精氨酸激酶AKppt課件

1、LOGO精氨酸激酶精氨酸激酶(AK)的表達(dá)及其純化的表達(dá)及其純化LOGO目錄目錄研討背景研討背景1實驗資料實驗資料2實驗方法實驗方法3結(jié)果及分析結(jié)果及分析4蛋白質(zhì)的分別純化蛋白質(zhì)的分別純化v蛋白質(zhì)的分別純化是對蛋白質(zhì)進(jìn)展研討的一項必蛋白質(zhì)的分別純化是對蛋白質(zhì)進(jìn)展研討的一項必需的和根底的任務(wù)。目前常運用的分別純化的方需的和根底的任務(wù)。目前常運用的分別純化的方法或技術(shù)都是在了解蛋白質(zhì)性質(zhì)和構(gòu)造特點的根法或技術(shù)都是在了解蛋白質(zhì)性質(zhì)和構(gòu)造特點的根底上建立的。目的蛋白質(zhì)的分別決不是一件輕而底上建立的。目的蛋白質(zhì)的分別決不是一件輕而易舉的事情，由于要把它與性質(zhì)、大小和構(gòu)造非易舉的事情，由于要把它與性質(zhì)、大

2、小和構(gòu)造非常類似的其他蛋白質(zhì)別分開來存在許多困難。有常類似的其他蛋白質(zhì)別分開來存在許多困難。有些目的蛋白質(zhì)在組織細(xì)胞內(nèi)的含量很低，這無疑些目的蛋白質(zhì)在組織細(xì)胞內(nèi)的含量很低，這無疑將添加獲取足量蛋白質(zhì)的難度。將添加獲取足量蛋白質(zhì)的難度。v 目的蛋白質(zhì)的分別純化程序主要包括目的蛋白質(zhì)的分別純化程序主要包括: 資料的選擇；資料的選擇；組織勻漿和破碎細(xì)胞獲取粗提取液；組織勻漿和破碎細(xì)胞獲取粗提取液；蛋白質(zhì)初步提純；蛋白質(zhì)初步提純；選擇一種或幾種適宜的方法除去雜蛋白選擇一種或幾種適宜的方法除去雜蛋白,直至完全直至完全 純化；純化；目的蛋白的鑒定。用于研討目的蛋白質(zhì)通常應(yīng)堅目的蛋白的鑒定。用于研討目的蛋白

3、質(zhì)通常應(yīng)堅持它的生物活性。因此，在目的蛋白質(zhì)的整個分別持它的生物活性。因此，在目的蛋白質(zhì)的整個分別純化過程中要在較低溫度下純化過程中要在較低溫度下(04)操作，留意運用操作，留意運用蛋白酶蛋白酶(使蛋白質(zhì)降解的酶使蛋白質(zhì)降解的酶)的抑制劑，防止運用猛烈的抑制劑，防止運用猛烈條件，以免蛋白質(zhì)特定的折疊構(gòu)造遭到破壞。條件，以免蛋白質(zhì)特定的折疊構(gòu)造遭到破壞。 一、蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)一、蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì) 根據(jù)蛋白質(zhì)的分子構(gòu)造，很容易得出構(gòu)成蛋根據(jù)蛋白質(zhì)的分子構(gòu)造，很容易得出構(gòu)成蛋白質(zhì)的兩性解離的根底是氨基酸殘基的側(cè)鏈可解離的白質(zhì)的兩性解離的根底是氨基酸殘基的側(cè)鏈可解離的基團(tuán)。基團(tuán)。 作為兩性電解質(zhì)，

4、每種蛋白質(zhì)都有其等電點作為兩性電解質(zhì)，每種蛋白質(zhì)都有其等電點(pI) (pI) ，這與它所含的氨基酸種類和數(shù)量有關(guān)。，這與它所含的氨基酸種類和數(shù)量有關(guān)。 一切的蛋白質(zhì)，不論它具有什么樣的功能，一切的蛋白質(zhì)，不論它具有什么樣的功能，都能在細(xì)胞內(nèi)起一定的緩沖作用。都能在細(xì)胞內(nèi)起一定的緩沖作用。1. 1. 蛋白質(zhì)的電泳分別蛋白質(zhì)的電泳分別 凝膠電泳是目前常用的一種生化方法。用凝膠電泳是目前常用的一種生化方法。用于蛋白質(zhì)分別的凝膠主要是聚丙烯酰胺凝膠，該凝于蛋白質(zhì)分別的凝膠主要是聚丙烯酰胺凝膠，該凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺配制膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺配制而成，其最大的特

5、點是凝膠的孔徑可根據(jù)需求進(jìn)展而成，其最大的特點是凝膠的孔徑可根據(jù)需求進(jìn)展選擇。以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，可進(jìn)展非變性選擇。以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，可進(jìn)展非變性電泳和變性電泳。電泳和變性電泳。1 透析透析2 層析原理層析原理3 凝膠過濾凝膠過濾4 離子交換層析離子交換層析5 親和層析親和層析6 電泳電泳主要內(nèi)容1 透透 析析按照分子大按照分子大小進(jìn)展分別。小進(jìn)展分別。分別取決于分別取決于透析袋截留透析袋截留的分子量。的分子量。透析液透析液濃縮的蛋白濃縮的蛋白混合樣品混合樣品 透析袋透析袋 開場透析開場透析處于平衡形狀處于平衡形狀 層析也稱之色譜，根本原理是分析樣品作為流動層析也稱之色譜，根本原

6、理是分析樣品作為流動相流過固相時，由于樣品中的各個成分與固相互相作相流過固相時，由于樣品中的各個成分與固相互相作用不同使得樣品中的各個成分經(jīng)過固相的速率產(chǎn)生了用不同使得樣品中的各個成分經(jīng)過固相的速率產(chǎn)生了差別，從而到達(dá)分別樣品中各個成分的目的。差別，從而到達(dá)分別樣品中各個成分的目的。 層析因固相介質(zhì)不同又分為離子交換層析、分子層析因固相介質(zhì)不同又分為離子交換層析、分子篩層析和吸附層析等各種層析。篩層析和吸附層析等各種層析。2 2 層析原理層析原理 將作為固相成分的將作為固相成分的不溶性基質(zhì)，例如葡不溶性基質(zhì)，例如葡聚糖凝膠、纖維素、聚糖凝膠、纖維素、樹脂等填充到柱子中，樹脂等填充到柱子中，用平

7、衡液平衡。用平衡液平衡。 然后加樣品，再用然后加樣品，再用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵?。適當(dāng)?shù)娜軇┫疵摗?樣品中各種成分經(jīng)樣品中各種成分經(jīng)過柱子取決于與固相過柱子取決于與固相成分的相互作用，最成分的相互作用，最后以不同速率被洗脫后以不同速率被洗脫出來，到達(dá)將各個成出來，到達(dá)將各個成分分別的目的。分分別的目的。 凝膠層析是按照蛋凝膠層析是按照蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)展分白質(zhì)分子量大小進(jìn)展分別的技術(shù)，又稱之凝膠別的技術(shù)，又稱之凝膠過濾、分子篩層析或排過濾、分子篩層析或排阻層析。阻層析。 單個凝膠珠本身象單個凝膠珠本身象“篩子。不同類型凝膠篩子。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。的篩孔的大小不同。1.2 凝膠過濾層析凝膠過

8、濾層析帶網(wǎng)孔的帶網(wǎng)孔的葡聚糖珠葡聚糖珠小分子進(jìn)入小分子進(jìn)入葡聚糖珠內(nèi)葡聚糖珠內(nèi)大分子不大分子不能進(jìn)入珠能進(jìn)入珠內(nèi)，經(jīng)珠內(nèi)，經(jīng)珠之間縫隙之間縫隙流出流出凝膠過濾層析過程表示圖凝膠過濾層析過程表示圖凝膠過濾層析過程表示凝膠過濾層析過程表示圖圖小分子小分子大分子大分子凝膠基質(zhì)凝膠基質(zhì)凝膠凝膠珠珠蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)Mr=49,000洗出洗出液中液中的蛋的蛋白質(zhì)白質(zhì)濃度濃度洗脫體積洗脫體積mL未知未知logMrAndrews的閱歷公式：的閱歷公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)G-200G-100logMrKav 假設(shè)被分別的樣品中各個成分受溶液pH的影響，有時帶正電荷，有時帶負(fù)電荷，此時就可利用離子交

9、換層析方法進(jìn)展樣品的分別。 離子交換層析的固相是離子交換體，包括離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換葡聚糖。 帶有SO3 或COO基團(tuán)，通常以SO3Na 或COOH方式出現(xiàn)的叫做陽離子交換基； 帶有NC2H5基團(tuán)通常以NC2H5Cl出現(xiàn)的叫做陰離子交換基。3 離子交換層析離子交換層析陽離子交換基陽離子交換基強酸性，聚苯乙烯樹脂強酸性，聚苯乙烯樹脂弱酸性，羧甲基纖維素弱酸性，羧甲基纖維素弱酸性，螯協(xié)作用，聚苯乙烯樹脂弱酸性，螯協(xié)作用，聚苯乙烯樹脂陰離子交換基陰離子交換基強堿性，聚苯乙烯樹脂強堿性，聚苯乙烯樹脂弱堿性，二乙氨乙基纖維素弱堿性，二乙氨乙基纖維素陽陽離離子子交交換換層層析析過過程程離

10、子交離子交換樹脂換樹脂蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)高離子高離子強度洗強度洗脫液洗脫液洗高離子高離子強度洗強度洗脫液洗脫液洗加加樣樣平平衡衡液液洗洗搜集搜集 依賴于蛋白質(zhì)和它的配體ligand之間的相互作用來分別的。配體通常指的是能與另一個分子或原子結(jié)合普通是非共價結(jié)合的分子、基團(tuán)、離子、或原子。但在親和層析中，配體是經(jīng)過共價鍵先與基質(zhì)結(jié)合，配體可以是酶結(jié)合的一個反響物或產(chǎn)物，或是一種可以識別靶蛋白的抗體。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物經(jīng)過裝有銜接了配體的基質(zhì)的親和層析柱時，只需靶蛋白可以特異地與基質(zhì)結(jié)合，而其它沒有結(jié)合的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。特異結(jié)合在基質(zhì)上的靶蛋白最后可以用含有高濃度自在配體的溶劑洗下。所以有時只用親和層

11、析就可使蛋白質(zhì)的純化提高1000至10000倍。4 親和層析親和層析含配體溶液含配體溶液搜集目的蛋白搜集目的蛋白 洗下未結(jié)合的蛋白洗下未結(jié)合的蛋白混合蛋白樣混合蛋白樣品品平衡液平衡液帶有配體的樹脂帶有配體的樹脂珠或膠粒珠或膠粒親和層析過程親和層析過程 his- tag所用層析凝膠的基質(zhì)上銜接了一個NTA=nitrilotriacetic acid氮基三乙酸，可以與Ni離子結(jié)合，而Ni離子與交融蛋白的6Xhis氨基酸之間產(chǎn)生如圖的吸引力，從而將帶有his-tag組氨酸標(biāo)簽的交融 蛋白與其它蛋白區(qū)分開來。從圖中可以看到，組氨酸殘基紅色五元咪唑環(huán)是蛋白與Ni離子作用的關(guān)鍵。因此帶暴露的His-6的蛋

12、白能結(jié)合于固化Ni樹脂，用適當(dāng)緩沖溶液沖洗去其他蛋白后，再用可溶的競爭性螯合劑洗脫可以回收靶蛋白。電泳v 電泳分別蛋白質(zhì)是根據(jù)蛋白質(zhì)在電場中的遷移的差別到達(dá)分別目的的。蛋白質(zhì)樣品加到一塊預(yù)先制好的凝膠介質(zhì)上，只需在凝膠的兩端加上電場，就可以到達(dá)分別蛋白質(zhì)的目的，這樣的電泳稱之凝膠電泳gel electrophoresis。凝膠可以是淀粉凝膠starch gel、瓊脂糖凝膠agarose gel和聚丙烯酰胺凝膠polyacrylamide gel。普通凝膠介質(zhì)中的pH被維持在堿性區(qū)，目的是使大多數(shù)蛋白質(zhì)都帶有負(fù)電荷，這樣它們可以向陽極遷移。蛋白質(zhì)的遷移與蛋白質(zhì)的質(zhì)量和帶電荷的多少有關(guān)。電泳技術(shù)分

13、類垂直板電泳垂直板電泳毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳程度板電泳程度板電泳電電泳泳支支持持物物濾紙濾紙凝膠凝膠薄膜薄膜圓盤電泳圓盤電泳SDSPAGE測定相對分子質(zhì)量測定相對分子質(zhì)量十二烷基磺酸鈉十二烷基磺酸鈉原態(tài)蛋白質(zhì)變性？磺酸基磺酸基 極性親水極性親水烷基烷基 親油蛋白質(zhì)疏水區(qū)親油蛋白質(zhì)疏水區(qū)遷移率與電荷和外形無關(guān)，僅取決于相對分子質(zhì)量遷移率與電荷和外形無關(guān)，僅取決于相對分子質(zhì)量巰基乙醇破壞二硫鍵研討背景研討背景 精氨酸激酶的簡介 無脊椎動物的精氨酸激酶Arginine kinase, AKATP:N-精氨酸磷酸轉(zhuǎn)移酶E.C.2.7.3.3類似于脊椎動物中的肌酸激酶creatine kinase ，CK

14、ATP:N-肌酸磷酸轉(zhuǎn)移酶E.C.2.7.3.3， 是細(xì)胞代謝中的磷酸激酶，它將Mg2+ATP上的磷酸基轉(zhuǎn)移到精氨酸上，產(chǎn)生磷酸精氨酸和Mg2+ADP，在無脊椎動物的能量代謝中起著重要作用 。AK在體內(nèi)催化反響方程式如下：ArginineATPMgphosphate ArginineADPMg22LOGO主要實驗儀器主要實驗儀器紫外分光光度計紫外分光光度計U4300，電腦恒溫層析柜、，電腦恒溫層析柜、 ORION pH計、計、紫外檢測儀、冷凍離心機、紫外檢測儀、冷凍離心機、 超聲破壁儀超聲破壁儀 、雪山、雪山制冰機、制冰機、超純水機、低溫恒溫槽電泳儀、電子天平、振蕩超純水機、低溫恒溫槽電泳儀、

15、電子天平、振蕩培育箱、培育箱、單人單面凈化任務(wù)臺、電熱恒溫鼓風(fēng)枯燥箱、高單人單面凈化任務(wù)臺、電熱恒溫鼓風(fēng)枯燥箱、高壓滅菌鍋壓滅菌鍋實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容1 活化菌種活化菌種 取取50 L表達(dá)菌種接入表達(dá)菌種接入6 mL的的LB液體培液體培育基含有卡那青霉素，其任務(wù)濃度為育基含有卡那青霉素，其任務(wù)濃度為50 g/mL中，于中，于37 搖床振蕩培育搖床振蕩培育8-12小時。小時。 2 擴(kuò)展培育擴(kuò)展培育 將試管中活化的將試管中活化的3 mL菌液接種到菌液接種到100 mL LB培育基，同時參與卡那青霉素終濃度培育基，同時參與卡那青霉素終濃度50 g/mL培育基于培育基于37恒溫培育箱中培恒溫培育箱中培育育

16、2-3 小時。小時。3 IPTG誘導(dǎo)誘導(dǎo)AK的表達(dá)的表達(dá) 實驗中在不同的培育時間用實驗中在不同的培育時間用OD值表值表征菌體密度參與征菌體密度參與 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度為當(dāng)溫度為22 ，OD=0.6-0.8時，時，IPTG終濃終濃度為度為0.5 mM時時AK的表達(dá)量到達(dá)最大。的表達(dá)量到達(dá)最大。4 蛋白質(zhì)提取蛋白質(zhì)提取1將上述各管于將上述各管于4 ，5000 r/m離心離心10分鐘；分鐘；2棄上清，使沉淀物質(zhì)重懸，每棄上清，使沉淀物質(zhì)重懸，每1 g 沉沉淀加淀加5 mL裂解液；裂解液；3在冰上進(jìn)展在冰上進(jìn)展10分鐘，間隔為分鐘，間隔為2秒鐘的秒鐘的超聲波破壁超聲波破壁,直到

17、沉淀變得廓清為止；直到沉淀變得廓清為止；4于于4 ，12000 rpm，離心，離心10分鐘，分鐘，取上清，得到取上清，得到AK的粗提液。的粗提液。5 His-tag Ni親和層析法純化交融蛋白親和層析法純化交融蛋白預(yù)處置：預(yù)處置：(1)用用2 M鹽酸胍鹽酸胍10 mL與樹脂打散混合洗滌；與樹脂打散混合洗滌；(2)用用Stripping Buffer洗洗20分鐘；蒸餾水洗分鐘；蒸餾水洗30分鐘；分鐘；(3)1.5 M鹽酸胍洗鹽酸胍洗30分鐘，蒸餾水洗分鐘，蒸餾水洗30分鐘；分鐘；(4)用用1 M NaOH洗洗1小時；用小時；用Binding Buffer洗洗20分鐘；蒸餾水洗分鐘；蒸餾水洗30分

18、鐘；分鐘；(5)用用1.5 M NaCl洗洗1小時；用小時；用Binding Buffer洗洗20分鐘；蒸餾水洗分鐘；蒸餾水洗30分鐘；分鐘；(6)Ni柱再生：柱再生：150 mL 0.1 M NiSO4洗洗蒸餾蒸餾水洗穿流液無色水洗穿流液無色Binding Buffer平衡平衡。 平衡：平衡：6 6倍柱床體積倍柱床體積Binding BufferBinding BufferpH=8.0pH=8.0平衡。平衡。上樣：插上樣：插A280A280濾光片，調(diào)濾光片，調(diào)A A值值0 0、T T值值100100；翻開采集；翻開采集器；翻開電腦蛋白核酸檢測系統(tǒng)，保管文檔并按開場采集。器；翻開電腦蛋白核酸檢

19、測系統(tǒng)，保管文檔并按開場采集。將粗提液將粗提液45 mL45 mL上柱，流速約為上柱，流速約為1.6-1.8 mL/min1.6-1.8 mL/min。 洗脫：上樣完后，繼續(xù)用洗脫：上樣完后，繼續(xù)用Binding Buffer Binding Buffer pH=8.0pH=8.0淋洗。淋洗。待雜蛋白峰回落走平之后開場用不同梯度的咪唑待雜蛋白峰回落走平之后開場用不同梯度的咪唑20 mM20 mM、40 mM40 mM、80 mM80 mM、100 mM100 mM、150 mM150 mM洗脫。在洗脫。在280 nm280 nm處進(jìn)展延處進(jìn)展延續(xù)紫外檢測，根據(jù)微電腦記錄儀顯示曲線。分別搜集峰值的續(xù)紫外檢測，根據(jù)微電腦記錄儀顯示曲線。分別搜集峰值的洗脫液根據(jù)波峰對每管搜集蛋白測活并留樣、電泳檢測純化洗脫液根據(jù)波峰對每管搜集蛋白測活并留樣、電泳檢測純化程度。程度。 6 AK的檢測的檢測SDS-PAGE電泳：電泳：1安裝雙垂直板電泳槽；安裝雙垂直板電泳槽； 2配配12%的分別膠的分別膠5 mL，濃縮膠，濃縮膠3 mL；3制樣：取樣品制樣：取樣品20 L與樣品緩沖液與樣品緩沖液10 L混合，混合，100 加熱加熱5分鐘；分鐘；4上樣：用微量注射器加樣上樣：用微