而轉(zhuǎn)變?yōu)楸?。功能基團(tuán)結(jié)合，故可受酶催化而轉(zhuǎn)變?yōu)楸?。D(-)乳酸由于乳酸由于OH、COOH的空間位置與的空間位置與L(+)乳酸相乳酸相反，與酶的三個結(jié)合基團(tuán)不能完全配合，故不能與反，與酶的三個結(jié)合基團(tuán)不能完全配合，故不能與酶結(jié)合受其催化。酶結(jié)合受其催化。16171819 生物活性僅決定于蛋白質(zhì)部分生物活性僅決定于蛋白質(zhì)部分 由蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)部分組成的酶由蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)部分組成的酶 非蛋白部分一般是有機(jī)小分子化合物非蛋白部分一般是有機(jī)小分子化合物或金屬離子，稱為輔因子或金屬離子，稱為輔因

4、子202122n金屬酶金屬酶(metalloenzyme) 金屬離子與酶結(jié)合緊密，提取過程中不易丟失金屬離子與酶結(jié)合緊密，提取過程中不易丟失n金屬激活酶金屬激活酶(metal-activated enzyme) 金屬離子為酶的活性所必需，但與酶的結(jié)合不甚金屬離子為酶的活性所必需，但與酶的結(jié)合不甚緊密緊密n金屬離子的作用金屬離子的作用 參與催化反應(yīng)，傳遞電子；參與催化反應(yīng)，傳遞電子； 在酶與底物間起橋梁作用；在酶與底物間起橋梁作用； 穩(wěn)定酶的構(gòu)象；穩(wěn)定酶的構(gòu)象； 中和陰離子，降低反應(yīng)中的靜電斥力等。中和陰離子，降低反應(yīng)中的靜電斥力等。 23小分子有機(jī)化合物在催化中的作用小分子有機(jī)化合物在催化中的

5、作用尼尼克克酰酰胺胺（維維生生素素PP之之一一）尼尼克克酰酰胺胺（維維生生素素PP之之一一）維維生生素素B2（核核黃黃素素）維維生生素素B2（核核黃黃素素）維維生生素素B1（硫硫胺胺素素）泛泛酸酸硫硫辛辛酸酸維維生生素素B12生生物物素素吡吡哆哆醛醛（維維生生素素B6之之一一）葉葉酸酸NAD+（尼尼克克酰酰胺胺腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸，輔輔酶酶I）NADP+（尼尼克克酰酰胺胺腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸磷磷酸酸，輔輔酶酶II）FMN （黃黃素素單單核核苷苷酸酸）FAD（黃黃素素腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸）TPP（焦焦磷磷酸酸硫硫胺胺素素）輔輔酶酶A（CoA）硫硫辛辛酸酸鈷鈷胺胺素素輔輔酶

6、酶類類生生物物素素磷磷酸酸吡吡哆哆醛醛四四氫氫葉葉酸酸氫氫原原子子（質(zhì)質(zhì)子子）醛醛基基酰?；橥榛跹趸继及卑被准谆?、甲甲烯烯基基、甲甲炔炔基基、甲甲酰?；鹊纫灰惶继紗螁挝晃凰牡木S維生生素素名名稱稱小小分分子子有有機(jī)機(jī)化化合合物物(輔輔 酶酶 或或 輔輔 基基)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移的的基基團(tuán)團(tuán)尼尼克克酰酰胺胺（維維生生素素PP之之一一）尼尼克克酰酰胺胺（維維生生素素PP之之一一）維維生生素素B2（核核黃黃素素）維維生生素素B2（核核黃黃素素）維維生生素素B1（硫硫胺胺素素）泛泛酸酸硫硫辛辛酸酸維維生生素素B12生生物物素素吡吡哆哆醛醛（維維生生素素B6之之一一）葉葉酸酸NAD

7、+（尼尼克克酰酰胺胺腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸，輔輔酶酶I）NADP+（尼尼克克酰酰胺胺腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸磷磷酸酸，輔輔酶酶II）FMN （黃黃素素單單核核苷苷酸酸）FAD（黃黃素素腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸）TPP（焦焦磷磷酸酸硫硫胺胺素素）輔輔酶酶A（CoA）硫硫辛辛酸酸鈷鈷胺胺素素輔輔酶酶類類生生物物素素磷磷酸酸吡吡哆哆醛醛四四氫氫葉葉酸酸氫氫原原子子（質(zhì)質(zhì)子子）醛醛基基酰?；橥榛跹趸继及卑被准谆⒓准紫┫┗?、甲甲炔炔基基、甲甲酰?；鹊纫灰惶继紗螁挝晃凰牡木S維生生素素名名稱稱小小分分子子有有機(jī)機(jī)化化合合物物(輔輔 酶酶 或或 輔輔 基基)

8、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移的的基基團(tuán)團(tuán)24252627282930 根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類型，按照國際酶學(xué)委員根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類型，按照國際酶學(xué)委員會，將酶分為六大類：會，將酶分為六大類：313233343536乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶 EC 1. 1. 1. 27第第1大類，氧化還原酶大類，氧化還原酶第第1亞類，氧化基團(tuán)亞類，氧化基團(tuán)CHOH第第1亞亞類，亞亞類，H受體為受體為NAD+該酶在亞亞類中的流水編號該酶在亞亞類中的流水編號3738391. 酶的催化作用及分子活化能酶的催化作用及分子活化能4041Enzyme Stabilizes Transition State SPESESTEPSTReaction

9、directionEnergy changeEnergy required (no catalysis)Energy decreases (under catalysis)Whats the difference?T = Transition state422. 中間產(chǎn)物學(xué)說中間產(chǎn)物學(xué)說ES+P+In steady state, the production and consumption of the transition state proceed at the same rate. So the concentration of transition state keeps a cons

10、tant.SEE43443. 酶的活性部位和必需集團(tuán)酶的活性部位和必需集團(tuán)4546474. 酶與底物結(jié)合形成中間絡(luò)合物的方式（理論）酶與底物結(jié)合形成中間絡(luò)合物的方式（理論）4.1 鎖鑰假說鎖鑰假說(lock and key hypothesis)：484.2誘導(dǎo)契合假說（誘導(dǎo)契合假說（inducedfit hypothesis): 49誘導(dǎo)契合學(xué)說的要點(diǎn)誘導(dǎo)契合學(xué)說的要點(diǎn)50n鄰近效應(yīng)：鄰近效應(yīng)：在酶促反應(yīng)中，由于酶和底物分子之間在酶促反應(yīng)中，由于酶和底物分子之間的親和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趨勢，的親和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趨勢，最終結(jié)合到酶的活性中心，使底物在酶活性中

11、心的最終結(jié)合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效濃度大大增加的效應(yīng)有效濃度大大增加的效應(yīng)n定向效應(yīng)：定向效應(yīng)：當(dāng)專一性底物向酶活性中心靠近時，會當(dāng)專一性底物向酶活性中心靠近時，會誘導(dǎo)酶分子構(gòu)象發(fā)生改變，同時使反應(yīng)基團(tuán)之間的誘導(dǎo)酶分子構(gòu)象發(fā)生改變，同時使反應(yīng)基團(tuán)之間的分子軌道以正確方向嚴(yán)格定位，使酶促反應(yīng)易于進(jìn)分子軌道以正確方向嚴(yán)格定位，使酶促反應(yīng)易于進(jìn)行。行。 這兩種效應(yīng)使酶具有高效率和專一性特點(diǎn)這兩種效應(yīng)使酶具有高效率和專一性特點(diǎn)5. 使酶具有高催化效率的因素使酶具有高催化效率的因素5.1 鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)51525.2 “張力張力”和和“變形變形”從而使底物分子某些

12、鍵的鍵從而使底物分子某些鍵的鍵能減弱，產(chǎn)生鍵扭曲，降低了反應(yīng)的活化能，能減弱，產(chǎn)生鍵扭曲，降低了反應(yīng)的活化能，有助于過渡態(tài)的中間產(chǎn)物形成有助于過渡態(tài)的中間產(chǎn)物形成53545.3 酸堿催化酸堿催化55n催化劑通過與底物形成反應(yīng)活性很高的共價過渡產(chǎn)物，催化劑通過與底物形成反應(yīng)活性很高的共價過渡產(chǎn)物，使反應(yīng)活化能降低，從而提高反應(yīng)速度的過程，稱為使反應(yīng)活化能降低，從而提高反應(yīng)速度的過程，稱為共價催化共價催化。n酶中參與共價催化的基團(tuán)主要包括以下親核基團(tuán)：酶中參與共價催化的基團(tuán)主要包括以下親核基團(tuán)： His 的咪唑基，的咪唑基，Cys 的巰基，的巰基，Asp 的羧基，的羧基，Ser 的羥基的羥基等；親

13、電子基團(tuán)：等；親電子基團(tuán)：H+ 、Mg2+、 Mn2+ 、Fe3+n某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與共價催化作用與共價催化作用 5.4 共價催化共價催化56n 酶活性中心內(nèi)相對地說是非極性的，也就是說酶酶活性中心內(nèi)相對地說是非極性的，也就是說酶的催化基團(tuán)被低介電環(huán)境所包圍，在某些情況下，的催化基團(tuán)被低介電環(huán)境所包圍，在某些情況下，還可能排除高極性的水分子。這樣，底物分子的還可能排除高極性的水分子。這樣，底物分子的敏感鍵和酶的催化基團(tuán)之間就會有很大的反應(yīng)力，敏感鍵和酶的催化基團(tuán)之間就會有很大的反應(yīng)力，這是有利于酶的加速反應(yīng)。這是有利于

14、酶的加速反應(yīng)。5.5 酶活性中心是低介電區(qū)域酶活性中心是低介電區(qū)域57586. 胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶是一個絲氨胰凝乳蛋白酶是一個絲氨酸蛋白酶，活性中心的酸蛋白酶，活性中心的殘基：殘基：AspAsp102 102 HisHis57 57 SerSer19519559Asp102His57Ser195HHChymotrypsin Catalytic Mechanism A1NCCNHOOCHOCCNCCNH2OCheck substrate specificity60Asp102His57Ser195HHChymotrypsin Catalytic Mechanism A2NCCN

15、HOOCHOCCNCCNH2OFirst Transition State61HHChymotrypsin Catalytic Mechanism A3NCCNHOOCHOCCNCCNH2OAcyl-Enzyme Intermediate62HChymotrypsin Catalytic Mechanism D1N-HCCNHOOCHOCCNCCNH2OHOHAcyl-Enzyme Water Intermediate63HChymotrypsin Catalytic Mechanism D2OOCCNCCNH2HSecond Transition StateOH64HChymotrypsin

16、 Catalytic Mechanism D3OCCNCCNH2OOHDeacylationH6566677. 酶原激活酶原激活68697071酶促反應(yīng)速度酶促反應(yīng)速度 研究一種因素的影響時，其余各因素均恒定。研究一種因素的影響時，其余各因素均恒定。721. 酶反應(yīng)速度的測量酶反應(yīng)速度的測量73742. 酶濃度對酶作用的影響酶濃度對酶作用的影響753. 底物濃度對酶作用的影響和米氏方程底物濃度對酶作用的影響和米氏方程3.1 底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響76 Increase Substrate Concentration 2134567800 2 4 6 8Subs

17、trate (mmole)Product806040200S+EP(in a fixed period of time)777879Constant ES Concentration at Steady StateSPEESReaction TimeConcentrationJuang RH (2004) BCbasics803.2 米氏方程米氏方程81Km 米氏常數(shù)米氏常數(shù)Vmax 最大反應(yīng)速度最大反應(yīng)速度82米氏方程的推導(dǎo)：米氏方程的推導(dǎo)：83848586K Km mSS KKm m值等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半值等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度，單位是時的底物濃度，單

18、位是mol/Lmol/L。2 2K Km m + S+ S V Vmaxmax V VmaxmaxSSV VmaxmaxS S K Km m + S + S 873.3 米氏常數(shù)米氏常數(shù)Km的意義的意義Km等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時的底等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度。物濃度。8889Km = SKm + S = 2 SVmax2=Vmax SKm + SKm: Affinity with Substrate If vo =Vmax2S2S1S3S1 S2 S3Vmax1/2When using different substrateAffinity changesKm

19、vo =Vmax SKm + S903.4 Km值與值與Vmax值的測定值的測定9192An Example for Enzyme Kinetics (Invertase)VmaxKmSvo1/S1voDouble reciprocalDirect plot Use predefined amount of Enzyme E Add substrate in various concentrations S (x 軸) Measure Product in fixed Time (P/t) vo (y 軸) (x, y) plot get hyperbolic curve, estimate

20、Vmax When y = 1/2 Vmax calculate x (S) Km1Vmax- 1 Km1/293A Real Example for Enzyme KineticsDatano12340.250.501.02.00.420.720.800.92Absorbancev (mmole/min)S0.210.360.400.46(1) The product was measured by spectroscopy at 600 nm for 0.05 per mmole(2) Reaction time was 10 min VelocitySubstrate ProductDo

21、uble reciprocal1/S1/v4210.52.081.561.351.16 1.00.50vDirect plotDouble reciprocal2.01.001/v-4 -2 0 2 41/S0 1 2S1.0-3.894 例1：下列數(shù)據(jù)是對酶促反應(yīng)sp的記錄： s(molL-1) v(nmolL-1min-1) 6.2510-6 15.0 7.5010-5 56.25 1.0010-4 60 1.0010-3 74.9 1.0010-2 75 1.0010-1 75 求（1）Vmax和Km (2) s=2.510-5和s=2.0010-1時v等于多大。95 例2：下列數(shù)據(jù)是對

22、酶促反應(yīng)sp的記錄： s(umolL-1) v(umolmin-1) 0.1 0.27 10.0 20.0 60.0 80.0 200 120 1000 150 1500 160 2000 160 求（1）Vmax和Km (2) s =1600時游離酶的濃度多大？964. pH對酶作用的影響對酶作用的影響97pH影響酶作用的原因：影響酶作用的原因：985. 溫度對酶作用的影響溫度對酶作用的影響99n最適溫度最適溫度 (optimum temperature)：100101 貯存生物制品、菌種等貯存生物制品、菌種等 低溫時由于活化分子數(shù)目減少，反應(yīng)速度降低，但溫度升高后，酶活性又可恢復(fù)。 臨床上

23、的低溫麻醉臨床上的低溫麻醉 減少組織細(xì)胞的代謝程度，使機(jī)體耐受手術(shù)時氧和營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏。1026. 激活劑對酶作用的影響激活劑對酶作用的影響103104105n區(qū)別于酶的變性區(qū)別于酶的變性 抑制劑對酶有一定選擇性抑制劑對酶有一定選擇性 引起變性的因素對酶沒有選擇性引起變性的因素對酶沒有選擇性7. 抑制劑對酶作用的影響抑制劑對酶作用的影響1061071087.1 不可逆性抑制作用不可逆性抑制作用109110 7.2 可逆性抑制作用可逆性抑制作用1117.2.1 競爭性抑制競爭性抑制112113114115116n競爭性競爭性I往往是酶的底物結(jié)構(gòu)類似物；往往是酶的底物結(jié)構(gòu)類似物；n抑制劑與酶的結(jié)合

24、部位與底物與酶的結(jié)合部抑制劑與酶的結(jié)合部位與底物與酶的結(jié)合部位相同位相同 酶的活性中心酶的活性中心n抑制作用可以被高濃度的底物減低以致消除；抑制作用可以被高濃度的底物減低以致消除；n(表觀）表觀）Km值增大，值增大，Vm值不變；值不變；n在雙倒數(shù)圖上表現(xiàn)為：在雙倒數(shù)圖上表現(xiàn)為： 競爭性抑制和無抑制的直線在縱軸上交于一點(diǎn)；競爭性抑制和無抑制的直線在縱軸上交于一點(diǎn)； 競爭性抑制直線斜率增大；競爭性抑制直線斜率增大； 競爭性抑制直線在橫軸上的交點(diǎn)右移；競爭性抑制直線在橫軸上的交點(diǎn)右移；1171181197.2.2 非競爭性抑制非競爭性抑制120121122123有非競爭性抑制劑存在時，有非競爭性抑制

25、劑存在時，V值減小值減小(1+I/Ki)倍，倍，且且V值隨值隨I的增高而降低；的增高而降低；Km值不變。值不變。1241257.2.3 反競爭性抑制反競爭性抑制126127128129130Enzyme Inhibition (Mechanism)IISSSI II II IIISCompetitiveNon-competitiveUncompetitiveEEDifferent siteCompete for active siteInhibitorSubstrateCartoon GuideEquation and Description binds to free E only,and

26、competes with S;increasing S overcomesInhibition by . binds to free E or ES complex; Increasing S cannot overcome inhibition. binds to ES complex only, increasing S favorsthe inhibition by .E + S ES E + P + E E + S ES E + P + + E + S E S E + S ES E + P + E S EISX131KmEnzyme Inhibition (Plots)I IIICo

27、mpetitiveNon-competitiveUncompetitive Direct PlotsDouble ReciprocalVmaxVmaxKmKmS, mMvoS, mMvoKmS, mMVmaxKmVmaxVmaxVmax unchangedKm increasedVmax decreasedKm unchangedBoth Vmax & Km decreased1/S1/Km1/vo1/ VmaxTwo parallellinesIntersect at X axis1/vo1/ Vmax1/S1/Km1/S1/Km1/ Vmax1/vo Intersect at Y

28、axis= Km132133134 一些代謝物可與某些酶一些代謝物可與某些酶變酶的催化活性，變酶的催化活性，此種調(diào)節(jié)方式稱別構(gòu)調(diào)節(jié)。此種調(diào)節(jié)方式稱別構(gòu)調(diào)節(jié)。 135136137138139TTRTSvoMechanism and Example of Allosteric EffectS SS SRRS SS SRS SAITSvoSvo(+)(-)XXXR = Relax(active)T = Tense(inactive)Allosteric siteHomotropic(+)ConcertedHeterotropic(+)SequentialHeterotropic(-)Concerte

29、dAllosteric siteKineticsCooperationModels(-)(+)(+)Juang RH (2004) BCbasics140141142143144145146147148149150151152153154Turn Over Numbers of EnzymesCatalase H2O2Carbonic anhydrase HCO3-Acetylcholinesterase Acetylcholine40,000,000400,000140,000b-Lactamase Benzylpenicillin2,000Fumarase Fumarate800RecA protein (ATPase) ATP0.4EnzymesSubstratekcat (s-1)The number of product transformed from substrate by one enzyme molecule in one second155Enzyme Kineticsvo=Vmax