實(shí)驗(yàn)五 質(zhì)粒DNA酶切(質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶消化酶切)

1、質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA酶切酶切（質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶消化酶切）質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶消化酶切）實(shí)驗(yàn)五實(shí)驗(yàn)五背景知識(shí)背景知識(shí)一、質(zhì)粒圖譜的閱讀二、限制性內(nèi)切酶第一步第一步：首先看Ori的位置，了解質(zhì)粒的類(lèi)型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒） 第二步第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。 Ampr 水解內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。 tetr 可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。 camr 生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。 neor（kanr）氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活 hygr 使潮霉素失活。一、質(zhì)粒圖譜的閱讀一、質(zhì)粒圖譜的閱讀第三步第三步：看多克隆位點(diǎn)（MCS）。它具有多個(gè)限制酶的單

2、一切點(diǎn)。便于外源基因的插入。第四步第四步：再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。 一般來(lái)說(shuō)，外源DNA片段越長(zhǎng)，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。第五步：第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即：?jiǎn)?dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)克隆位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。 這是用來(lái)區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體的?？寺≥d體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。pCAMBIA130210549 bpKanHPTGFPT-DNA right borderT-DNA left borderpUC18 MCSNOS35S promoter35S promoterpVS1-REPpBR322 oriUTRUT

3、RlacZ promoterEcoRV (6218)EcoRV (8842)EcoRV (10442)農(nóng)桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)農(nóng)桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)加尾信號(hào)，終止位點(diǎn)加尾信號(hào)，終止位點(diǎn)潮霉素抗性基因潮霉素抗性基因多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)終止子加尾信號(hào)終止子加尾信號(hào)綠色熒光蛋白基因綠色熒光蛋白基因二、限制性內(nèi)切酶二、限制性內(nèi)切酶1) 概念概念2) 命名原則命名原則3) 類(lèi)型類(lèi)型4) 基本特性及用途基本特性及用途5) 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素6)限制性核酸內(nèi)切酶操作的注意事項(xiàng)限制性核酸內(nèi)切酶操作的注意事項(xiàng)1) 概念概念限制性核酸內(nèi)切酶限

4、制性核酸內(nèi)切酶(restriction ednonuclease)是一類(lèi)能識(shí)別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割雙鏈DNA的內(nèi)切核酸酶（endonuclease)的總稱。 至2006年2月共發(fā)現(xiàn)3773種限制性內(nèi)切酶，I、II、III型各有68、3692、10種，甲基化指導(dǎo)的3種，商品化的609種，II型中共有223種特異性。2) 命名原則命名原則1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原則，1980年Roberts在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了系統(tǒng)分類(lèi) 限制性核酸內(nèi)切酶第一個(gè)字母（大寫(xiě)，斜體）代表該酶的宿主菌屬名(genus)；第二、三個(gè)字母(小寫(xiě)，斜體)代表

5、宿主菌種名(species)。 第四個(gè)字母代表宿主菌的株或型(strain)。 若從一種菌株中發(fā)現(xiàn)了幾種限制性核酸內(nèi)切酶，即根據(jù)發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序用羅馬字母表示。 屬名屬名 種名種名 株系株系Haemophilus influenzae d 流感嗜血桿菌d株 Hind Hind同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶3) 類(lèi)型類(lèi)型 據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為性，可分為、型三類(lèi)。型三類(lèi)。主要特性主要特性型型型型型型限制修飾蛋白結(jié)構(gòu)輔助因子識(shí)別序列切

6、割位點(diǎn)應(yīng)應(yīng) 用用多功能異源三聚體ATP、 Mg2+ 、SAM距識(shí)別序列1kb處隨機(jī)性切割不常用單功能同源三聚體Mg2+ 46bp回文序列識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割常用常用雙功能異源二聚體ATP、 Mg2+距識(shí)別序列下游2426bp處隨機(jī)性切割數(shù)量很少，無(wú)實(shí)際作用4) 基本特性及用途基本特性及用途限制性核酸內(nèi)切酶的主要用途限制性核酸內(nèi)切酶的主要用途 在特異位點(diǎn)上切割在特異位點(diǎn)上切割DNA，產(chǎn)生特異的限制性酶片段。，產(chǎn)生特異的限制性酶片段。 建立建立DNA分子的限制酶圖譜。分子的限制酶圖譜。 構(gòu)建基因文庫(kù)構(gòu)建基因文庫(kù)。 用限制酶切出的相同粘性末端，以便重組。用限制酶切出的相同粘性末端，以便重組。 改

7、建質(zhì)粒。改建質(zhì)粒。5) 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素 DNA樣品純度樣品純度 DNA樣品甲基化程度樣品甲基化程度 酶的星活性酶的星活性 (star activity) DNA樣品純度樣品純度 A） 雖不影響酶反應(yīng)速度，但雖不影響酶反應(yīng)速度，但RNA很易與酶蛋白發(fā)生很易與酶蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合而減少酶有效濃度，使酶解不徹底；另外，干擾非特異性結(jié)合而減少酶有效濃度，使酶解不徹底；另外，干擾DNA片段片段電泳觀察。電泳觀察。 B） 對(duì)酶解影響不大，但若有核酸酶等蛋白質(zhì)污染對(duì)酶解影響不大，但若有核酸酶等蛋白質(zhì)污染時(shí)，會(huì)干擾酶切反應(yīng)，并影響酶解產(chǎn)物。時(shí)，會(huì)干擾酶切反應(yīng)，并

8、影響酶解產(chǎn)物。 C） 如質(zhì)粒如質(zhì)粒DNA中雜有染色體中雜有染色體DNA，雖不影響，雖不影響酶解作用，但干擾酶解產(chǎn)物電泳圖譜并影響以后的重組連接反應(yīng)。酶解作用，但干擾酶解產(chǎn)物電泳圖譜并影響以后的重組連接反應(yīng)。 D） 如苯酚、氯仿、乙醇、如苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，會(huì)影響等，會(huì)影響酶切速度，甚至改變酶的識(shí)別特異性，出現(xiàn)酶的第二活性。酶切速度，甚至改變酶的識(shí)別特異性，出現(xiàn)酶的第二活性。 DNA樣品甲基化程度樣品甲基化程度 限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列若被修飾酶產(chǎn)生了修飾反應(yīng)，則該DNA不能被限制酶再切割。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一， DNA甲基化現(xiàn)象廣泛的存在于原核和真

9、核生物中。 如：Acc識(shí)別序列能切割不能切割注意此處的區(qū)別dam甲基化酶識(shí)別序列AccT CCGG AGAT CCGG 6mATC 酶的星活性酶的星活性 (star activity)又稱第二活力，是指改變了酶切反應(yīng)條件后特異序列識(shí)別特性降低的一種現(xiàn)象。由于識(shí)別特異性的降低，可能對(duì)原識(shí)別序列相似的序列也產(chǎn)生切割反應(yīng)。高濃度甘油、高pH、低離子強(qiáng)度、巰基乙醇、DMSO、Mn2+ 等的存在可能導(dǎo)致酶產(chǎn)生星活性。6) 限制性核酸內(nèi)切酶操作的注意事項(xiàng)限制性核酸內(nèi)切酶操作的注意事項(xiàng)商品化的限制性核酸內(nèi)切酶均為濃縮液，每次操作時(shí)應(yīng)商品化的限制性核酸內(nèi)切酶均為濃縮液，每次操作時(shí)應(yīng)使用新的吸頭去取酶；加入酶的

10、體積應(yīng)不超過(guò)總體積的使用新的吸頭去取酶；加入酶的體積應(yīng)不超過(guò)總體積的10%，否則酶液中的甘油濃度超過(guò)否則酶液中的甘油濃度超過(guò)5%時(shí)酶易產(chǎn)生星活性。時(shí)酶易產(chǎn)生星活性。整個(gè)操作應(yīng)在整個(gè)操作應(yīng)在0進(jìn)行，即在冰浴中進(jìn)行，而且是在加入進(jìn)行，即在冰浴中進(jìn)行，而且是在加入其它試劑之后，最后加入酶。其它試劑之后，最后加入酶。當(dāng)切割大量當(dāng)切割大量DNA時(shí)，通常采用延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，減少酶的時(shí)，通常采用延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，減少酶的用量。用量。當(dāng)當(dāng)DNA需需2種或以上酶切時(shí)，應(yīng)用通用緩沖液；若沒(méi)有種或以上酶切時(shí)，應(yīng)用通用緩沖液；若沒(méi)有通用緩沖液時(shí)，只有用通用緩沖液時(shí)，只有用1種酶切完后，純化酶切產(chǎn)物，再進(jìn)種酶切完后，純化酶切

11、產(chǎn)物，再進(jìn)行下一個(gè)酶切反應(yīng)。行下一個(gè)酶切反應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康模┝私饷盖性恚莆彰盖畜w系建立原則）用EcoR 切割質(zhì)粒pCAMBIA13023）用EcoR 切割銀杏基因組DNA實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶EcoR 特異性識(shí)別位點(diǎn)為：特異性識(shí)別位點(diǎn)為：GATATC CTATAGGATATC CTATAG產(chǎn)生平末端：產(chǎn)生平末端：pCAMBIA130210549 bpKanHPTG

12、FPT-DNA right borderT-DNA left borderpUC18 MCSNOS35S promoter35S promoterpVS1-REPpBR322 oriUTRUTRlacZ promoterEcoRV (6218)EcoRV (8842)EcoRV (10442)則則pCAMBIA1302經(jīng)經(jīng)EcoR 酶切后產(chǎn)生大小分別為：酶切后產(chǎn)生大小分別為：1600bp、2624bp和和6325bp的三條的三條DNA 片段片段基因組基因組DNA中由于有較多的中由于有較多的EcoR 識(shí)別位點(diǎn)，因此，經(jīng)識(shí)別位點(diǎn)，因此，經(jīng)EcoR 酶切后產(chǎn)生大小不一的條帶，電泳后整個(gè)泳道呈現(xiàn)均一酶

13、切后產(chǎn)生大小不一的條帶，電泳后整個(gè)泳道呈現(xiàn)均一的亮帶。的亮帶。酶切前的酶切前的DNA酶切后的酶切后的DNA實(shí)驗(yàn)材料和試劑實(shí)驗(yàn)材料和試劑實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料：質(zhì)粒質(zhì)粒pCAMBIA1302 銀杏基因組銀杏基因組DNA實(shí)驗(yàn)試劑：實(shí)驗(yàn)試劑： EcoR 酶及其酶切緩沖液酶及其酶切緩沖液 瓊脂糖瓊脂糖(Agarose)、TAE電泳緩沖液等電泳緩沖液等實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器恒溫水浴鍋恒溫水浴鍋質(zhì)粒質(zhì)粒 （DNA）17.5L反應(yīng)反應(yīng) 10緩沖液緩沖液2L19L0.5L酶液酶液+用移液槍輕輕吹打使溶液混勻，且使溶液集中在管底用移液槍輕輕吹打使溶液混勻，且使溶液集中在管底混勻反應(yīng)體系后，混勻反應(yīng)體系后，37水浴保溫水浴保溫4-5h瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(上樣上樣10L電泳電泳)EP管編號(hào)管編號(hào), 加樣加樣實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1. 限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1g DNA加1單位酶，消化1-2h。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長(zhǎng)。 2. 酶切時(shí)所加