青霉素的生產(chǎn)

1、項目三項目三 青霉素的生產(chǎn)青霉素的生產(chǎn)班級班級: :生物制藥生物制藥13111311組別：第組別：第2 2組組組員：張婉月組員：張婉月 臧贏臧贏 嚴(yán)夢迎嚴(yán)夢迎 徐潔徐潔 陳孝顏陳孝顏 青霉素的介紹 青霉素的生產(chǎn)步驟 青霉素接種、菌種活化、擴大培養(yǎng) 青霉菌發(fā)酵 發(fā)酵液質(zhì)量控制 青霉菌發(fā)酵產(chǎn)物初步分離 青霉素發(fā)酵液效價的測定青霉素的概述青霉素的概述 青霉素（青霉素（Benzylpenicillin / PenicillinBenzylpenicillin / Penicillin）又）又被稱為青霉素被稱為青霉素G G、peillin Gpeillin G、 盤尼西林、配尼西盤尼西林、配尼西林、青霉

2、素鈉、芐青霉素鈉、青霉素鉀、芐青霉林、青霉素鈉、芐青霉素鈉、青霉素鉀、芐青霉素鉀。青霉素是抗菌素的一種，是指從青霉菌培素鉀。青霉素是抗菌素的一種，是指從青霉菌培養(yǎng)液中提制的分子中含有青霉烷、能破壞細(xì)菌的養(yǎng)液中提制的分子中含有青霉烷、能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用的一類細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素，是第一種能夠治療人類疾病的抗生素?？股?，是第一種能夠治療人類疾病的抗生素。青霉素類抗生素是青霉素類抗生素是-內(nèi)酰胺類中一大類抗生素的內(nèi)酰胺類中一大類抗生素的總稱?？偡Q。青霉素的結(jié)構(gòu)式青霉素的結(jié)構(gòu)式青霉素分類及分子結(jié)構(gòu)青霉素分類及分子結(jié)構(gòu) 按其特點可分為按其特點可

3、分為 ： 青霉素青霉素G G類：如青霉素類：如青霉素G G鉀、青霉素鉀、青霉素G G鈉、長效西林鈉、長效西林 青霉素青霉素G G、peillin Gpeillin G、 盤尼西林、配尼西林、青霉素鈉、芐青盤尼西林、配尼西林、青霉素鈉、芐青霉素鈉、青霉素鉀、芐青霉素鉀等。霉素鈉、青霉素鉀、芐青霉素鉀等。 青霉素青霉素V V類：（別名：苯氧甲基青霉素、類：（別名：苯氧甲基青霉素、6-6-苯氧乙酰胺基苯氧乙酰胺基青霉烷酸）青霉烷酸） 如青霉素如青霉素V V鉀等（包括有多種劑型）。鉀等（包括有多種劑型）。 耐酶青霉素：如苯唑青霉素（新青耐酶青霉素：如苯唑青霉素（新青號）、氯唑青霉素等。號）、氯唑青霉素

4、等。 氨芐西林類：如氨芐西林、阿莫西林等。氨芐西林類：如氨芐西林、阿莫西林等。 抗假單胞菌青霉素：如羧芐西林、哌拉西林、替卡西林等。抗假單胞菌青霉素：如羧芐西林、哌拉西林、替卡西林等。 美西林及其酯匹西林：如美西林及其酯匹美西林等，其特美西林及其酯匹西林：如美西林及其酯匹美西林等，其特點為較耐酶，對某些陰性桿菌（如大腸、克雷伯氏和沙門點為較耐酶，對某些陰性桿菌（如大腸、克雷伯氏和沙門氏菌）有效，但對綠膿桿菌效差。氏菌）有效，但對綠膿桿菌效差。 甲氧西林類：如坦莫西林等甲氧西林類：如坦莫西林等青霉素的生產(chǎn)步驟青霉素的生產(chǎn)步驟 生產(chǎn)青霉素需經(jīng)以下步驟生產(chǎn)青霉素需經(jīng)以下步驟：配料、發(fā)酵、過濾、提取、

5、結(jié)晶、干燥、包配料、發(fā)酵、過濾、提取、結(jié)晶、干燥、包裝。裝。青霉素的發(fā)酵工藝過程青霉素的發(fā)酵工藝過程一、菌種：保養(yǎng)在低溫的冷凍安瓿管中絲狀一、菌種：保養(yǎng)在低溫的冷凍安瓿管中絲狀青霉菌菌種青霉菌菌種二：所用培養(yǎng)基：二：所用培養(yǎng)基：LBLB培養(yǎng)基培養(yǎng)基配方：牛肉膏配方：牛肉膏1g1g、蛋白胨、蛋白胨2g2g、Nacl1gNacl1g、瓊脂、瓊脂3g3g、葡萄糖、葡萄糖4g4g、配成、配成200mL200mL青霉素接種、菌種活化、擴大培養(yǎng)青霉素接種、菌種活化、擴大培養(yǎng)一、接種（在超凈臺上完成）一、接種（在超凈臺上完成） 將滅好菌的將滅好菌的LBLB培養(yǎng)基放入超凈臺中培養(yǎng)基放入超凈臺中 將將LBLB培

6、養(yǎng)基倒入試管中，試管擺斜面冷卻培養(yǎng)基倒入試管中，試管擺斜面冷卻凝固。凝固。 等培養(yǎng)基凝固后，用接種環(huán)從安瓿中接去等培養(yǎng)基凝固后，用接種環(huán)從安瓿中接去菌種，并在培養(yǎng)基上畫菌種，并在培養(yǎng)基上畫S S型曲線接種型曲線接種二、菌種活化二、菌種活化待接種好的菌吸附在培養(yǎng)基上，置于待接種好的菌吸附在培養(yǎng)基上，置于2525恒恒溫箱中培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)5 5天。天。三，擴大培養(yǎng)三，擴大培養(yǎng) 1 1、液體試管培養(yǎng)液體試管培養(yǎng) 液體培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉液體培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉9g9g、 蛋白胨蛋白胨1.2g 1.2g 、 玉米漿玉米漿2ml2ml、葡萄糖、葡萄糖3g3g、 K K2 2HPOHPO4 40.15g

7、 0.15g 、 MgSOMgSO4 47H7H2 2O 0.15gO 0.15g、 NaCl0.15g NaCl0.15g、 蒸餾水蒸餾水300ml300ml。 . . 滅菌后，在超凈工作臺進行以下操作：滅菌后，在超凈工作臺進行以下操作： 將液體培養(yǎng)基倒入試管內(nèi)，用接種環(huán)自斜面將液體培養(yǎng)基倒入試管內(nèi)，用接種環(huán)自斜面試管挑取一環(huán)斜面種子菌體，接入試管中。搖勻后，試管挑取一環(huán)斜面種子菌體，接入試管中。搖勻后，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待培養(yǎng)成熟后，再接入三角瓶培養(yǎng)。置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待培養(yǎng)成熟后，再接入三角瓶培養(yǎng)。2 2、三角瓶液體培養(yǎng)三角瓶液體培養(yǎng) 制備液體培養(yǎng)基（同上）滅菌后，在超制備液體培養(yǎng)基（同上）滅菌

8、后，在超凈臺進行以下操作：凈臺進行以下操作： 將液體培養(yǎng)基倒入三角瓶內(nèi)，用接種環(huán)將液體培養(yǎng)基倒入三角瓶內(nèi)，用接種環(huán)自液體培養(yǎng)的試管挑取種子菌體，接入三角自液體培養(yǎng)的試管挑取種子菌體，接入三角瓶（可接瓶（可接2-32-3次）。搖勻后，置搖床培養(yǎng)。次）。搖勻后，置搖床培養(yǎng)。 發(fā)酵罐：生產(chǎn)罐。發(fā)酵罐：生產(chǎn)罐。 培養(yǎng)基配方：花生餅粉（高溫），麩質(zhì)粉、玉米漿、葡萄糖，培養(yǎng)基配方：花生餅粉（高溫），麩質(zhì)粉、玉米漿、葡萄糖，尿素，硫酸銨，硫酸鈉、硫代硫酸鈉，磷酸二氫鈉，苯乙酰尿素，硫酸銨，硫酸鈉、硫代硫酸鈉，磷酸二氫鈉，苯乙酰胺及消泡劑，胺及消泡劑，CaCOCaCO3 3等。等。 從三角瓶中接種，接種量為從

9、三角瓶中接種，接種量為12-15%12-15%。 青霉素的發(fā)酵對溶氧要求極高，通氣量偏大，通氣比控制青霉素的發(fā)酵對溶氧要求極高，通氣量偏大，通氣比控制0.7-1.80.7-1.8；150150200r/min200r/min；要求高功率攪拌，；要求高功率攪拌，100 m3100 m3的發(fā)酵的發(fā)酵罐攪拌功率在罐攪拌功率在200-300 Kw200-300 Kw，罐壓控制，罐壓控制0.04-0.05 MPa0.04-0.05 MPa，于，于25-25-26 26 下培養(yǎng)，發(fā)酵周期在下培養(yǎng)，發(fā)酵周期在200h200h左右。前左右。前60h60h，pH5.7-6.3pH5.7-6.3，后，后6.3-6

10、.66.3-6.6；前；前60h60h為為2626，以后，以后2424。青霉菌發(fā)酵青霉菌發(fā)酵發(fā)酵液質(zhì)量控制發(fā)酵液質(zhì)量控制 生產(chǎn)上按規(guī)定時間從發(fā)酵罐中取樣生產(chǎn)上按規(guī)定時間從發(fā)酵罐中取樣 , , 用顯微用顯微鏡觀察菌絲形態(tài)變化來控制發(fā)酵。生產(chǎn)上慣稱鏡觀察菌絲形態(tài)變化來控制發(fā)酵。生產(chǎn)上慣稱“ “ 鏡檢鏡檢 ”, ”,根據(jù)根據(jù)“ “ 鏡檢鏡檢 ” ”中菌絲形變化和代謝中菌絲形變化和代謝變化的其他指標(biāo)調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度變化的其他指標(biāo)調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度, , 通過追加糖或補通過追加糖或補加前體等各種措施來延長發(fā)酵時間加前體等各種措施來延長發(fā)酵時間, , 以獲得最多以獲得最多青霉素。青霉素。 當(dāng)菌絲中空泡擴大、增多及延

11、伸當(dāng)菌絲中空泡擴大、增多及延伸, , 并出現(xiàn)個別并出現(xiàn)個別自溶細(xì)胞自溶細(xì)胞, , 這表示菌絲趨向衰老這表示菌絲趨向衰老, , 青霉素分泌逐青霉素分泌逐漸停止?jié)u停止, , 菌絲形態(tài)上即將進入自溶期菌絲形態(tài)上即將進入自溶期, , 在此時期在此時期由于茵絲自溶由于茵絲自溶, , 游離氨釋放游離氨釋放, pH , pH 值上升值上升, , 導(dǎo)致青導(dǎo)致青霉素產(chǎn)量下降霉素產(chǎn)量下降, , 使色素、溶解和膠狀雜質(zhì)增多使色素、溶解和膠狀雜質(zhì)增多, , 并使發(fā)酵液變蒙古稠并使發(fā)酵液變蒙古稠, , 增加下一步提純時過濾的增加下一步提純時過濾的困難。因此困難。因此, , 生產(chǎn)上根據(jù)生產(chǎn)上根據(jù)“鏡檢鏡檢 ” ”判斷判斷

12、, , 在自溶在自溶期即將來臨之際期即將來臨之際, , 迅速停止發(fā)酵迅速停止發(fā)酵, , 立刻放罐立刻放罐, , 將將發(fā)酵液迅速送往提煉工段。發(fā)酵液迅速送往提煉工段。青霉菌發(fā)酵產(chǎn)物初步分離青霉菌發(fā)酵產(chǎn)物初步分離（1 1）預(yù)處理及過濾）預(yù)處理及過濾 發(fā)酵液放罐后需冷卻至發(fā)酵液放罐后需冷卻至1010后，經(jīng)鼓式真空過濾機過濾。從鼓式真空過濾機得后，經(jīng)鼓式真空過濾機過濾。從鼓式真空過濾機得到青霉素濾液到青霉素濾液pHpH在在6.26.2 7.27.2，蛋白質(zhì)含量一般在，蛋白質(zhì)含量一般在0.05%0.05% 0.2%0.2%。這些蛋白質(zhì)的存在對后面提取有很大。這些蛋白質(zhì)的存在對后面提取有很大影響，必須加以

13、除去。除去蛋白質(zhì)通常采用影響，必須加以除去。除去蛋白質(zhì)通常采用10%10%硫硫酸調(diào)節(jié)酸調(diào)節(jié)pH4.5pH4.5 5.05.0，加入，加入0.05%0.05%（質(zhì)量濃度）左右的（質(zhì)量濃度）左右的絮凝劑的方法，同時再加入絮凝劑的方法，同時再加入0.7%0.7%硅藻土作助濾劑，硅藻土作助濾劑，再通過板框過濾機過濾。經(jīng)過第二次過濾的濾液一再通過板框過濾機過濾。經(jīng)過第二次過濾的濾液一般澄清透明，可進行萃取。般澄清透明，可進行萃取。（2 2）提?。┨崛?結(jié)合青霉素在各種結(jié)合青霉素在各種pHpH下額穩(wěn)定性，一般下額穩(wěn)定性，一般從發(fā)酵液中萃取到醋酸丁酯時，從發(fā)酵液中萃取到醋酸丁酯時，pHpH選擇在選擇在1.8

14、1.8 2.22.2范范圍內(nèi)，而從丁酯相反萃取到水相時，圍內(nèi)，而從丁酯相反萃取到水相時，pHpH選擇在選擇在6.86.8 7.47.4范圍內(nèi)對提取有利。生產(chǎn)上一般將發(fā)酵濾液范圍內(nèi)對提取有利。生產(chǎn)上一般將發(fā)酵濾液酸化至酸化至pHpH等于等于2.02.0，加，加1/31/3體積的醋酸丁酯（簡稱體積的醋酸丁酯（簡稱BABA）混合后以臥式離心機（混合后以臥式離心機（PODPOD）機分離的一次）機分離的一次BABA萃取萃取液，然后以液，然后以NAHCONAHCO3 3在在pH6.8pH6.8 7.47.4條件下將青霉素從條件下將青霉素從BABA中萃取到緩沖液中，再用中萃取到緩沖液中，再用10%H10%H

15、2 2SOSO4 4調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHpH等于等于2.02.0，將青霉素從緩沖液中再次轉(zhuǎn)入將青霉素從緩沖液中再次轉(zhuǎn)入BABA中（方法同前面所中（方法同前面所述），得二次述），得二次BABA萃取液。萃取液。（3 3）脫色）脫色 在二次在二次BABA萃取液中加入活性炭萃取液中加入活性炭150350g/10150350g/10億單位，進行脫色，石棉過濾板過濾。億單位，進行脫色，石棉過濾板過濾。注意注意：青霉素性質(zhì)不穩(wěn)定，在發(fā)酵液預(yù)處理、提取和精制過：青霉素性質(zhì)不穩(wěn)定，在發(fā)酵液預(yù)處理、提取和精制過程中應(yīng)注意條件溫和、速度快，以防止青霉素破壞。預(yù)處程中應(yīng)注意條件溫和、速度快，以防止青霉素破壞。預(yù)處理及過濾、提

16、取過程是青霉素各產(chǎn)品的共性部分，其工藝?yán)砑斑^濾、提取過程是青霉素各產(chǎn)品的共性部分，其工藝控制基本相同，只是精制過程有所差別。控制基本相同，只是精制過程有所差別。青霉素發(fā)酵液效價的測定 根據(jù)發(fā)酵時間用1%pH6.0的磷酸緩沖液將發(fā)酵液適當(dāng)稀釋.每個被測樣品用3套平皿進行測定.青霉素標(biāo)準(zhǔn)液(1單位/ml)與待測樣品的稀釋液間隔的加入小管內(nèi).37培養(yǎng)18-24h后,量取抑菌圈直徑的大小。測定步驟 （1）青霉素發(fā)酵：用搖瓶或臺式發(fā)酵罐法接種與培養(yǎng)產(chǎn)黃青霉（青霉素高產(chǎn)分泌菌株） （2）稀釋發(fā)酵液：作青霉素測定的發(fā)酵液用1%pH6.0磷酸鹽緩沖液作適當(dāng)稀釋，每個被檢驗樣品用3套培養(yǎng)皿測定其效價。 （3）放牛津小杯:每套含菌測定平半上均勻地放置4支牛津小杯，小杯中心坐落在培養(yǎng)皿兩互相垂直直徑的各自半徑的中心。測定步驟 （4）杯中加樣品液：青霉素標(biāo)準(zhǔn)液（1U/ml）與發(fā)酵液的稀釋液間隔地加入牛津小貝中，加液量務(wù)求準(zhǔn)確，