細(xì)胞因子檢測(cè)方法

1、精選課件細(xì)胞因子檢測(cè)方法細(xì)胞因子檢測(cè)方法基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微免學(xué)系基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微免學(xué)系 王慧娟王慧娟精選課件背景背景l(fā)細(xì)胞因子檢測(cè)是判斷機(jī)體免疫功能的一個(gè)重要指標(biāo) l疾病的診斷、病程觀察、療效判斷及細(xì)胞因子治療監(jiān)測(cè)等 精選課件l（一）依賴(lài)性細(xì)胞株 ：生物分析法生物分析法 l（二）功能檢測(cè) ：生物分析法生物分析法 l（三）免疫測(cè)定 ：免疫分析法免疫分析法 l（四）功能測(cè)定與抗體抑制 l（五）分子雜交技術(shù) ：mRNA的測(cè)定的測(cè)定 l（六）多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）：mRNA的的測(cè)定測(cè)定 精選課件生物分析法生物分析法 精選課件（一）依賴(lài)性細(xì)胞株（一）依賴(lài)性細(xì)胞株 l一些腫瘤細(xì)胞株必須依賴(lài)于細(xì)胞因子方能在體外增

2、殖，如DTLL細(xì)胞株依賴(lài)IL-2；FDC-PL細(xì)胞株依賴(lài)于小鼠IL-3；TF-1細(xì)胞株依賴(lài)于人IL-3和人GM-CSF，因而可利用這些依賴(lài)細(xì)胞株檢測(cè)相應(yīng)的細(xì)胞因子。這種方法敏感性高，特異性也不錯(cuò)，但可異的是并非所有細(xì)胞因都能找到相應(yīng)的細(xì)胞株，因而限制了它的應(yīng)用。精選課件（二）功能檢測(cè)（二）功能檢測(cè) l利用一些細(xì)胞因子的功能特性，可建立相應(yīng)的活性測(cè)定方法，如干擾素的抑制病毒感染效應(yīng)，腫瘤壞死因子對(duì)L929細(xì)胞的殺傷作用等。這樣的方法敏感性高，但特異性不夠，容易受一些擾因素的影響。 精選課件免疫分析法免疫分析法（1）放免實(shí)驗(yàn)（）放免實(shí)驗(yàn)（RIA）（2）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELIS

3、A） 精選課件mRNA的測(cè)定的測(cè)定 （1）分子雜交實(shí)驗(yàn)）分子雜交實(shí)驗(yàn) （2）逆轉(zhuǎn)錄）逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR） 精選課件小結(jié)小結(jié)l生物學(xué)檢測(cè)法比較敏感，又可直接測(cè)定生物學(xué)功能，是最可靠的方法，適用于各種實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，是科研部門(mén)最常用的技術(shù)，但需要長(zhǎng)期培養(yǎng)依賴(lài)性細(xì)胞株，檢測(cè)但需要長(zhǎng)期培養(yǎng)依賴(lài)性細(xì)胞株，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，步驟繁雜，影響因素多，不容易熟練掌握。耗時(shí)長(zhǎng)，步驟繁雜，影響因素多，不容易熟練掌握。l免疫學(xué)檢測(cè)法比較簡(jiǎn)單，迅速，重復(fù)性好，但所測(cè)定的只代表相應(yīng)細(xì)胞因子的量而不代表活性，同時(shí)敏感代表相應(yīng)細(xì)胞因子的量而不代表活性，同時(shí)敏感度也低于度也低于生物活性檢測(cè)法（約低10100倍）。l分子生物學(xué)法只能

4、檢測(cè)基因表達(dá)情況，不能直接提供有關(guān)因子的濃度及活性等資料，主要用于機(jī)制探討用于機(jī)制探討。 精選課件影響因素影響因素l原理與方法l靈敏度 l準(zhǔn)確度和特異性 l精密度 ：免疫分析法的精密度較其生物分析法有較大提高 ；批內(nèi)變異通常為20%25%，因此有必要進(jìn)行2次或3次檢測(cè) l標(biāo)準(zhǔn)化 生物分析法和免疫分析法結(jié)合使用生物分析法和免疫分析法結(jié)合使用 精選課件免疫分析法免疫分析法lELISAl細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的流式細(xì)胞儀檢測(cè) lELISPOT精選課件ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assayl1 間接ELISA（Indirect ELISA）：用于篩檢抗體（抗特定抗原成分

5、的特異性抗體）。此法是測(cè)定抗體最常用的方法。l2 夾心ELISA（Sandwich ELISA）：用于檢測(cè)目的抗原的量。其優(yōu)點(diǎn)是避免了對(duì)特異性抗體的直接標(biāo)記，但增加了操作步驟和測(cè)定時(shí)間。l3 競(jìng)爭(zhēng)ELISA（Competitive ELISA）用于確定抗原特異性或待檢標(biāo)本中含交叉反應(yīng)成分時(shí)為了提高實(shí)驗(yàn)的特異性而使用的一種方法。根據(jù)標(biāo)記抗原與同種未標(biāo)記待測(cè)抗原與抗體間發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的原理，主要用于測(cè)定小分子抗原。精選課件夾心夾心ELISAl第1步，包被捕獲抗體到96孔板中，BSA阻斷后加入標(biāo)準(zhǔn)品或者標(biāo)本 l第2步，加入酶標(biāo)的抗體，結(jié)合被捕獲的細(xì)胞因子 l第3步，加入酶的底物顯色，酶標(biāo)儀或者化學(xué)發(fā)

6、光議讀取結(jié)果（OD：optical density） l第4步，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算標(biāo)本中細(xì)胞因子的含量 精選課件精選課件注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)前：l確定試劑盒在有效期內(nèi)l仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)l按說(shuō)明書(shū)確定所有試劑齊全（數(shù)量、體積）l根據(jù)檢測(cè)標(biāo)本數(shù)量確定所需試劑的量l按說(shuō)明書(shū)將所用試劑平衡至室溫，配制所需試劑精選課件注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)標(biāo)本的制備和貯存標(biāo)本的制備和貯存 ：l血清、血漿標(biāo)本 ：盡快分裝 ，貯存在-70 ，避免反復(fù)凍融 。使用前將標(biāo)本平衡至室溫，不能用水浴鍋l細(xì)胞培養(yǎng)上清液：細(xì)胞培養(yǎng)上清液：1500g離心1015分鐘去除細(xì)胞和細(xì)胞殘?jiān)?精選課件注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)試劑盒貯存條件和有效期試劑盒貯存條

7、件和有效期l未開(kāi)封試劑盒：貯存在2-8 l開(kāi)封/復(fù)溶試劑 ：2-8可以1個(gè)月左右l標(biāo)準(zhǔn)品：分裝并貯存在-20以下，1個(gè)月，避免反復(fù)凍融 l微孔板：將未使用的板條用箔紙包好，加上干燥劑沿四周封口。2-8可以1個(gè)月左右精選課件檢測(cè)方法的進(jìn)展檢測(cè)方法的進(jìn)展l高通量細(xì)胞因子檢測(cè)高通量細(xì)胞因子檢測(cè)lCBA(Cytometric Bead Array)是一種微珠多是一種微珠多用途檢測(cè)分析技術(shù)，它由一系列的微珠組合來(lái)用途檢測(cè)分析技術(shù)，它由一系列的微珠組合來(lái)捕獲并結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液、捕獲并結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液、EDTA血漿、血清樣本中被檢測(cè)物質(zhì)的量。其血漿、血清樣本中被檢測(cè)物質(zhì)的量。

8、其采用夾心法分析策略，與傳統(tǒng)的采用夾心法分析策略，與傳統(tǒng)的ELISA分析技分析技術(shù)相比，此方法可以同時(shí)檢測(cè)多項(xiàng)指標(biāo)。用已術(shù)相比，此方法可以同時(shí)檢測(cè)多項(xiàng)指標(biāo)。用已知的標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)就可以得出被測(cè)樣知的標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)就可以得出被測(cè)樣本的濃度。此分析方法不受樣本量的限制，而本的濃度。此分析方法不受樣本量的限制，而且可以得到一個(gè)樣本的多個(gè)數(shù)據(jù)。且可以得到一個(gè)樣本的多個(gè)數(shù)據(jù)。精選課件夾心夾心ELISAl缺點(diǎn)：不能顯示出單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的同一性和頻率性的直接信息l細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的免疫熒光檢測(cè)lELISPOTl原位雜交l單一細(xì)胞PCR精選課件細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的流式

9、細(xì)胞儀檢測(cè)l原理：Brefeldin(BFA)、Monensin阻斷了胞內(nèi)高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)方法，使得細(xì)胞因子聚集、蓄積，增強(qiáng)細(xì)胞因子信號(hào)，可被流式細(xì)胞儀檢測(cè)。l用途：檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)多個(gè)細(xì)胞因子；并可區(qū)分表達(dá)特定細(xì)胞因子的細(xì)胞亞群。 精選課件細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的流式細(xì)胞儀檢測(cè)l方法：用抗細(xì)胞因子抗體與細(xì)胞表面或胞內(nèi)特定亞群標(biāo)志組合，即可檢測(cè)不同細(xì)胞亞群細(xì)胞因子的分泌，同時(shí)采用特殊的化學(xué)與抗體選擇，確保靜止與無(wú)細(xì)胞因子分泌細(xì)胞的最小熒光背景。l特點(diǎn)：l快速簡(jiǎn)便：無(wú)需組織培養(yǎng)，可以全血分析，無(wú)需分離PBMCs；靈敏度高：高度靈敏的熒光標(biāo)記與檢測(cè)系統(tǒng)；高效：在同一細(xì)胞內(nèi)同時(shí)

10、檢測(cè)兩種或更多種細(xì)胞因子，也可根據(jù)細(xì)胞免疫表型區(qū)分分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞亞群；接近生物體的分析條件：全血檢測(cè)保留細(xì)胞及生化微環(huán)境更準(zhǔn)確反映了體內(nèi)狀況。精選課件所需儀器所需儀器l流式細(xì)胞儀精選課件所需試劑所需試劑 l細(xì)胞表面染色的熒光標(biāo)記的單抗試劑 l熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體 l激活劑： Phorbol 12-Myristate 13 Acetate (PMA) Ionomycin Staphylococcal enterotoxin B(SEB) l蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑：阻斷高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，使得刺激細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子聚集在胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，以利于準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力 Brefe

11、ldin-A(BFA)：10mg/ml在激活過(guò)程最后4-5小時(shí)使用BFA ，過(guò)度孵育會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力下降 Monensin：3uM http:/ l固定劑：含4%的多聚甲醛PBS溶液l細(xì)胞在體外刺激后需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定。固定的目的在于通過(guò)蛋白的交聯(lián)和變性一方面使細(xì)胞因子固定在細(xì)胞內(nèi)，另一方面避免細(xì)胞表面抗原丟失。l破膜劑：含1皂甙、0.05疊氮化鈉的Hanks溶液（HBBS）l將細(xì)胞膜穿孔，以利于熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與相應(yīng)的細(xì)胞因子結(jié)合 精選課件細(xì)胞培養(yǎng)和刺激的基本方法細(xì)胞培養(yǎng)和刺激的基本方法l人IFN-：人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1

12、uM) 刺激4-24 小時(shí)l人TNF-：使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激小時(shí)l人IL-2：人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小時(shí)l小鼠IL-2：細(xì)胞在包被抗小鼠CD3抗體(25 ug/ml) 的培養(yǎng)板中，使用抗CD28 抗體(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小時(shí)精選課件基本過(guò)程（以全血為例）基本過(guò)程（以全血為例） l、收獲細(xì)胞 l、阻斷Fc受體：消除非特異性的結(jié)合染色l、細(xì)胞表面染色l、固定和破膜l、細(xì)胞內(nèi)染色

13、 精選課件精選課件免疫分析法免疫分析法lELISAl細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的流式細(xì)胞儀檢測(cè) lELISPOT精選課件ELISPOT Enzyme-linked Immunospot Assay 精選課件精選課件ELISPOT發(fā)展歷史發(fā)展歷史l1963年：Jerne等人創(chuàng)立的溶血空斑技術(shù)(hemo-lytic plaque forming cell assay ,HPF),這項(xiàng)技術(shù)可用于檢測(cè)并計(jì)數(shù)單個(gè)抗體形成細(xì)胞。 l1983年：Czerkinsky 等成功地檢測(cè)出因受刺激而分泌抗體的B細(xì)胞頻率l接近體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的環(huán)境，藉由檢測(cè)T細(xì)胞分泌的各類(lèi)細(xì)胞因子，來(lái)定量機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)啟始者Precursor T亞群的

14、大小，預(yù)測(cè)體內(nèi)免疫系統(tǒng)即將進(jìn)行的下游免疫反應(yīng)。 l1996：俄亥俄卅Case Western Reserve大學(xué)Paul Lehmann團(tuán)隊(duì)引進(jìn)PVDF薄膜的應(yīng)用（Forsthuber et al., Science, 1996），解決了低敏感度的問(wèn)題。lNordstrom 等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法來(lái)提高這種方法的敏感性 lHerr用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)(computer-assisted video image analysis ,CVIA) 自動(dòng)分析TNF-酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)的大小和數(shù)量,計(jì)算與負(fù)載抗原肽的靶細(xì)胞接觸后PBMC中抗原特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量 lVaquerano等將

15、數(shù)碼相機(jī)和計(jì)算機(jī)結(jié)合起來(lái),開(kāi)發(fā)出類(lèi)似的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)系統(tǒng),認(rèn)為當(dāng)每孔斑點(diǎn)數(shù)大于100時(shí),這種方法更客觀、可重復(fù)性高且節(jié)省時(shí)間精選課件精選課件檢測(cè)原理檢測(cè)原理 l細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后， 被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。底物孵育后， PVDF 孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過(guò)顯微鏡或ELISPOT 酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果。 精選課件ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序標(biāo)準(zhǔn)操作程序 D1lELISPOT包被程序 l每孔加入15l 70%的乙醇預(yù)濕30秒，PVDF膜變成半透明狀（加樣注意

16、！）l加入100l去離子水洗滌三次，盡量減少乙醇的殘留l每孔加入100l包被抗體工作液，4C包被過(guò)夜 精選課件ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序標(biāo)準(zhǔn)操作程序 D2l傾倒包被液，用PBS洗滌5次，最后一次，在滅菌的吸水紙上扣干l200l試劑盒自帶的稀釋好的封閉液，37C封閉1小時(shí)l傾倒封閉液，無(wú)須洗滌，直接可以進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。（也可以用PBS緩沖液或者純水洗滌一次，拍干，封口，4C保存，可以在4C保存數(shù)周。） 精選課件ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序標(biāo)準(zhǔn)操作程序 D2l鋪細(xì)胞,加入刺激物，培養(yǎng)l正對(duì)照（PHA刺激）10l，終濃度4ug/mL l樣品 l負(fù)對(duì)照（不加刺激物）l背景負(fù)對(duì)照（不含細(xì)胞，只加培養(yǎng)基和所有

17、的檢測(cè)試劑）：100l的U-Cytech無(wú)血清培養(yǎng)基 l設(shè)置2-4個(gè)孔的重復(fù)精選課件ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序標(biāo)準(zhǔn)操作程序 D2l以前做的封閉，可加入以前做的封閉，可加入200l的的U-Cytech無(wú)血清培養(yǎng)無(wú)血清培養(yǎng)基，室溫靜置基，室溫靜置10分鐘，傾倒，然后再重復(fù)一次分鐘，傾倒，然后再重復(fù)一次l加入不同濃度的細(xì)胞，100l/well，細(xì)胞在孔中的分布要盡量均勻l加入刺激物（配制成10X終濃度，10l/well）到實(shí)驗(yàn)孔 l不要再震動(dòng)或者拍擊ELISPOT板 l蓋上板蓋，放入二氧化碳培養(yǎng)箱，37C培養(yǎng)18-24hrl在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中避免移動(dòng)、碰撞培養(yǎng)板。避免開(kāi)關(guān)在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中避免移動(dòng)、碰撞

18、培養(yǎng)板。避免開(kāi)關(guān)培養(yǎng)箱的箱門(mén)！培養(yǎng)箱的箱門(mén)！ 精選課件ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序標(biāo)準(zhǔn)操作程序 D3l培養(yǎng)后操作 l傾倒孔內(nèi)的細(xì)胞及培養(yǎng)基，低滲法將細(xì)胞裂解：每孔加200l冰冷的去離子水，將板置于冰上冰浴10分鐘l200l的PBST洗滌10遍，洗滌最后一遍之后，將板倒扣在吸水紙上拍干l稀釋檢測(cè)抗體，每孔加入100L生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，37C 1小時(shí)l200l 的PBST洗滌5遍，洗滌最后一遍時(shí)，將PVDF膜板的背面的塑料保護(hù)層取下，同時(shí)洗滌膜的正反兩面，蓋上保護(hù)層，將板倒扣在吸水紙上拍干 精選課件ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序標(biāo)準(zhǔn)操作程序 D3l在一個(gè)淺托盤(pán)中盛上干凈的PBST，將膜板的底面浸入，

19、輕輕搖晃幾次即可。（注意：一定要將膜的背面和塑料保護(hù)層上的液體甩干之后，再合攏，蓋上，不要傷害到膜！） 精選課件ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序標(biāo)準(zhǔn)操作程序 D3l稀釋酶標(biāo)的鏈霉親和素，每孔加入100l，37C 1小時(shí)l200l的 PBST洗滌5遍，洗滌最后一遍時(shí)，將PVDF膜板的背面的塑料保護(hù)層取下，同時(shí)洗滌膜的正反兩面，蓋上保護(hù)層，將板倒扣在吸水紙上拍干l解凍已配好的顯色液，每孔加入100l的顯色液，室溫靜置20-30分鐘，注意避光。 精選課件ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序標(biāo)準(zhǔn)操作程序 D3l待斑點(diǎn)生長(zhǎng)到適合的大小之后，以去離子水洗滌2遍，終止顯色過(guò)程l將板倒扣在吸水紙上，拍干細(xì)小的水珠，之后取下保

20、護(hù)層，放在通風(fēng)的地方，室溫靜置10-30分鐘，讓膜自然晾干l注意不要將板放到烤箱內(nèi)，防止膜發(fā)脆、破裂注意不要將板放到烤箱內(nèi)，防止膜發(fā)脆、破裂!lELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000 PRO自動(dòng)讀板儀內(nèi)，調(diào)節(jié)好合適的參數(shù)，斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，并記錄斑點(diǎn)的各種參數(shù)，作統(tǒng)計(jì)分析。 精選課件結(jié)果判定結(jié)果判定l儀器先以高分辨率鏡頭捕捉微小孔中膜上呈色影像；這些影像可以進(jìn)一步使用手動(dòng)、或是自動(dòng)方式計(jì)算斑點(diǎn)數(shù)目l使用ImmuneSpot分析軟件，可以先設(shè)定條件，然后同時(shí)分析斑點(diǎn)的大小，以推估細(xì)胞因子分泌的多寡。l克服傳統(tǒng)顯微鏡判讀方法耗費(fèi)人力、及人為客觀性等缺點(diǎn)lImmunoSpot影像掃描

21、分析儀可以提供不同的數(shù)據(jù)格式，包括未處理與處理過(guò)的膜表面影像、每個(gè)小孔中的斑點(diǎn)數(shù)目、每個(gè)小孔中的平均斑點(diǎn)數(shù)目、每個(gè)小孔中斑點(diǎn)大小的直方統(tǒng)計(jì)圖。精選課件結(jié)果判定結(jié)果判定l計(jì)算機(jī)可以利用斑點(diǎn)的深淺、是否以中心為原點(diǎn)向四周減淡等特征對(duì)細(xì)胞分泌動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行分析 精選課件技術(shù)優(yōu)勢(shì)技術(shù)優(yōu)勢(shì)-與與ELISAlELISA 通過(guò)顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較得出可溶性蛋白總量。lELISPOT 也是通過(guò)顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助的分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)， 1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。

22、（某些研究不僅要測(cè)細(xì)胞因子生成量，還需檢測(cè)分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率細(xì)胞頻率）l由于是單細(xì)胞水平檢測(cè)，ELISPOT比ELISA更靈敏更靈敏，能從20萬(wàn)-30萬(wàn)細(xì)胞中檢出1個(gè)分泌該蛋白的細(xì)胞。l捕獲抗體具有高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素的單抗，在研究者以刺激劑刺激劑激活細(xì)胞時(shí)，不會(huì)影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。 技術(shù)優(yōu)勢(shì)技術(shù)優(yōu)勢(shì)-與有限稀釋法（與有限稀釋法（limiting dilution analysis , LDA） lLDA：對(duì)特異性CTL細(xì)胞進(jìn)行定量,l免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和記憶毒性T淋巴細(xì)胞(memorial CTL, mCTL) 亞群的細(xì)胞周期l需高強(qiáng)度抗原刺激, 這會(huì)加快效應(yīng)CTL(eCTL

23、)凋亡,且不能定量測(cè)定eCTL細(xì)胞數(shù)量或測(cè)定值偏低l較繁瑣,培養(yǎng)時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)23周，而且很容易造成T細(xì)胞數(shù)量損失。 技術(shù)優(yōu)勢(shì)技術(shù)優(yōu)勢(shì)-與四聚體法（與四聚體法（Tetramer）lMHC-類(lèi)分子抗原肽四聚體法定量檢測(cè)抗原特異性CTL 的“金標(biāo)準(zhǔn)”l優(yōu)勢(shì)：迅速、直接、靈敏且特異性強(qiáng),即使當(dāng)體內(nèi)mCTL水平低于1%,用MHC-抗原肽四聚體法仍可直接測(cè)到準(zhǔn)確的值,比LDA 敏感度要高510倍l該技術(shù)的困難：除了合成及穩(wěn)定MHC類(lèi)分子的技術(shù)困難外,最主要缺點(diǎn)是表位的選擇。由于每次反應(yīng)只能分析單一的抗原表位,而MHC類(lèi)分子結(jié)合的各種表位,能否形成CTL反應(yīng),卻隨著基因背景及時(shí)間的變化而變化。l優(yōu)勢(shì)表位的篩選可以通過(guò)Elispot 來(lái)進(jìn)行,但對(duì)整個(gè)肽庫(kù)進(jìn)行掃描,并不容易。當(dāng)然,生物信息學(xué)的運(yùn)用對(duì)表位的篩選有很大的幫助。l有研究結(jié)果表明,并非所有經(jīng)過(guò)Tetramer 鑒定的陽(yáng)性細(xì)胞都有確切的功能, Tetramer陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)是用ELISPOT分