生物制品-質(zhì)量標準內(nèi)容及結構確證內(nèi)容

1、精品整理生物技術藥物的質(zhì)控體系一質(zhì)量標準研究內(nèi)容檢定方法、質(zhì)控標準理化性質(zhì)：外觀（形狀、顏色、氣味）、pH均一性：純度、濃度鑒別結構確證效價：生物學活性、免疫學活性殘余雜質(zhì)：產(chǎn)品、工藝、環(huán)境相關的雜質(zhì)起草、制定制造與檢定規(guī)程研究建立國家標準品或參考品重組蛋白質(zhì)藥物質(zhì)量標準研究效價：生物學活性與比活性蛋白質(zhì)純度蛋白質(zhì)含量理化性質(zhì)鑒定（部分非常規(guī)）殘余雜質(zhì)安全性及其它項目一生物學活性及比活性測定（一）檢測意義獲取準確的效價信息，保證產(chǎn)品有效效價：有效性指標，反映藥品效力生物學活性才能真實反映生物技術藥效價原因：生物制品分子大、結構復雜、不穩(wěn)定，使得重量與效價不一致頁腳內(nèi)容精品整理生物制品技術藥：單

2、位（U、AU、IU）（二）生物學活性測定方法分類1、動物基礎的活性測定離體動物器官法：腦利鈉肽的兔主動脈體內(nèi)測定法：EPO的小鼠網(wǎng)織紅細胞2、細胞基礎的活性測定促細胞生長法：大多數(shù)細胞因子類抑制細胞生長法：細胞毒素、血管抑制劑間接保護細胞法：IFN保護WISH3、酶學基礎的活性測定：重組酶類4、受體-配體、抗原-抗體結合基礎的活性測定：抗原決定簇與活性中心常不一致（三）生物學活性測定方法選擇1、細胞培養(yǎng)法離體器官法體內(nèi)法2、細胞染色標記方法：MTT>3H-Thymidine>流式細胞儀（測細胞周期、凋亡）3、定量法半定量法定性法4、生物學活性不一定與臨床藥效類型一致工藝穩(wěn)定、測生物

3、活性特別復雜時，可替代。如rh-GH用HPLC（四）生物學活性測定（見藥典附錄XC）1、樣品：原液、成品2、方法：如上述（好好研究？）3、標準：不同生物活性測定方法的規(guī)定標準頁腳內(nèi)容精品整理測定方法動物基礎的活性測定細胞基礎的活性測定酶學基礎的活性測定結合反應的活性測定（五）蛋白質(zhì)藥物的比活性規(guī)定標準70%-130%標示量80%-120%標示量85%-115%標示量85%-115%標示量（見分生實驗冊77頁）？1、樣品：原液2、定義與計算：比活性：單位重量蛋白的活性單位數(shù)（IU/mg）3、標準：不小于。IU/mg4、意義：1）真實反映有活性的蛋白質(zhì)所占的比例廠家間、表達系統(tǒng)間、批間比較2）便于

4、配制成品二蛋白質(zhì)純度檢查樣品：原液方法：必須采用二種方法測定非還原SDS-PAGE法HPLC法標準：純度均須達到95%或98%以上非還原SDS-PAGE法測定純度（見藥典附錄IVC）SDS-PAGE:據(jù)分子大小分離樣品處理：樣品不加（3-ME或DTT頁腳內(nèi)容精品整理二硫鍵未打開，反映單體、二聚體或多聚體情況染色方法與上樣量銀染：5ug（檢測限為1-10ng）考馬斯亮藍R-250:10ug（檢測限為0.1ug）定量方法：凝膠掃描標準：無明顯雜帶，純度三95%或98%HPLC法測純度？（見藥典附錄出B）分析柱：反相柱、離子柱、分子篩應盡量采用反相柱或離子柱應注明采用的分析柱性質(zhì)上樣量：5ug標準：

5、出峰時間正確純度：三95%或98%三、蛋白質(zhì)含量測定（見藥典附錄VID）樣品：原液、成品方法：*Folin-酚試劑法（Lowry法）：（見分生實驗冊67-73頁）簡便、靈敏、優(yōu)先采用，靈敏度：5-100ug/ml*染色法（Bradford法）：考馬斯亮藍G-250,簡便靈敏，25-200ug/mlBCA（二唾咻甲酸）法：操作簡單，比Lowry法快4倍且更加方便，準確靈敏：20200ug/ml,微量BCA的測定范圍在0.510ug/ml。經(jīng)濟適用，抗試劑干擾能力比較強。紫外分光廣度法：頁腳內(nèi)容精品整理用于原液比活性計算和成品規(guī)格控制四、蛋白質(zhì)藥物理化性質(zhì)鑒定（一）特異性鑒別試驗1、樣品：原液和成

6、品2、方法：免疫印跡法WesternBlotDotBlot3、標準：應該陽性（二）相對分子量測定1、樣品：原液2、方法：還原型SDS-PAGE（見分生實驗冊51頁、見藥典附錄IVC）、質(zhì)譜法3、標準：1）理論值士10%范圍2）批與批間一致（三）等電點測定（見藥典附錄IVD）1、樣品：原液2、方法：IEF:常規(guī)等電聚膠電泳（見分生實驗冊55-57頁）CE:毛細管電泳3、標準：1）有明顯主帶2）理論值士0.5pH范圍3）批與批間一致（四）紫外吸收光譜分析（見藥典附錄nA）頁腳內(nèi)容精品整理1、樣品：原液2、方法：紫外掃描3、標準：1）最大吸收波長與特征波長一致2）批與批間一致（五）肽圖分析（非常規(guī)）

7、（見藥典附錄叫E）1、樣品：原液2、方法：澳化富/胰蛋白酶裂解+HPLC/SDS-PAGE/CE/質(zhì)譜法3、標準：1）有特征性圖譜2）批與批間一致（六）氨基酸組成分析（非常規(guī)）1、樣品：原液2、方法：HCl/NaOH水解（僅用于Trp測定）+氨基酸自動分析儀3、標準：1）與理論值一致2）批與批間一致（七）氨基酸序列分析（非常規(guī)）1、樣品：原液2、方法：頁腳內(nèi)容精品整理N末端：15個殘基，Edman化學降解法，蛋白質(zhì)全自動測序儀C末端：1-3個殘基硫富酸酯/竣肽酶降解法，RP-HPLC3、標準：1）與理論值一致2）批與批間一致（八）其它：二硫鍵、糖基化（非常規(guī)）五、殘余雜質(zhì)檢測（一）宿主相關雜質(zhì)

8、宿主細胞蛋白含量：（見藥典附錄IXC）1、樣品：原液、成品2、方法：雙抗體夾心ELISA:用HAS作保護宿主蛋白標準品：中檢所提供3、標準：1）大腸桿菌w0.1%2）CHO<0.05%宿主細胞DNA含量（見藥典附錄IXB）1、樣品：原液、成品2、方法：DNA點印跡雜交法，地高辛標記DNA標準品：廠家提供頁腳內(nèi)容精品整理3、標準：DNA含量10ng劑量細菌內(nèi)毒素含量（見藥典附錄刈E凝膠限量實驗）1、樣品：原液、成品2、方法：宜試劑分析法賞試劑標準品：中檢所提供3、標準：內(nèi)毒素含量W10EU/劑量（二）工藝相關雜質(zhì)（見藥典附錄IXA）如殘余抗生素、IgG、蛋白A、小牛血清（三）產(chǎn)品相關雜質(zhì)如

9、多聚體、不同的PEG修飾產(chǎn)物六、安全性及其它檢測項目（一）無菌試驗平皿法，需氧菌、厭氧菌、真菌、支原體（二）熱原試驗賞試劑法或家兔法（三）異常毒性試驗小鼠（1ml）或豚鼠（5ml）,腹腔注射（四）水分、裝量、pH值原液質(zhì)量標準生物學活性、比活性（見藥典附錄XC）蛋白質(zhì)含量（見藥典附錄VID）頁腳內(nèi)容精品整理純度：三95%,非還原SDS-PAGE法（見藥典附錄IVC）、HPLC法（見藥典附錄加B）分子量：還原型SDS-PAGE法（見藥典附錄IVC）、質(zhì)譜法外源性DNA殘留量：w10ng劑量（見藥典附錄IXB）宿主蛋白殘留量：三0.1%,0.05%（見藥典附錄IXC）殘余抗生素：不得檢出（見藥典附錄IXA）細菌內(nèi)毒素：10EU/劑量（見藥典附錄刈E凝膠限量實驗）結構確證：等電點（見藥典附錄IVD）、紫外吸收