酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)恩原實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?. 觀察底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響2. 觀察抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響3. 掌握用雙倒數(shù)作圖法測定堿性磷酸酶的Km值實(shí)驗(yàn)原理：一、底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響在溫度、pH及酶濃度恒定的條件下，底物濃度對(duì)酶的催化作用有很大的影響。在一般情況下，當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r(shí)，酶促反應(yīng)的速度(v)隨底物濃度的增加而迅速增加，但當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增加時(shí)，反應(yīng)速度的增加率就比較小，當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥侥撤N程度時(shí)反應(yīng)速度達(dá)到一個(gè)極限值(即最大速度Vmax)。底物濃度和反應(yīng)速度的這種關(guān)系可用米氏方程式來表示(Michaelis-Menten方程)即：Ke十生、口一

2、式中Vmax為最大反應(yīng)速度，Km為米氏常數(shù)，S為底物濃度當(dāng)v=Vmax/2時(shí)，則Km=S,Km是酶的特征性常數(shù)，測定Km是研究酶的一種重要方法。但是在一般情況下，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制成的是直角雙曲線，難以準(zhǔn)確求得Km和Vmax。若本實(shí)驗(yàn)以堿性磷酸酶為例，測定不同濃度底物時(shí)的酶活性，再根據(jù)1/v和1/的倒數(shù)作圖,計(jì)算出其Km值。二、抑制劑對(duì)酶促反映的影響凡能降低酶的活性，甚至使酶完全喪失活性的物質(zhì)，成為酶的抑制劑。酶的特異性抑制劑大致上分為可逆性和不可逆性兩類?？赡嫘砸种朴挚煞譃楦偁幮砸种坪头歉偁幮砸种频取８偁幮砸种苿┑淖饔锰攸c(diǎn)是使該酶的Km值增大，但對(duì)酶促反映的最大速度Vmax值無影響。非競爭性抑

3、制劑的作用特點(diǎn)是不影響與酶的結(jié)合，故其Km值不變，然而卻能降低其最大速度Vmax。本實(shí)驗(yàn)選取Na2HPO4作為堿性磷酸酶的抑制物，確定其抑制作用屬于哪種類型。實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)一:底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響1.取試管9支，將0.01mol/L基質(zhì)液稀釋成下列不同濃度：管號(hào)試劑(1)(2)(5)(6)(7)(9)0.01mol/L基質(zhì)液(ml)011111224蒸館水(mD4765434202.另取9支試管編號(hào)，做酶促反應(yīng):號(hào)試劑123456789吸尊上表稀釋基質(zhì)液1ml(1)(3)(6)(7)pH10碳酸鈉緩沖液(ml)0.90.90.90.90.90.90.90.90.93.混勻，37水浴保溫

4、5分鐘左右。酶液(ml)0.10.10.10.10J00.100pHW碳酸鈉緩沖液(ml)010/1610/1410/1210/1010/810/610/410/24. 加入酶液后立即計(jì)時(shí)，各管混勻后在37°C準(zhǔn)確保溫15分鐘。5. 保溫結(jié)束，立即加入0.5mol/LNaOH1.0ml以中止反應(yīng)。各管分別加入0.3%4-氨基安替比林1.0ml及0.5%鐵氰化鉀2.0ml。0.5mol/LNaOH(ml)LO1.01.01.01.0L01.01.0LO0.3%4-氨基安替比林(門L0L01.01.01.01.01.0EOLO0一5%鐵貳化鉀(ml)2,02,02.02.02.02.02

5、.02.02.06.充分混勻，放置10分鐘，以管1為對(duì)照，于波長510nm處比色。讀取各管吸光度，做記錄。(酶活性計(jì)算及Km值計(jì)算)實(shí)驗(yàn)計(jì)算：1.在37°C下保溫15分鐘產(chǎn)生1mg酚為1個(gè)酶活性單位，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出釋放的酚量(ug),以此計(jì)算處各管的酶活性(V)。2.以1/v為縱坐標(biāo)、1/S為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，求出酶的Km值。A00.1970.2270.2340.2900,3470,40764710.631V08.4439+72910.02912.42914.87117.44320.18627.0431/v/0.11811030.1000+0800,0670,0570,0500

6、,0371/S/1.6001.4001.2001.0000.8000.6000.4000.200Y=0.0581X+0.0242,Km=2.401實(shí)驗(yàn)二:抑制劑對(duì)酶促反映的影響1.取試管9支，將0.01mol/L基質(zhì)液稀釋成下列不同濃度:管號(hào)試劑(1)(2)(3)(4)(5)(6)<7)(8)(9)0.01mol/L基質(zhì)液(ml)011111224蒸帽水(ml)4765434202.另取試管9支，做酶促反應(yīng):管號(hào)試劑、123456789吸収上表稀釋基庚液1ml(2)(3)(4)(6)(7)(8)(9.)0,04mol/L磷酸氫二鈉(ml)0.10.10.10.10.10.10.10,10

7、.1pH10碳酸鈉緩沖液(ml)(IX0-K0$0.80.80.80.S0.S0.R3.混勻，37水浴保溫5分鐘左右。酶液(ml)0.10.10.10.100.10.10.10pH10碳酸鈉緩沖液(ml)010/1610/1410/1210/1010/810/610/410/24. 加入酶液后立即計(jì)時(shí)，各管混勻后在37°C準(zhǔn)確保溫15分鐘。5. 保溫結(jié)束，立即加入0.5mol/LNaOH1.0ml以中止反應(yīng)。各管分別加入0.3%4-氨基安替比林1.0ml及0.5%鐵氰化鉀2.0ml。0.5mol/LNaOH(ml)bO1.0LOLO1+OLOL0E0L003%4-氨基安替比林(ml)

8、1.01.01.01.01.0.01.01.01.00,5%鐵訊化鉀(ml)2.02.02.02.02.02.02.02.02.06.充分混勻，放置10分鐘，以管1為對(duì)照，于波長510nm處比色。讀取各管吸光度,并計(jì)算各管酶活性。實(shí)驗(yàn)計(jì)算：以酶活性單位(v)的倒數(shù)1/v為縱坐標(biāo)，以底物濃度的倒數(shù)1/S為橫坐標(biāo)，在方格紙上描點(diǎn),并連接各點(diǎn)，求該酶的Km值并與前面未加入抑制劑時(shí)測出的Km值作比較。A00,1540.1640,184a21d0.25503090.4240.602V06.6007.0297,8869.17110.92913+2431&17125.8001/v/0.1520.14

9、20.1270.1090.0920.0760.0550.0391/S/1.6001.4001.2001.0000.8000.6000.4000.200Y=0.0832X+0.024,Km=3.47實(shí)驗(yàn)分析：通過繪圖及分別計(jì)算無抑制劑與有抑制劑時(shí)酶的Km值，可發(fā)現(xiàn)，此抑制劑為競爭性抑制劑。通過繪圖發(fā)現(xiàn)，其兩條以1/v為縱坐標(biāo)、1/S為橫坐標(biāo)的直線截距幾乎相同，而加入抑制劑后，酶的Km值更大，此為競爭性抑制劑的特征：Vmax不變，Km變大。思考題一、除了雙倒數(shù)作圖外，你能舉出其它能將酶動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)做出直線圖的方法嗎？1.海涅斯-沃爾弗作圖法(Hanes-Wolffplot)2.伊迪-霍夫斯蒂作圖法(Eadie-Hofsteeplot)直線的斜率為-Km，直線的縱軸截距為Vmax二、為什么進(jìn)行此種酶動(dòng)力學(xué)測定時(shí)，所用各底物濃度不是按等差遞增？在酶濃度和其他反應(yīng)條件不變的情況下，反應(yīng)速率V對(duì)底物濃度S作圖呈矩形雙曲線。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，反應(yīng)速率與底物濃度成正比，反應(yīng)為一級(jí)反應(yīng)；隨著底物濃度的增高，反應(yīng)速率不再成正比例加速，反應(yīng)為混合級(jí)反應(yīng)；當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度，酶被底物所飽和，反應(yīng)速率不再增加，達(dá)最大速率，