生物選修三 1.1DNA重組技術的基本工具

1、設想一 能否培養(yǎng)出具有抗蟲性狀的抗蟲棉呢？ 設想二 這些定向改造基因的設想能實現嗎？基因工程基因工程 抗蟲棉的抗蟲棉的培育有哪些培育有哪些關鍵步驟？關鍵步驟？DNA DNA 重組技術的基本工具重組技術的基本工具本節(jié)知識內容本節(jié)知識內容 1 DNA1 DNA重組技術的基本工具重組技術的基本工具專題一專題一 基因工程基因工程“分子手術刀分子手術刀” ” 限制酶限制酶 “分子縫合針分子縫合針” ” DNADNA連接酶連接酶 “分子運輸車分子運輸車” 基因進入受體細胞的載體基因進入受體細胞的載體 黏性末端黏性末端平末端平末端12345脫氧核苷酸的結構脫氧核苷酸的結構 G1234512345 A3,5-

2、磷磷酸二酯酸二酯鍵鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵11仔細觀察各限制酶仔細觀察各限制酶 識別的特定序列有識別的特定序列有何何 特點？特點？限制酶的識別序列限制酶的識別序列限制酶所識別的序列的特點是：限制酶所識別的序列的特點是：呈現堿基互補對稱，無論是呈現堿基互補對稱，無論是6個個堿基還是堿基還是4個堿基，都可以找到個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側的一條中心軸線，中軸線兩側的雙鏈雙鏈DNA上的堿基是上的堿基是反向對稱反向對稱重復重復排列的排列的 ，稱為，稱為回文序列回文序列中軸線在G與A之間切割大腸桿菌的一種限制酶(EcoR)只能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。EcoRIEcoRI限制

3、酶的作用限制酶的作用黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoRIEcoRI限制酶的切割限制酶的切割 被限制酶切開的被限制酶切開的DNA兩條兩條單鏈的切口，帶有幾個單鏈的切口，帶有幾個伸出的伸出的核苷酸核苷酸，他們之間正好互補配他們之間正好互補配對，這樣的切口叫對，這樣的切口叫黏性末端黏性末端。SmaISmaI限制酶的切割限制酶的切割當限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的當限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNADNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端平末端。限制性內切酶作用過程SmaISmaI只能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切

4、開。中軸線SmaISmaI限制酶的作用限制酶的作用在G與C之間切割你能推測限制酶存在于原核生物中的你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？作用是什么嗎？原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵，的入侵，但生物但生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。制，以防止外來病原物的侵害。限制酶限制酶就是細就是細菌的一種菌的一種防御性工具，防御性工具，當外源當外源DNA侵入時，會侵入時，會利用限制酶利用限制酶將外源將外源DNA切割掉，切割掉，以保證自身的以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到安全。所以

5、，限制酶在原核生物中主要起到切切割外源割外源DNA、使之失效，從而達到保護自身的、使之失效，從而達到保護自身的目的。目的。尋根問底尋根問底為什么限制酶不剪切細菌本身的為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA？通過長期的進化，細菌中含有某種限制酶通過長期的進化，細菌中含有某種限制酶的細胞，其的細胞，其DNADNA分子中分子中不具備這種限制酶不具備這種限制酶的識別切割序列的識別切割序列，或者，或者通過甲基化酶將甲通過甲基化酶將甲基轉移到所識別序列的堿基上，使限制酶基轉移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的種限制酶也不

6、會使自身的DNADNA被切斷，并被切斷，并且可以防止外源且可以防止外源DNADNA的入侵。的入侵。 基因的針線：基因的針線：DNA連接酶連接酶G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G用同種限制酶切割用同種限制酶切割類型來源功能相同點差別EcoliDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體恢復磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)閱讀課本第閱讀課本第5頁頁“分子縫合針”DNA連接酶的相關

7、內容，填寫下表的相關內容，填寫下表自主學習自主學習ATGCATGC連接酶連接磷酸二酯鍵連接酶連接磷酸二酯鍵DNADNA連接酶的作用過程：連接酶的作用過程：二、分子縫合針二、分子縫合針DNA連接酶連接酶 T磷磷酸酸二二酯酯鍵鍵1234512345 A作用部位：作用部位：（扶手）（扶手）（梯子）（梯子）DNA聚合酶聚合酶和和DNA連接酶有何連接酶有何相同點和不同點？相同點和不同點？DNA連接酶連接酶DNA聚合酶聚合酶連接連接DNA鏈鏈連接部位連接部位雙鏈雙鏈在兩在兩DNADNA片片斷之間形成斷之間形成磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵單鏈單鏈將單個核苷酸加將單個核苷酸加到已存在的核酸到已存在的核酸片斷片斷33末

8、端形成末端形成磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵連接黏性末端連接黏性末端連接黏性末端和平末端連接黏性末端和平末端分類分類作用作用E.coli DNA連接酶連接酶連接酶種類：連接酶種類：T4DNA連接酶連接酶核苷酸分子的連接：核苷酸分子的連接：ATGCATGCDNADNA聚合酶連接單鏈聚合酶連接單鏈DNADNA把單個脫氧核苷酸連接到把單個脫氧核苷酸連接到DNADNA片段上片段上三、分子運輸車三、分子運輸車基因進入受基因進入受體細胞的載體體細胞的載體 要讓一個從甲生物細胞內取出來的基因在乙生要讓一個從甲生物細胞內取出來的基因在乙生物體內進行表達，首先得將這個基因送到乙生物的物體內進行表達，首先得將這個基因送到乙

9、生物的細胞內去！細胞內去！能將外源基因送入受體細胞的工具能將外源基因送入受體細胞的工具就是就是載體載體?；蚬こ痰妮d體被喻為基因工程的載體被喻為：分子運輸車分子運輸車基因工程的載體來源基因工程的載體來源：作為基因工程的載體需要怎樣的條件呢？作為基因工程的載體需要怎樣的條件呢？作為載體的必要條件作為載體的必要條件 1. 1.能自我復制能自我復制 能進入受體生物細胞并在受體生物細胞內復制能進入受體生物細胞并在受體生物細胞內復制并表達；并表達； 2.2.有一個至多個限制酶切位點有一個至多個限制酶切位點 能與目的基因結合能與目的基因結合 3.3.有遺傳標記基因有遺傳標記基因 便于觀察便于觀察 4.4.

10、對受體細胞無害、易分離對受體細胞無害、易分離 安全、比較容易得到安全、比較容易得到1 1、能自我復制、能自我復制2 2、具有一個或多個限制酶切點、具有一個或多個限制酶切點3 3、具有遺傳標記基因、具有遺傳標記基因4 4、對受體細胞無害、易分離、對受體細胞無害、易分離5 5、大小適合，便于操作、大小適合，便于操作質粒作為運載體的條件？在進行基因工程操作中在進行基因工程操作中,真正被用作載體的質粒都是在真正被用作載體的質粒都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的天然質粒的基礎上進行過人工改造的基因操作基因操作的基本步驟的基本步驟 目目的基因是人們所的基因是人們所需要轉移需要轉移或或改造改造的基因。的

11、基因。 如如蘇云金芽孢桿菌的蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因抗蟲基因，還有，還有植物的植物的抗?。共《?、抗細菌）基因抗病（抗病毒、抗細菌）基因、種、種子子貯藏蛋白的基因貯藏蛋白的基因，以及人的，以及人的胰島素基因、胰島素基因、干擾素基因干擾素基因等。等。 步驟一步驟一：提取提取目的基因目的基因 步驟二：目的基因與運載體重組步驟二：目的基因與運載體重組 1 1）用）用一種一種限制酶切割運載體限制酶切割運載體（質粒），（質粒），使其出現使其出現一個切口一個切口，露出，露出黏性末端黏性末端。 2 2）用）用同一種同一種限制酶限制酶切斷目的基因切斷目的基因，使其，使其產生產生相同相同的的黏性末端黏性末端。

12、3 3）將切下的目的基因片段）將切下的目的基因片段插入運載體插入運載體（質粒）的（質粒）的切口處，再加入適量切口處，再加入適量DNADNA連接酶連接酶，形成了一個形成了一個重組重組DNADNA分子分子（重組質粒）（重組質粒） 目目的基因與運載體的結合過程，實際的基因與運載體的結合過程，實際上是不同來源的上是不同來源的基因重組基因重組的過程的過程。基因操作基因操作的基本步驟的基本步驟 常用的受體細胞：常用的受體細胞： 有有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌、大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌、酵母菌和動植物細胞等。酵母菌和動植物細胞等。 將目的基因導入受體細胞的原理將目的基因導入受體細胞的原理借助借助細

13、菌細菌或病毒侵染細胞或病毒侵染細胞的途徑，的途徑，還有顯微注射法。還有顯微注射法。 步驟三：目的基因導入受體細胞步驟三：目的基因導入受體細胞步驟四：目的基因的檢測和表達步驟四：目的基因的檢測和表達1 1、篩選具有目的基因的受體細胞的依據：、篩選具有目的基因的受體細胞的依據：運載體上的標記基因是否表達運載體上的標記基因是否表達2 2、判斷目的基因是否表達：、判斷目的基因是否表達：目的基因是否控制合成了相應目的基因是否控制合成了相應的產物，表達了相關的性狀。的產物，表達了相關的性狀?；虿僮骰虿僮鞯幕静襟E的基本步驟基基因操作的基本步驟因操作的基本步驟 步驟四：目的基因的檢測和表達步驟四：目的基

14、因的檢測和表達四環(huán)素四環(huán)素抗性基因抗性基因氨芐青霉氨芐青霉素抗性基因素抗性基因重組重組DNADNA分子的模擬操作分子的模擬操作 材料用具：材料用具： 紙圈模擬質粒，長方形紙板模擬目紙圈模擬質粒，長方形紙板模擬目的基因所在的基因所在DNADNA片段，剪刀代表限制酶，片段，剪刀代表限制酶，透明膠代表透明膠代表DNADNA連接酶。連接酶。重組重組DNADNA分子的模擬操作分子的模擬操作 方法步驟：方法步驟：1 1、根據堿基互補配對原則，將紙板上相應互補鏈的堿基序列、根據堿基互補配對原則，將紙板上相應互補鏈的堿基序列補充完整。補充完整。2 2、根據質粒和目的基因所在片段上堿基排列特點，選擇合適、根據質

15、粒和目的基因所在片段上堿基排列特點，選擇合適的限制酶進行切割。的限制酶進行切割。 （1 1）EcoREcoR限制酶只能識別限制酶只能識別GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之間切之間切開形成黏性末端。開形成黏性末端。 （2 2）HindHind限制酶只能識別限制酶只能識別AAGCTTAAGCTT序列，并在序列，并在A A和和A A之間切之間切開形成黏性末端。開形成黏性末端。3 3、將切下的目的基因重組到質粒的切口處，用透明膠將切口、將切下的目的基因重組到質粒的切口處，用透明膠將切口黏結起來，完成重組黏結起來，完成重組DNADNA分子的模擬制作。分子的模擬制作。 如果你的

16、操作是正確的，不同顏色的黏性末端能夠互如果你的操作是正確的，不同顏色的黏性末端能夠互補配對。如果你制作的黏性末端不能互補配對，說明操作補配對。如果你制作的黏性末端不能互補配對，說明操作有誤，應檢查出錯的原因。有誤，應檢查出錯的原因。課本知識回顧課本知識回顧 基因工程又叫做基因工程又叫做 或或 。通俗地說，就。通俗地說，就是按照人們的意愿，把一種生物是按照人們的意愿，把一種生物的某種的某種 提取出來，加以提取出來，加以 ， 然后然后放到另一種生物的細胞里，放到另一種生物的細胞里， 改造生物的遺傳性狀。改造生物的遺傳性狀。基因拼接技術基因拼接技術DNA重組技術重組技術基因基因修飾改造修飾改造定向地

17、定向地DNA 重組技術的基本工具重組技術的基本工具“分子手術刀分子手術刀” “分子縫合針分子縫合針” “分子運輸車分子運輸車”限制限制（性核酸內切）（性核酸內切）酶酶DNA連接酶連接酶基因進入受體細胞的載體基因進入受體細胞的載體原核生物中分離純化出來原核生物中分離純化出來特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵粘性末端粘性末端平末端平末端1、種類：、種類：2、作用部位：、作用部位：兩類兩類連接黏性末端連接黏性末端Ecoli DNA連接酶連接酶T4 DNA連接酶連接酶磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵連接黏性末端和平末端連接黏性末端和平末端通常有三種通常有三種:作為載體的條件：作為載體的條件： 在

18、進行基因工程操作中在進行基因工程操作中,真正被用作載體的質粒都是真正被用作載體的質粒都是在在 質粒質粒噬菌體衍生物噬菌體衍生物動植物病毒動植物病毒天然質粒天然質粒人工改造人工改造的的能自我復制；有切割位點；能自我復制；有切割位點；有遺傳標記基因；對受體細胞無害、易分離有遺傳標記基因；對受體細胞無害、易分離基礎上進行過基礎上進行過在基因工程中，切割運載體和在基因工程中，切割運載體和含有目的基因的含有目的基因的DNA片段，需片段，需使用（使用（ ）A.同種限制酶同種限制酶 B. 兩種限制酶兩種限制酶C.同種連接酶同種連接酶 D. 兩種連接酶兩種連接酶P4 尋根問底尋根問底 1.1.根據你所掌握的知

19、識，你能分析出限制酶存根據你所掌握的知識，你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？在于原核生物中的作用是什么嗎？ 提示：原核生物容易受到自然界外源提示：原核生物容易受到自然界外源DNADNA的入的入侵，但是，生物在長期的進化過程中形成了一侵，但是，生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細菌的一種防御性工具，當外源限制酶就是細菌的一種防御性工具，當外源DNADNA侵入時，會利用限制酶將外源侵入時，會利用限制酶將外源DNADNA切割掉，切割掉，以保證自身的安全。以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物所以，

20、限制酶在原核生物中主要起到切割外源中主要起到切割外源DNADNA、使之失效，從而達、使之失效，從而達到保護自身的目的。到保護自身的目的。P6 尋根問底尋根問底 2. DNA2. DNA連接酶與連接酶與DNADNA聚合酶是一回事嗎？為什么聚合酶是一回事嗎？為什么？ 答：不是一回事。答：不是一回事。 基因工程中所用的連接酶有兩種：一種是基因工程中所用的連接酶有兩種：一種是從大腸桿菌中分離得到的，稱之為從大腸桿菌中分離得到的，稱之為E Ecolicoli連接連接酶。另一種是從酶。另一種是從T4T4噬菌體中分離得到，稱為噬菌體中分離得到，稱為T4T4連接酶。這兩種連接酶催化反應基本相同，都連接酶。這兩

21、種連接酶催化反應基本相同，都是連接雙鏈是連接雙鏈DNADNA的缺口（的缺口（nicknick），而不能連接單），而不能連接單鏈鏈DNADNA。DNADNA連接酶和連接酶和DNADNA聚合酶都是形成磷酸二聚合酶都是形成磷酸二酯鍵酯鍵（在相鄰核苷酸的（在相鄰核苷酸的3 3位碳原子上的羥基與位碳原子上的羥基與5 5位碳原子上所連磷酸基團的羥基之間形成），位碳原子上所連磷酸基團的羥基之間形成），那么，二者的那么，二者的差別差別主要表現在什么地方呢？主要表現在什么地方呢？尋根問底尋根問底 （1 1）DNADNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段核酸片段的的33末端的

22、羥基上，形成磷酸二酯鍵末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而；而DNADNA連接酶是在兩個連接酶是在兩個DNADNA片段之間形成磷酸片段之間形成磷酸二酯鍵二酯鍵，不是在單個核苷酸與，不是在單個核苷酸與DNADNA片段之間形成片段之間形成磷酸二酯鍵。磷酸二酯鍵。 （2 2）DNADNA聚合酶是以一條聚合酶是以一條DNADNA鏈為模板鏈為模板，將單個，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補的的DNADNA鏈；而鏈；而DNADNA連接酶是將連接酶是將DNADNA雙鏈上的兩個缺雙鏈上的兩個缺口同時連接起來。因此口同時連接起來。因此DNADNA連接酶不需要模板連

23、接酶不需要模板。 此外，二者雖然都是由蛋白質構成的酶，但組此外，二者雖然都是由蛋白質構成的酶，但組成和性質各不相同。成和性質各不相同。P7 P7 思考與探究思考與探究 1.1.限制酶在限制酶在DNADNA的任何部位都能將的任何部位都能將DNADNA切開嗎？以切開嗎？以下是四種不同限制酶切割形成的下是四種不同限制酶切割形成的DNADNA片段：片段： (1) CTGCA (2) AC (3) GC G TG CG (4) G (5) G (6) GC CTTAA ACGTC CG (7) GT (8)AATTC CA G 你是否能用你是否能用DNADNA連接酶將它們連接起來？連接酶將它們連接起來？

24、 答：答： 2 2和和7 7能連接形成能連接形成ACGTACGT TGCATGCA； 4 4和和8 8能連接形成能連接形成GAATTCGAATTC CTTAAGCTTAAG； 3 3和和6 6能連接形成能連接形成GCGCGCGC CGCGCGCG； 1 1和和5 5能連接形成能連接形成CTGCAGCTGCAG GACGTCGACGTC。 2.2.聯系你已有的知識，想一想，為什么細菌中限聯系你已有的知識，想一想，為什么細菌中限制酶不剪切細菌本身的制酶不剪切細菌本身的DNADNA？ 提示：迄今為止，基因工程中使用的限制酶絕大提示：迄今為止，基因工程中使用的限制酶絕大部分都是從細菌或霉菌中提取出來的

25、，它們各自部分都是從細菌或霉菌中提取出來的，它們各自可以識別和切斷可以識別和切斷DNADNA上特定的堿基序列。上特定的堿基序列。 細菌中限制酶之所以不切斷自身細菌中限制酶之所以不切斷自身DNADNA，是因為微，是因為微生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，對于外源入侵的機制，對于外源入侵的DNADNA可以降解掉。可以降解掉。 生物在長期演化過程中，含有某種限制酶的細胞生物在長期演化過程中，含有某種限制酶的細胞，其，其DNADNA分子中或者分子中或者不具備這種限制酶的識別切不具備這種限制酶的識別切割序列割序列，或者，或者通過甲基化酶將甲基轉移到

26、所識別通過甲基化酶將甲基轉移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。 這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的的DNADNA被切斷，并且可以防止外源被切斷，并且可以防止外源DNADNA的入侵。的入侵。P7 P7 思考與探究思考與探究 3.3.天然的天然的DNADNA分子可以直接用做基因工程載體嗎分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？為什么？ 提示：基因工程中作為載體使用的提示：基因工程中作為載體使用的DNADNA分子很多分子很多都是質粒（都是質粒（plasmidplasmid），即獨立于細菌擬核處染），即獨立于細菌擬核處染色體色體DNADNA之外的一種可以自我復制、雙鏈閉環(huán)的之外的一種可以自我復制、雙鏈閉環(huán)的裸露的裸露的DNADNA分子。是否任何質粒都可以作為基因分子。是否任何質粒都可以作為基因工程載體使用呢？其實不然，作為基因工程使用工程載體使用呢？其實不然，作為基因工程