檢測技術及梅毒實驗室檢測技術

1、艾滋病檢測技術廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院檢驗科詹鈾超窗口期窗口期HIVHIV感染后的血清學動態(tài)感染后的血清學動態(tài)Anti-P24HIV RNA感染感染 1周周 2周周 3周周 4周周1年年 2年年 3年年.1 0年年.急性期急性期潛伏期潛伏期Anti-gp41/120(anti-gp36)Ag艾滋病期艾滋病期Ab濃濃度度試驗室假陰性報告的原因分析窗口期窗口期非典型血清學轉換非典型血清學轉換病毒變異病毒變異實驗室誤差實驗室誤差實驗室進行艾滋病抗體篩查很很多的原因可能造成漏檢, 曾經(jīng)有文獻具體分析過造成漏檢的原因, 主要原因有因為窗口期的原因造成漏檢, 因為病毒變異以及實驗室誤差等原因造成的漏檢.

2、其中最主要的原因是因為窗口期的問題造成的漏檢. 占整體比例的93.7%. 篩篩 查查 試試 驗驗復復 核核 檢檢 測測確確 證證 試試 驗驗檢測程序及流程圖檢測程序及流程圖 HIV抗體篩查檢測流程抗體篩查檢測流程樣品樣品初篩試驗初篩試驗篩查試劑篩查試劑陽性反應陽性反應陰性反應陰性反應復檢試驗復檢試驗原有試劑原有試劑 + +另一不同原理另一不同原理（或廠家或廠家 ）試劑或另外兩種試劑或另外兩種不同原理不同原理 （或廠家或廠家 ）試劑試劑均陽性反應均陽性反應一陰一陽一陰一陽均陰性反應均陰性反應確證試驗確證試驗報告陰性報告陰性酶聯(lián)免疫吸附試驗（酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）化學發(fā)光法化學發(fā)光法快速檢

3、測及其它檢測快速檢測及其它檢測 明膠顆粒凝集試驗（明膠顆粒凝集試驗（PA） 免疫滲濾試驗：斑點免疫滲濾試驗：斑點ELISA和斑點免疫膠體金（或膠體硒）快速試和斑點免疫膠體金（或膠體硒）快速試驗驗電化學發(fā)光試驗電化學發(fā)光試驗其它快速篩查試驗方法其它快速篩查試驗方法艾滋病唾液尿液檢測試劑艾滋病唾液尿液檢測試劑初篩檢測方法初篩檢測方法酶聯(lián)免疫試驗酶聯(lián)免疫試驗 ( ELISA ) p（1）膠體金（膠體硒）法）膠體金（膠體硒）法p（2）明膠凝集法）明膠凝集法p（3）斑點印跡試驗）斑點印跡試驗p（4）電化學發(fā)光法）電化學發(fā)光法快速檢測方法快速檢測方法（1）膠體金法）膠體金法p原理：采用雙抗原夾心法免疫測定

4、原理，使用純化原理：采用雙抗原夾心法免疫測定原理，使用純化HIV-1/2HIV-1/2基因重組抗原，分別固定于硝酸纖基因重組抗原，分別固定于硝酸纖維膜上，作為檢測線，并且用這些抗原標記膠體金。當待檢樣本中存在維膜上，作為檢測線，并且用這些抗原標記膠體金。當待檢樣本中存在HIVHIV抗體時，先和金標抗體時，先和金標記抗原結合，由于層析作用向前移動，當遇到膜上固定的抗原時，形成記抗原結合，由于層析作用向前移動，當遇到膜上固定的抗原時，形成Ag-Ag-AbAb-Ag-AU-Ag-AU復合物而復合物而富集在包被線上，形成一條或二條紅色線，是陽性結果。反之，若標本中不存在富集在包被線上，形成一條或二條紅

5、色線，是陽性結果。反之，若標本中不存在HIVHIV抗體，則抗體，則不會出現(xiàn)紅線，是陰性結果。無論樣本中是否含有不會出現(xiàn)紅線，是陰性結果。無論樣本中是否含有HIVHIV抗體，在質控線區(qū)域都會形成另一條紅抗體，在質控線區(qū)域都會形成另一條紅色線。色線。 T-檢測線檢測線C-質控線質控線1.準備試劑與相關耗材2.每個樣本檢測每個樣本檢測用一片試劑，標用一片試劑，標上相應樣本編號上相應樣本編號. 3. 加入50 l 全全血或血清和血漿血或血清和血漿4. 5-20分鐘讀取分鐘讀取結果結果 5.讀取和記錄檢讀取和記錄檢測結果測結果. 陽性反應陽性反應：在質在質控窗和反應窗控窗和反應窗均均顯示紅線。顯示紅線。

6、陰性反應陰性反應：只在：只在質控窗出現(xiàn)紅線，質控窗出現(xiàn)紅線，反應窗沒有紅線。反應窗沒有紅線。無效無效：在質控窗：在質控窗沒有出現(xiàn)紅線，沒有出現(xiàn)紅線，說明檢測無效，說明檢測無效，需要重新檢測。需要重新檢測。第四代試劑聯(lián)合檢測HIV P24抗原和抗HIV 抗體電化學發(fā)光法第一代艾滋病抗體檢測試劑檢測的是HIV-1 的IgG抗體, 檢測的窗口期大約是42天. 第二代試劑可以檢測HIV-1和HIV-2型的IgG抗體窗口期縮短至35天. 第三代的試劑可以同時檢測IgG和IgM抗體, 將檢測的窗口期又縮短至22天. 第四代的可以聯(lián)合檢測HIV的P24抗原和HIV-1/2型抗體的試劑, 大約平均比較第三代試

7、劑縮短6天時間. Elecsys HIV Combi 的檢測原理羅氏第四代HIV Combi試劑檢測的是HIV P24抗原和HIV-1/HIV-2抗體.檢測P24抗原使用的是單克隆的HIV 抗體. 檢測HIV-1/2抗體使用的是大量的重組抗原,來捕捉IGg和IGM 抗體. 釕釕生物素生物素辣根過氧化物酶標記的磁性珠辣根過氧化物酶標記的磁性珠 電化學發(fā)光電化學發(fā)光快速檢測法的優(yōu)先使用快速檢測法的優(yōu)先使用 技術角度需要考慮：技術角度需要考慮：需要快速得到結果、免去試劑和樣本的冷鏈運輸環(huán)節(jié)、需要快速得到結果、免去試劑和樣本的冷鏈運輸環(huán)節(jié)、小空間實驗室的成本效益、檢測的簡單性等。小空間實驗室的成本效益

8、、檢測的簡單性等。 優(yōu)先使用包括：優(yōu)先使用包括：應急、門診急診，如應急、門診急診，如VCT、母嬰傳播、臨床評估、農(nóng)、母嬰傳播、臨床評估、農(nóng)村血檢、術前檢測、緊急事件等。村血檢、術前檢測、緊急事件等。HIVHIV快速檢測的局限性快速檢測的局限性 一般不用于血液篩查一般不用于血液篩查 有一定的假陽性反應有一定的假陽性反應 窗口期問題：有一定的假陰性反應（尤其暴露時間窗口期問題：有一定的假陰性反應（尤其暴露時間33個月）個月）HIVHIV抗體快速檢測具有快速優(yōu)勢，但是抗體快速檢測具有快速優(yōu)勢，但是“快速快速”并不意味著對早期感染者的快速診斷，因為并不意味著對早期感染者的快速診斷，因為HIVHIV感染

9、后產(chǎn)生抗體應答需要一段時間，存在窗口期感染后產(chǎn)生抗體應答需要一段時間，存在窗口期（即從暴露至最早檢測出的時間），即使采用分子（即從暴露至最早檢測出的時間），即使采用分子生物學試驗，也有生物學試驗，也有1 12 2周的窗口期。周的窗口期。篩查檢測結果的報告和處理篩查檢測結果的報告和處理抗體篩查試驗的局限性抗體篩查試驗的局限性艾滋病實驗室生物安全n生物安全細則n職業(yè)暴露的防范梅毒實驗室檢測技術廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院檢驗科詹鈾超主要內容n實驗室檢測注意事項及臨床意義n梅毒實驗室檢測策略探討常用梅毒實驗室檢測方法常用梅毒實驗室檢測方法n病原學檢測n血清學檢測病原學檢查病原學檢查n原理： 一期、二期梅

10、毒時 ，取硬下疳、扁平濕疣、黏膜斑等皮損部位組織液或淋巴結穿刺術得到的組織液，在暗視野顯微鏡下，光線從聚光器的邊緣斜射到涂片上的梅毒螺旋體而發(fā)出亮光，從而可根據(jù)其特殊形態(tài)和運動方式進行檢測。n方法：（1）暗視顯微鏡檢查n （ 2）鍍銀染色法n （ 3）核酸檢測（血液標本？）n注：梅毒螺旋體目前體外人工培養(yǎng)還沒有獲得成功，n僅能通過接種兔睪丸等部位進行有限增殖。梅毒血清學檢測方法梅毒血清學檢測方法n1) 非梅毒螺旋體抗原血清學試驗 （非特異性梅毒抗體）n(2) 梅毒螺旋體抗原血清學試驗 （特異性梅毒抗體）兩類方法。非梅毒螺旋體抗原血清學試驗原理非梅毒螺旋體抗原血清學試驗原理n梅毒螺旋體一旦感染人

11、體，宿主可對螺旋體表面的脂質作出免疫應答，產(chǎn)生抗類脂抗原的抗體（非特異性抗體）。n未經(jīng)治療的病人，其血清內的非特異性抗體可長期存在。經(jīng)正規(guī)治療后，非特異性抗體可以逐漸減少滴度至轉為陰性。非梅毒螺旋體抗原血清學原理非梅毒螺旋體抗原血清學原理n方法包括：（1）快速血漿反應素環(huán)狀卡片試驗 (RPR)（2）甲苯胺紅不加熱血清試驗（ TRUST ）（3）性病研究實驗室試驗 (VDRL) 等。n基本成分是心磷脂 卵磷脂和膽固醇n抗原抗體結合形成復合物，凝集成網(wǎng)狀沉淀顆粒被肉眼所見n上述方法的敏感性和特異性都基本相似非梅毒螺旋體抗原血清學試驗原理示意圖非梅毒螺旋體抗原血清學試驗原理示意圖非梅毒螺旋體抗原血清

12、學試驗操作要點非梅毒螺旋體抗原血清學試驗操作要點1 、儀器：水平旋轉儀，轉速100r/min，轉幅約18mm2、定性試驗n加樣：吸取0.05mL血清( 漿) 放在卡片圈中，并均勻地涂布在整個圈內n加抗原：將抗原輕輕搖勻，用9號針頭加1 滴抗原（ 60滴/mL，1滴=17ul ）n反應：水平旋轉儀旋轉8分鐘(23 - 29 ）亮光下觀察結果。非梅毒螺旋體抗原血清學試驗操作要點非梅毒螺旋體抗原血清學試驗操作要點3、定量試驗n稀釋夜準備：在反應紙板圈內 加入50uL生理鹽水（根據(jù)需要確定圈數(shù)),勿將鹽水涂開n加樣：吸取50uL血清（漿）與各圈中鹽水作系列稀釋，并涂布整個圈內。n下同定性實驗。1:11

13、:11:21:21:81:8非梅毒螺旋體抗原血清學試驗臨床意義非梅毒螺旋體抗原血清學試驗臨床意義n早期梅毒（一期、二期）經(jīng)足量規(guī)則抗梅毒治療后 一期梅毒 1 年后轉為陰性 二期梅毒 2 年后轉為陰性。 晚期梅毒治療后血清滴度下降緩慢，2年后約50% 病人血清反應仍為陽性。n非梅毒螺旋體抗原血清試驗方法簡單、快速、敏感性和特異性較好。適用于大量人群的篩查。n因治療后血清滴度可下降并陰性，故可作為療效觀察、判愈、復發(fā)或再感染的指征。非梅毒螺旋體抗原血清學試驗特點非梅毒螺旋體抗原血清學試驗特點假陽性反應n技術性假陽性反應一般是由于操作錯誤引起的假陽性反應，經(jīng)過重復試驗即可排除。n生物學假陽性反應 (

14、 一般滴度小1:8），應采用梅毒螺旋體抗原血清學試驗 如TPPA等進行排除。梅毒螺旋體抗原血清學試驗原理梅毒螺旋體抗原血清學試驗原理n抗原為梅毒螺旋體特異蛋白（包括螺旋體重組特異抗原），檢測梅毒患者血中特異性抗梅毒螺旋體抗原的抗體。n感染梅毒螺旋體后 ，一旦梅毒螺旋體抗體試驗呈陽性，則患者終身陽性。梅毒螺旋體抗原血清學試驗方法梅毒螺旋體抗原血清學試驗方法n梅毒螺旋體顆粒凝集試驗 (TPPA)n梅毒螺旋體血球凝集試驗 (TPHA)n梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗（ ELISA）n化學發(fā)光免疫分析法（CLIA）n梅毒免疫層析法- 梅毒快速檢測 (RT)n熒光螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS ）n梅毒螺旋體蛋白印跡試驗（ WB ）TPPAnTPPA試驗用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒人血清中的抗梅毒螺旋體抗體結合，產(chǎn)生可見的凝集反應，具有較高的敏感性和特異性。nTPPA是目前WHO公認的梅毒抗原血清學試驗