免疫學(xué)診斷技術(shù)

1、醫(yī)療器械基礎(chǔ)知識及免疫學(xué)診斷技術(shù)濟(jì)南卓冠生物技術(shù)有限公司濟(jì)南卓冠生物技術(shù)有限公司目錄 醫(yī)療器械基礎(chǔ)知識醫(yī)療器械基礎(chǔ)知識 體外診斷試劑分類體外診斷試劑分類 膠體金技術(shù)簡介膠體金技術(shù)簡介 酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)簡介酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)簡介一 醫(yī)療器械基礎(chǔ)知識 1 1、醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例于、醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例于19991999年年1212月月2828日國務(wù)院第日國務(wù)院第2424次常務(wù)會議通過，次常務(wù)會議通過，20002000年年4 4月月1 1日起施行。日起施行。 2 2、醫(yī)療器械：醫(yī)療器械是指單獨或者組合適用于人體的儀、醫(yī)療器械：醫(yī)療器械是指單獨或者組合適用于人體的儀器、設(shè)備、器具、材料或者其他物品，包

2、括所需要的軟件；器、設(shè)備、器具、材料或者其他物品，包括所需要的軟件；其用于人體體表及體內(nèi)的作用不是用藥理學(xué)、免疫學(xué)或者新其用于人體體表及體內(nèi)的作用不是用藥理學(xué)、免疫學(xué)或者新陳代謝的搜段獲得，但是可能有這些手段參與并起一定的輔陳代謝的搜段獲得，但是可能有這些手段參與并起一定的輔助作用；助作用； 其使用旨在達(dá)到下列預(yù)期目的：其使用旨在達(dá)到下列預(yù)期目的： （1 1）對疾病的預(yù)防、診斷、治療、監(jiān)護(hù)、緩解）對疾病的預(yù)防、診斷、治療、監(jiān)護(hù)、緩解 ； （2 2）對損傷或者殘疾的診斷、治療、監(jiān)護(hù)、緩解、補償；）對損傷或者殘疾的診斷、治療、監(jiān)護(hù)、緩解、補償； （3 3）對解剖或者生理過程的研究、替代、調(diào)節(jié)；）對

3、解剖或者生理過程的研究、替代、調(diào)節(jié)； （4 4）妊娠控制。）妊娠控制。1.1醫(yī)療器械分類 醫(yī)療器械按照其醫(yī)療器械分類判定的依據(jù)醫(yī)療器械按照其醫(yī)療器械分類判定的依據(jù) （一）醫(yī)療器械依據(jù)其結(jié)構(gòu)特征分為：有源器械和無源（一）醫(yī)療器械依據(jù)其結(jié)構(gòu)特征分為：有源器械和無源器械。器械。 （二）根據(jù)不同的預(yù)期目的，可將醫(yī)療器械歸入一定的（二）根據(jù)不同的預(yù)期目的，可將醫(yī)療器械歸入一定的使用形式。使用形式。 無源器械的使用形式有：醫(yī)用敷料；外科器械；重復(fù)使無源器械的使用形式有：醫(yī)用敷料；外科器械；重復(fù)使用外科器械；一次性無菌器械；植入器械；護(hù)理器械、用外科器械；一次性無菌器械；植入器械；護(hù)理器械、體外診斷試劑、其

4、他無源接觸或無源輔助器械等。體外診斷試劑、其他無源接觸或無源輔助器械等。 有源器械的使用形式有：診斷監(jiān)護(hù)器械；輸送體液器械；有源器械的使用形式有：診斷監(jiān)護(hù)器械；輸送體液器械；實驗室儀器設(shè)備、醫(yī)療消毒設(shè)備；其他有源器械或有源實驗室儀器設(shè)備、醫(yī)療消毒設(shè)備；其他有源器械或有源輔助器械等。輔助器械等。 （三）根據(jù)使用中對（三）根據(jù)使用中對人體產(chǎn)生損傷的可能人體產(chǎn)生損傷的可能性、對醫(yī)療效果的影性、對醫(yī)療效果的影響，醫(yī)療器械使用狀響，醫(yī)療器械使用狀況可分為接觸或進(jìn)入況可分為接觸或進(jìn)入人體器械和非接觸人人體器械和非接觸人體器械。體器械。 根據(jù)醫(yī)療器械的危險性：根據(jù)醫(yī)療器械的危險性： 第一類是指，通過常規(guī)管理

5、足以保證其安全性、有效性第一類是指，通過常規(guī)管理足以保證其安全性、有效性的醫(yī)療器械；的醫(yī)療器械； 第二類是指，對其安全性、有效性應(yīng)當(dāng)加以控制的醫(yī)療第二類是指，對其安全性、有效性應(yīng)當(dāng)加以控制的醫(yī)療器械；器械； 第三類是指，用于支持、維持生命；對人體具有潛在危第三類是指，用于支持、維持生命；對人體具有潛在危險，對其安全性、有效性必須嚴(yán)格控制的醫(yī)療器械。險，對其安全性、有效性必須嚴(yán)格控制的醫(yī)療器械。1.2醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)當(dāng)符合下列條件： 具有與其生產(chǎn)的醫(yī)療器械相適應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員；具有與其生產(chǎn)的醫(yī)療器械相適應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員； 具有與其生產(chǎn)的醫(yī)療器械相適應(yīng)的生產(chǎn)場地及環(huán)境；具有與其生產(chǎn)的醫(yī)療器械相適

6、應(yīng)的生產(chǎn)場地及環(huán)境； 具有與其生產(chǎn)的醫(yī)療器械相適應(yīng)的生產(chǎn)設(shè)備；具有與其生產(chǎn)的醫(yī)療器械相適應(yīng)的生產(chǎn)設(shè)備； 具有對其生產(chǎn)的醫(yī)療器械產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量檢驗的機構(gòu)或者具有對其生產(chǎn)的醫(yī)療器械產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量檢驗的機構(gòu)或者人員及檢驗設(shè)備。人員及檢驗設(shè)備。1.3醫(yī)療器械經(jīng)營企業(yè)應(yīng)當(dāng)符合下列條件 具有與其經(jīng)營的醫(yī)療器械相適應(yīng)的經(jīng)營場地及環(huán)境；具有與其經(jīng)營的醫(yī)療器械相適應(yīng)的經(jīng)營場地及環(huán)境；具有與其經(jīng)營的醫(yī)療器械相適應(yīng)的質(zhì)量檢驗人員；具有與其經(jīng)營的醫(yī)療器械相適應(yīng)的質(zhì)量檢驗人員；具有與其經(jīng)營的醫(yī)療器械產(chǎn)品相適應(yīng)的技術(shù)培訓(xùn)、維修具有與其經(jīng)營的醫(yī)療器械產(chǎn)品相適應(yīng)的技術(shù)培訓(xùn)、維修等售后服務(wù)能力。等售后服務(wù)能力。 二 體外診斷試劑

7、2.1 2.1 定義 體外診斷（體外診斷（IVDIVD，In Vitro DiagnosisIn Vitro Diagnosis）試劑，包）試劑，包括可單獨使用或與儀器、器具、設(shè)備或系統(tǒng)組合使括可單獨使用或與儀器、器具、設(shè)備或系統(tǒng)組合使用，在疾病的預(yù)防、診斷、治療監(jiān)測、預(yù)后觀察、用，在疾病的預(yù)防、診斷、治療監(jiān)測、預(yù)后觀察、健康狀態(tài)評價以及遺傳性疾病的預(yù)測過程中，在人健康狀態(tài)評價以及遺傳性疾病的預(yù)測過程中，在人體之外通過對人體的樣本（如血液、體液、組織等）體之外通過對人體的樣本（如血液、體液、組織等）進(jìn)行檢測而獲取臨床診斷信息的產(chǎn)品和服務(wù)，包括進(jìn)行檢測而獲取臨床診斷信息的產(chǎn)品和服務(wù)，包括儀器、試

8、劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品等。原理是通過試劑儀器、試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品等。原理是通過試劑和體內(nèi)物質(zhì)在體外的反應(yīng)強度或速度來判斷體內(nèi)物和體內(nèi)物質(zhì)在體外的反應(yīng)強度或速度來判斷體內(nèi)物質(zhì)的性質(zhì)和數(shù)量，通過和標(biāo)準(zhǔn)品的比較來判斷人體質(zhì)的性質(zhì)和數(shù)量，通過和標(biāo)準(zhǔn)品的比較來判斷人體的生理狀態(tài)。的生理狀態(tài)。 1.1.臨床生化試劑：臨床生化試劑： 用化學(xué)方法使樣本產(chǎn)生變化，通過測吸用化學(xué)方法使樣本產(chǎn)生變化，通過測吸光度，波長及顏色反應(yīng)等進(jìn)行疾病的診斷、治療和監(jiān)控；光度，波長及顏色反應(yīng)等進(jìn)行疾病的診斷、治療和監(jiān)控； 2.2.免疫診斷試劑：免疫生物學(xué)發(fā)展很快，利用抗原和抗體免疫診斷試劑：免疫生物學(xué)發(fā)展很快，利用抗原和抗體的特異

9、性反應(yīng)的原理進(jìn)行疾病的診斷；的特異性反應(yīng)的原理進(jìn)行疾病的診斷；2.2 2.2 體外診斷試劑的分類體外診斷試劑的分類 3.3.分子診斷試劑：分子診斷試劑： 應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測患者體內(nèi)遺傳應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平的變化而做出診斷的技術(shù)，稱為分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平的變化而做出診斷的技術(shù)，稱為分子診斷。診斷。 4.4.功能檢測試劑：如血凝試劑，看凝血狀態(tài)是否正常。功能檢測試劑：如血凝試劑，看凝血狀態(tài)是否正常。 5.5.其他：細(xì)胞染色切片，鏡像等其他：細(xì)胞染色切片，鏡像等2.3 免疫學(xué)診斷試劑的類型 1.1.按方法分為間接免疫學(xué)試劑和直接免疫學(xué)試劑（如雙抗體按方法分為

10、間接免疫學(xué)試劑和直接免疫學(xué)試劑（如雙抗體夾心法，雙抗原夾心法，間接法，競爭法等）；夾心法，雙抗原夾心法，間接法，競爭法等）； 2.2.按示蹤劑分為放射免疫法，酶聯(lián)免疫法，熒光法，化學(xué)發(fā)按示蹤劑分為放射免疫法，酶聯(lián)免疫法，熒光法，化學(xué)發(fā)光法，膠體金法，乳膠法等；光法，膠體金法，乳膠法等； 免疫層析膠體金技術(shù)是出現(xiàn)于免疫層析膠體金技術(shù)是出現(xiàn)于2020世紀(jì)世紀(jì)8080年代初期的一種年代初期的一種獨特的免疫分析方式獨特的免疫分析方式, ,該方法的核心技術(shù)是以條狀纖維層析該方法的核心技術(shù)是以條狀纖維層析材料為固相材料為固相, ,通過毛細(xì)管作用使樣品溶液在層析材料上泳動通過毛細(xì)管作用使樣品溶液在層析材料上

11、泳動, ,并同時使樣品中經(jīng)標(biāo)記物標(biāo)記的待測物與包被在層析材料上并同時使樣品中經(jīng)標(biāo)記物標(biāo)記的待測物與包被在層析材料上針對待測物的受體針對待測物的受體( (如抗原或抗體如抗原或抗體) )發(fā)生高特異、高親和性的發(fā)生高特異、高親和性的免疫。免疫。三 膠體金技術(shù)簡介1 1 膠體金標(biāo)記技術(shù)的相關(guān)定義l1.1 1.1 定義定義l免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù) 是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種免疫標(biāo)記技術(shù)。是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種免疫標(biāo)記技術(shù)。l膠體金標(biāo)記膠體金標(biāo)記膠體金標(biāo)記，實質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過膠體金標(biāo)記，實質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒

12、表面的包被過程。吸附機理一般認(rèn)為是膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)程。吸附機理一般認(rèn)為是膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。膠體金顆粒對蛋白質(zhì)有很強的吸附功能，而膠體金顆粒對蛋白質(zhì)有很強的吸附功能，而不被壞其生物活性，可以與蛋白質(zhì)等（葡萄不被壞其生物活性，可以與蛋白質(zhì)等（葡萄球菌球菌A A蛋白、免疫球蛋白）等非共價結(jié)合，蛋白、免疫球蛋白）等非共價結(jié)合，形成膠體金標(biāo)記物。形成膠體金標(biāo)記物。 1.2 1.2 透射電鏡下觀察金顆粒的形狀劣質(zhì)金外形不均一，且非球形，有劣質(zhì)金外形不均一，且非球形，有凝集現(xiàn)象，顆粒間變異系數(shù)較大凝集現(xiàn)象，

13、顆粒間變異系數(shù)較大 2 2 膠體金的制備量取量取200ml超純水，加熱至沸騰，并保持微沸。超純水，加熱至沸騰，并保持微沸。加入加入15ml1%檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)煮沸檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)煮沸5分鐘。分鐘。加入加入1%的氯金酸的氯金酸5ml,繼續(xù)煮沸，待顏色有變化繼續(xù)煮沸，待顏色有變化后計時，煮沸后計時，煮沸10min。停止攪拌，冷卻至室溫。停止攪拌，冷卻至室溫。2.12.1膠體金粒徑的大小與還原劑的量有關(guān)系 粒子大小不同，光吸收性不同，顏色亦不同。粒子大小不同，光吸收性不同，顏色亦不同。 1 1檸檬酸三鈉檸檬酸三鈉ml 0.30 0.45 0.70 ml 0.30 0.45 0.70 1.00

14、1.00 1.50 2.00 1.50 2.00 金溶膠顏色金溶膠顏色 藍(lán)灰藍(lán)灰 紫灰紫灰 紫紅紫紅 紅紅 橙紅橙紅 橙橙 吸收峰吸收峰(nm) 220 240 535 (nm) 220 240 535 525 525 522 518 522 518 徑粒徑粒(nm) 147 97.5 71.5 (nm) 147 97.5 71.5 40 40 24.5 15 24.5 15 3.3.制備高質(zhì)量膠體金的注意事項制備高質(zhì)量膠體金的注意事項（試試劑劑 4 4 膠體金技術(shù)的種類及特點膠體金技術(shù)的種類及特點 4.1 4.1 快速免疫金滲濾法快速免疫金滲濾法 主要由兩部分組成：膜滲濾裝置和標(biāo)記結(jié)合物。前

15、者為一主要由兩部分組成：膜滲濾裝置和標(biāo)記結(jié)合物。前者為一塑料小盒，其中填滿吸水性物質(zhì)，面上緊貼放置一片吸附塑料小盒，其中填滿吸水性物質(zhì)，面上緊貼放置一片吸附有抗體有抗體( (以雙抗體夾心法測抗原為例以雙抗體夾心法測抗原為例) )的硝酸纖維膜，標(biāo)記的硝酸纖維膜，標(biāo)記結(jié)合物為免疫金。用微孔濾膜作載體，先將抗原或抗體點結(jié)合物為免疫金。用微孔濾膜作載體，先將抗原或抗體點于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標(biāo)記的抗體于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標(biāo)記的抗體檢測相應(yīng)的抗原或抗體檢測相應(yīng)的抗原或抗體 。斑點金免疫滲濾斑點金免疫滲濾 4 4.2 .2 免疫層析法免疫層析法 以硝酸纖維素膜為載體，

16、利用了微孔膜的毛細(xì)血管作用，滴以硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細(xì)血管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，通過抗原抗體結(jié)合，加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，通過抗原抗體結(jié)合，并利用膠體金呈現(xiàn)顏色（紅色）反應(yīng)，檢測抗原并利用膠體金呈現(xiàn)顏色（紅色）反應(yīng)，檢測抗原/抗體?？贵w。襯板樣品墊金標(biāo)墊吸收墊膜膠體金免疫層析試紙條的構(gòu)成膠體金免疫層析試紙條的構(gòu)成 Goldtestcontrol標(biāo)準(zhǔn)抗原標(biāo)準(zhǔn)抗原Goldtestcontrol 其檢測原理與上述的其它方法有所不同：膠體金其檢測原理與上述的其它方法有所不同：膠體金顆粒標(biāo)記單克隆抗體，而檢測線包被小分子抗原，顆粒標(biāo)記單克隆抗體，而檢測線

17、包被小分子抗原，質(zhì)控線包被抗鼠質(zhì)控線包被抗鼠IgGIgG。檢測時，樣本中的待檢抗。檢測時，樣本中的待檢抗原首先與金標(biāo)抗體結(jié)合，上行到達(dá)檢測帶時，如原首先與金標(biāo)抗體結(jié)合，上行到達(dá)檢測帶時，如待檢抗原把一定量的抗體完全飽和，則金標(biāo)抗體待檢抗原把一定量的抗體完全飽和，則金標(biāo)抗體將不能與檢測帶的抗原結(jié)合，不會出現(xiàn)肉眼可見將不能與檢測帶的抗原結(jié)合，不會出現(xiàn)肉眼可見的紅色條帶，為陽性結(jié)果。如標(biāo)本中無待檢抗原，的紅色條帶，為陽性結(jié)果。如標(biāo)本中無待檢抗原，則金標(biāo)抗體與檢測帶的抗原結(jié)合，形成紅色條帶，則金標(biāo)抗體與檢測帶的抗原結(jié)合，形成紅色條帶，為陰性結(jié)果。為陰性結(jié)果。 選用該方法應(yīng)特別注意膠體金顆選用該方法應(yīng)特

18、別注意膠體金顆粒的抗體吸附量及包被抗原量。粒的抗體吸附量及包被抗原量。 間接法間接法p測定時將試紙條下端浸入液體標(biāo)本中，下測定時將試紙條下端浸入液體標(biāo)本中，下端吸水材料即吸取液體向上端移動，流經(jīng)端吸水材料即吸取液體向上端移動，流經(jīng)C C處時使干片上的處時使干片上的免疫金復(fù)合物免疫金復(fù)合物復(fù)溶，并復(fù)溶，并帶動其向膜條滲移。帶動其向膜條滲移。雙抗體夾心法為例 若標(biāo)本中有待測特異抗原，即可與免疫金若標(biāo)本中有待測特異抗原，即可與免疫金復(fù)合物中的抗體結(jié)合，此抗原抗體復(fù)合物復(fù)合物中的抗體結(jié)合，此抗原抗體復(fù)合物流至測試區(qū)即被固相抗體捕獲，在膜上顯流至測試區(qū)即被固相抗體捕獲，在膜上顯出紅色出紅色反應(yīng)線條反應(yīng)線

19、條（T T）。）。 過剩的免疫金復(fù)合物繼續(xù)前行，至參照區(qū)過剩的免疫金復(fù)合物繼續(xù)前行，至參照區(qū)與固相抗小鼠與固相抗小鼠IgGIgG結(jié)合（免疫金復(fù)合物中的結(jié)合（免疫金復(fù)合物中的單克隆抗體為小鼠單克隆抗體為小鼠IgGIgG），而顯出紅色），而顯出紅色質(zhì)控質(zhì)控線條線條（R R）。）。 陰性標(biāo)本則無反應(yīng)線條，而僅顯示質(zhì)控線陰性標(biāo)本則無反應(yīng)線條，而僅顯示質(zhì)控線條。條。 4.2.1 4.2.1 結(jié)果判定圖示卡型4.2.2 4.2.2 結(jié)果判定圖示條型4.2.3 4.2.3 結(jié)果判定說明陽性結(jié)果：出現(xiàn)質(zhì)控線和反應(yīng)線兩條紫紅色線，實驗結(jié)果為陽性。陽性結(jié)果：出現(xiàn)質(zhì)控線和反應(yīng)線兩條紫紅色線，實驗結(jié)果為陽性。陰性結(jié)果

20、：僅出現(xiàn)一條紫紅色質(zhì)控線，實驗結(jié)果為陰性。陰性結(jié)果：僅出現(xiàn)一條紫紅色質(zhì)控線，實驗結(jié)果為陰性。無效：不出現(xiàn)質(zhì)控線紅線或僅出現(xiàn)一條反應(yīng)線紅線，實驗結(jié)果為無效：不出現(xiàn)質(zhì)控線紅線或僅出現(xiàn)一條反應(yīng)線紅線，實驗結(jié)果為無效結(jié)果，應(yīng)重試。無效結(jié)果，應(yīng)重試。競爭法的結(jié)果判定則相反競爭法的結(jié)果判定則相反5 5 免疫膠體金技術(shù)的特點p簡捷快速：簡捷快速：操作簡單，一般只要操作簡單，一般只要5-10min 5-10min 就會出結(jié)果，而其就會出結(jié)果，而其它方法如它方法如ELISAELISA需要需要1-2h1-2h，PCR PCR 需要時間更長。需要時間更長。p結(jié)果易于判定：結(jié)果易于判定：陰、陽性呈色很明顯，肉眼很容易

21、判斷。陰、陽性呈色很明顯，肉眼很容易判斷。p特異性好：特異性好：因為該技術(shù)大多用單克隆抗體標(biāo)記，這決定了它因為該技術(shù)大多用單克隆抗體標(biāo)記，這決定了它具有很好的特異性。具有很好的特異性。6 6 膠體金技術(shù)的應(yīng)用膠體金技術(shù)的應(yīng)用 7 相關(guān)儀器 噴膜儀儀器參數(shù)儀器尺寸為： 430mmx410mmX360mm平臺大小: 450mmX70mm 平臺移動速度: 0-330mm/sec X、Y、Z軸移動誤差: 50um 定位精度: 10um in 1 axis;25um in 2 axis 噴點方式 BJQ3000: 非接觸噴點AJQ3000: 非接觸噴點 劃線寬度 BJQ3000:0.50mm/line

22、（噴點0.20mm/drop）AJQ3000: 0.5-5mm 最小噴量 BJQ3000:10nl/dropAJQ3000:1ul/cm 劃線精密度BJQ3000:1%AJQ3000: 2% 切條機儀器參數(shù):進(jìn)料寬度：100 mm進(jìn)料長度：不限,可連續(xù)進(jìn)料切割切割寬度：1 mm, 寬度連續(xù)可調(diào)切割寬度設(shè)定位數(shù)：0.01 mm切割精度：0.1 mm切割速度：230次/分鐘, 速度連續(xù)可調(diào)切條計數(shù)：單次工作和總工作分別計數(shù)刀片: 日本進(jìn)口, 耐磨高碳鋼材料抗靜電裝置：建議選配電源：220VAC重量：20KG尺寸：430(L)330(W)260(H) mm 它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接

23、，然后它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對象可通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。以是抗體也可以是抗原。 在這種測定方法中有在這種測定方法中有3種必要的試劑：種必要的試劑： 固相的抗原或抗體（固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）免疫吸附劑） 酶標(biāo)記的抗原或抗體（酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）標(biāo)記物） 酶作用的底物（酶作用的底物（顯色劑）顯色劑）四四 酶聯(lián)免疫檢測酶聯(lián)免疫檢測（ELISA)ELISA)技術(shù)簡介技術(shù)簡介1. ELISA1. ELISA的原理的原理 測量時，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但測量

24、時，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。 其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。含量成正比。 這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子這種

25、有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標(biāo)儀）加顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標(biāo)儀）加以測定。以測定。 其方法簡單，特異性強。其方法簡單，特異性強。2 2ELISAELISA的類型的類型2.1 雙抗原夾心法測抗體雙抗原夾心法測抗體用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。2.2 2.2 雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法測抗原反應(yīng)原理和模式與雙抗原夾心法類似。用特異性抗體進(jìn)行包反應(yīng)原理和模式與雙抗原夾心

26、法類似。用特異性抗體進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗原。與間接法測抗體的被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗原。與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗體代替酶標(biāo)抗抗體。不同之處為以酶標(biāo)抗體代替酶標(biāo)抗抗體。2.3 2.3 間接法測抗體間接法測抗體 間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（二抗）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。（二抗）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。2.4 2.4 競爭法測抗原競爭法測抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心

27、法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。愈少，最后的顯色也愈淺。2.5 2.5 捕獲法測捕獲法測IgMIgM抗體抗體 3 ELISA3 ELISA的試劑制備及操作的試劑制備及操作 以雙抗體夾心法為例以雙抗體夾心法為例獲得待分析物的未標(biāo)定抗體獲得待分析物的未標(biāo)定抗體將特異性抗體與固相將特異性抗體與固相載體連

28、接形成固相抗體載體連接形成固相抗體 洗滌除去未結(jié)合的洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)抗體及雜質(zhì) 加入封閉蛋白溶液以封閉載體加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點表面殘留的蛋白結(jié)合位點洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白加受檢標(biāo)本（抗原）形成加受檢標(biāo)本（抗原）形成固相抗體抗原復(fù)合物固相抗體抗原復(fù)合物 洗滌除去其他洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)未結(jié)合的物質(zhì) 加酶標(biāo)抗體生成加酶標(biāo)抗體生成抗體抗體待測抗原待測抗原酶標(biāo)記抗體酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物的復(fù)合物 加底物進(jìn)行加底物進(jìn)行酶催化反應(yīng)酶催化反應(yīng) 根據(jù)顏色反應(yīng)的根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測定的定性或定量測定4.4.特點特點4.14.1特異性特異性 抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點之間?？乖贵w的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補關(guān)系，具有高度的特異性。化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補關(guān)系，具有高度的特異性。 測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待