第3章 滅菌技術(shù)問題

1、p滅菌原理與技術(shù)簡(jiǎn)介滅菌原理與技術(shù)簡(jiǎn)介p培養(yǎng)基制備與滅菌培養(yǎng)基制備與滅菌p空氣滅菌流程與設(shè)備空氣滅菌流程與設(shè)備p反應(yīng)器相關(guān)滅菌技術(shù)反應(yīng)器相關(guān)滅菌技術(shù) 生化反應(yīng)過程多為純培養(yǎng)過程，必需對(duì)生產(chǎn)的過程進(jìn)行滅菌處理，其實(shí)質(zhì)是對(duì)有害微生物的控制和消除。第一節(jié)第一節(jié) 滅菌原理與技術(shù)簡(jiǎn)介滅菌原理與技術(shù)簡(jiǎn)介第一節(jié)第一節(jié) 滅菌原理與技術(shù)簡(jiǎn)介滅菌原理與技術(shù)簡(jiǎn)介消毒(disinfection)：殺死或消除物體上的病原微生物的方法滅菌（sterilition）：殺死物體上全部微生物的方法防腐(antisepsis)：用理化方法防止抑制微生物生長(zhǎng)的方法幾個(gè)基本概念幾個(gè)基本概念化療(chemotherapy)：利用對(duì)病源

2、菌具有高度毒力而對(duì)宿主基本無毒的化學(xué)物質(zhì)來抑制宿主體內(nèi)病源微生物的生長(zhǎng)繁殖 控制微生物的物理因素控制微生物的物理因素高溫滅菌輻射作用高滲作用干燥超聲波控制微生物的化學(xué)因素控制微生物的化學(xué)因素表面消毒劑化學(xué)治療劑高溫滅菌高溫滅菌p多數(shù)細(xì)菌，酵母菌和霉菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和病毒在50-65 10 min可以致死。一般噬菌體6580 致死；放線菌、霉菌的孢子比營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞抗熱性強(qiáng)，7680 10min可以殺死；細(xì)菌芽孢，在100 下20min才能致死；同種微生物老齡菌比幼菌耐熱。 p滅菌方法： 濕熱滅菌 （mosist heat sterilization） 干熱滅菌（ dry heat sterilizati

3、on）p該法比干熱滅菌效果好，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在有水的情況下容易凝固，如含水50，蛋白質(zhì)凝固溫度為56；含水蛋白質(zhì)凝固溫度為160-170濕熱滅菌濕熱滅菌(mosist heat sterilization)煮沸滅菌法（煮沸消毒法）煮沸滅菌法（煮沸消毒法）高壓蒸汽滅菌法高壓蒸汽滅菌法巴斯德消毒法：（巴氏消毒法）巴斯德消毒法：（巴氏消毒法）高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌是濕熱滅中最好方法，通常在1.05kg/cm2,的壓力下面（此時(shí)溫度121）處理1530min。實(shí)驗(yàn)室中是培養(yǎng)基滅菌的最常用方法。工業(yè)中利用飽和蒸汽進(jìn)行培養(yǎng)基和設(shè)備、管道等的滅菌。就是直接用高溫蒸汽滅菌。蒸汽在冷凝時(shí)釋放出大量潛能，蒸汽具有強(qiáng)

4、大穿透力，蒸汽的濕熱破壞菌體蛋白質(zhì)和核酸的化學(xué)鍵，使酶失活，微生物因代謝障而死亡。低溫維持法高溫瞬時(shí)滅菌巴氏消毒法(pasteurization)是食品（牛奶）釀造（啤酒）工業(yè)中常用的方法。具體做法是61.762.8處理30min或71.6度處理15min，這樣即可殺死病原微生物。又不致?lián)p壞營(yíng)養(yǎng)，可保留食品飲料原有用味。根據(jù)結(jié)核桿菌在62下15min被致死。紫外線紫外線殺菌機(jī)制： 誘導(dǎo)核酸形成胸腺嘧啶二聚體，從而干擾了核酸的復(fù)制常用于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的滅菌，以物品表面的滅菌各種微生物對(duì)紫外線抗性不同干細(xì)胞強(qiáng)于濕細(xì)胞；干細(xì)胞強(qiáng)于濕細(xì)胞；芽孢，孢子強(qiáng)于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞；芽孢，孢子強(qiáng)于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞；多倍體二倍體單倍體

5、多倍體二倍體單倍體有機(jī)化合物有機(jī)化合物甲醛：純甲醛為氣體，3740水液為福爾馬林。醇是脫水劑蛋白質(zhì)變性劑,70乙醇?xì)⒕Ч詈?。酚?5的石碳酸溶液幾分鐘即可致死細(xì)菌甲酚殺菌力最強(qiáng)，煤酚皂液（來蘇爾）為甲酚和肥皂的混合液 。K2MnO4使菌體蛋白質(zhì)氧化，使酶失活。 013濃度可用于皮膚，果品、餐具、消毒。H2O2清洗傷口。第二節(jié)第二節(jié) 培養(yǎng)基的制備與滅菌培養(yǎng)基的制備與滅菌培養(yǎng)基的配置培養(yǎng)基的配置培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基的滅菌（一）培養(yǎng)基的配置（一）培養(yǎng)基的配置 一、碳源一、碳源1、作用提供微生物菌種的生長(zhǎng)繁殖所需的能源和合成菌體所必需的碳成分 。提供合成目的產(chǎn)物所必須的碳成分2、來源糖類、油脂、有機(jī)

6、酸、正烷烴二、氮源二、氮源 氮源主要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)（氨基酸，蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物。常用的氮源可分為兩大類：有機(jī)氮源和無機(jī)氮源。 1、無機(jī)氮源種類：氨鹽、硝酸鹽和氨水特點(diǎn)：微生物對(duì)它們的吸收快，所以也稱之謂迅速利用的氮源。但無機(jī)氮源的迅速利用常會(huì)引起pH的變化如： (NH4)2SO4 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH 無機(jī)氮源被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質(zhì)，這種經(jīng)微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質(zhì)的無機(jī)氮源叫生理酸性物質(zhì)，如硫酸胺，若菌體代謝后能產(chǎn)生堿性物質(zhì)的則此種無機(jī)氮源稱為生理堿性物質(zhì)，如硝酸鈉。正

7、確使用生理酸堿性物質(zhì)，對(duì)穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的pH有積極作用。 所以選擇合適的無機(jī)氮源有兩層意義：所以選擇合適的無機(jī)氮源有兩層意義： q 滿足菌體生長(zhǎng)滿足菌體生長(zhǎng)q 穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH2、有機(jī)氮源來源：工業(yè)上常用有機(jī)氮源都是一些廉價(jià)的原料，花生餅粉、 黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、 酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、尿素、酒糟等。成分復(fù)雜：除提供氮源外，有些有機(jī)氮源還提供大量的無機(jī) 鹽及生長(zhǎng)因子。例 玉米漿： 可溶性蛋白、生長(zhǎng)因子（生物素）、苯乙酸 較多的乳酸 硫、磷、微量元素等氮源使用的一些相關(guān)問題：q 有機(jī)氮源和無機(jī)氮源應(yīng)當(dāng)混合使用早期：容易利用易同化的氮

8、源無機(jī)氮源中期：菌體的代謝酶系已形成、則利用蛋白質(zhì)q 有些產(chǎn)物會(huì)受氮源的誘導(dǎo)和阻遏例： 蛋白酶的生產(chǎn)q 有機(jī)氮源選取時(shí)也要考慮微生物的同化能力q 開發(fā)效果好、有針對(duì)性的有機(jī)氮源仍然是令人感興趣 的課題三、無機(jī)鹽的微量元素三、無機(jī)鹽的微量元素1、作用：各種不一樣2、來源：C、N源，以鹽的形式補(bǔ)充3、用量：根據(jù)具體的產(chǎn)品，以實(shí)驗(yàn)決定例：鐵離子 青霉素發(fā)酵中，鐵離子的濃度要小于20g/ml 發(fā)酵罐必須進(jìn)行表面處理B、使用時(shí)注意鹽的形式（pH的變化）例：黑曲酶NRRL-330,生產(chǎn)-淀粉酶，PH對(duì)酶活的影響 pH 酶活不加 4.25 120分鐘加 K2HPO4 5.45 30分鐘加 KH2PO4 4.

9、62 75分鐘使用注意點(diǎn)使用注意點(diǎn)A. 對(duì)于其它渠道有可能帶入的過多的某種無機(jī)離子和 微量元素在發(fā)酵過程中必須加以考慮四、生長(zhǎng)因子、前體和產(chǎn)物促進(jìn)劑四、生長(zhǎng)因子、前體和產(chǎn)物促進(jìn)劑 從廣義上講，凡是微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量的有機(jī)物質(zhì)，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長(zhǎng)因子。 1、生長(zhǎng)因子 如以糖質(zhì)原料為碳源的谷氨酸生產(chǎn)菌均為生物素缺陷型，以生物素為生長(zhǎng)因子,生長(zhǎng)因子對(duì)發(fā)酵的調(diào)控起到重要的作用 。 有機(jī)氮源是這些生長(zhǎng)因子的重要來源，多數(shù)有機(jī)氮源含有較多的B簇維生素和微量元素及一些微生物生長(zhǎng)不可缺少的生長(zhǎng)因子 前體指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接彼微生物在生物合成過程中合成到產(chǎn)物物分子中去

10、，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。2、前體、前體青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136用法：前體使用時(shí)普遍采用流加的方法 前體一般都有毒性，濃度過大對(duì)菌體的生長(zhǎng)不利 苯乙酸，一般基礎(chǔ)料中僅僅添加0.07% 前體相對(duì)價(jià)格較高，添加過多，容易引起揮發(fā)和氧化， 流加也有利于提高前提的轉(zhuǎn)化率3、產(chǎn)物促進(jìn)劑、產(chǎn)物促進(jìn)劑 所謂產(chǎn)物促進(jìn)劑是指那些非細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑。 促進(jìn)劑提高產(chǎn)量的機(jī)制還不完全清楚，其原因是多方面的。 有些促進(jìn)劑本身是酶的誘導(dǎo)物； 有些促進(jìn)劑是表面活性劑，可改善細(xì)胞的透性，改善 細(xì)胞與氧的接觸從而促進(jìn)酶

11、的分泌與生產(chǎn)， 也有人認(rèn)為表面活性劑對(duì)酶的表面失活有保護(hù)作用； 有些促進(jìn)劑的作用是沉淀或螯合有害的重金屬離子。五、水五、水 對(duì)于發(fā)酵工廠來說，恒定的水源是至關(guān)重要的，因?yàn)樵诓煌粗写嬖诘母鞣N因素對(duì)微生物發(fā)酵代謝影響甚大。 水源質(zhì)量的主要考慮參數(shù)包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量。 對(duì)于釀造行業(yè)，水的重要性不言而喻對(duì)于常規(guī)發(fā)酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清潔的水。第二節(jié)第二節(jié) 培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基的滅菌主要采用高溫濕熱滅菌的方法。主要采用高溫濕熱滅菌的方法。如何確定滅菌條件？如何確定滅菌條件？它的理論基礎(chǔ)是什么？它的理論基礎(chǔ)是什么？1.1.微生物的受熱死亡動(dòng)力學(xué)微生

12、物的受熱死亡動(dòng)力學(xué)( (對(duì)數(shù)殘存律）對(duì)數(shù)殘存律）培養(yǎng)基滅菌的依據(jù)：殺死細(xì)菌的芽孢。培養(yǎng)基滅菌的依據(jù)：殺死細(xì)菌的芽孢。kNdtdN式中：N是活菌體濃度，個(gè)數(shù)/ml或g/ml; k比死亡速率常數(shù)，min-1; t時(shí)間，min。NNkt0log1303. 2k值越小，表面微生物越不易熱死，反之越易熱死。值越小，表面微生物越不易熱死，反之越易熱死。p溫度對(duì)死亡速率的影響溫度對(duì)死亡速率的影響死亡速率常數(shù)k與溫度的關(guān)系，可用阿累尼烏斯公式表達(dá)：)/exp(RTEAk式中：A常數(shù)，min1l; E死亡活化能，J/mol; R氣體常數(shù)，8.314J/mol K; T絕對(duì)溫度，K。上式微分可得：)1(lnTdR

13、Ekd在同樣的溫度變化下，死亡活化能越大的物質(zhì)，在同樣的溫度變化下，死亡活化能越大的物質(zhì)，它的死亡速率變化也越大。（對(duì)溫度變化敏感）它的死亡速率變化也越大。（對(duì)溫度變化敏感）p微生物受熱死亡的活化能，一般要比營(yíng)養(yǎng)成分熱分解的活化能大得多。所以，當(dāng)溫度升高時(shí)，微生物死亡速率的增加，要比營(yíng)養(yǎng)成分破壞速率的增加大得多。p在較高溫度下可以通過縮短滅菌時(shí)間而減少營(yíng)養(yǎng)成分的損失，這是高溫瞬時(shí)滅菌法的理論基礎(chǔ)。間歇滅菌2.2.培養(yǎng)基間歇滅菌培養(yǎng)基間歇滅菌又稱分批滅菌，是將配制好的培養(yǎng)基和所有設(shè)備一起進(jìn)行滅菌的操作，也稱實(shí)罐滅菌。特點(diǎn)是不需其他的附屬設(shè)備，操作簡(jiǎn)便，國(guó)內(nèi)外常用。缺點(diǎn)是加熱和冷卻時(shí)間較長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)成

14、分有損失，罐利用低。為中小型生產(chǎn)企業(yè)采用。 分批滅菌過程 升溫、保溫和降溫，滅菌主要是在保溫過程中實(shí)現(xiàn)的，在升溫的后期和冷卻的初期，培養(yǎng)基的溫度很高，因而對(duì)滅菌也有一定貢獻(xiàn)。 T 滅菌溫度tot1t2t3timeN1 N2 N升溫保溫降溫N0 Ln(N0 / N1)Ln(N2 / N) Ln(N1 / N2)要求絕對(duì)的無菌在工業(yè)上很難做到，因?yàn)橛蓪?duì)數(shù)殘存律可知： NNkt0log1303. 2N=0， t= 。因此，絕對(duì)的無菌很難做到。設(shè)計(jì)中常采用N0.001（1000次滅菌中有一次失?。╅g歇滅菌的升溫階段和降溫階段對(duì)滅菌的貢獻(xiàn)相對(duì)較小，而對(duì)培養(yǎng)基中維生素類物質(zhì)的破壞作用則可能很嚴(yán)重。應(yīng)盡量縮

15、短提溫和降溫階段。 生產(chǎn)中一般采取生產(chǎn)中一般采取121維持維持30min的方法。的方法。3.3.培養(yǎng)基連續(xù)滅菌培養(yǎng)基連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌時(shí)，培養(yǎng)基能在短時(shí)間內(nèi)加熱到保溫溫度并能很快被冷卻，因此，與分批滅菌相比，可在更高的溫度下滅菌，而保溫時(shí)間則很短，有利于減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的破壞。 其它常用的除菌方法p膜過濾除菌膜過濾除菌 是通過機(jī)械作用濾去液體或氣體中細(xì)菌的方法。根據(jù)不同的需要選用不同的濾器和濾板材料。 微孔濾膜過濾器是由上下二個(gè)分別具有出口和入口連接裝置的塑料蓋盒組成，出口處可連接針頭，人口處可連接針筒，使用時(shí)將濾膜裝入兩塑料蓋盒之間，旋緊蓋盒，當(dāng)溶液從針筒注入濾器時(shí)，此濾器將各種微生物阻留在微孔濾

16、膜上面，從而達(dá)到除菌的目的。根據(jù)待除菌溶液量的多少，可選用不同大小的濾器。 此法除菌的最大優(yōu)點(diǎn)是可以不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分，但由于濾量有限，所以一般只適用于實(shí)驗(yàn)室中小量溶液的過濾除菌。第三節(jié)第三節(jié) 空氣的滅菌空氣的滅菌 需氧微生物在發(fā)酵過程中需要耗用氧氣，氧氣通常由空氣提供。因此，在純培養(yǎng)過程中，空氣的除菌是需氧發(fā)酵的重要環(huán)節(jié)。1.1.空氣除菌的方法空氣除菌的方法p熱殺菌法 理論上講，空氣滅菌可以采用加熱的方法。但空氣用量很大，且空氣的傳熱效果較差。所以，用蒸汽加熱滅菌是不合理的。p過濾除菌法 是讓含菌空氣通過過濾介質(zhì)，以阻截所含的微生物，而獲得無菌空氣。該方法是工業(yè)中常用的方法。 過

17、濾除菌可分為絕對(duì)過濾和深層過濾。p其它方法 輻射法、化學(xué)法、靜電除菌法。一般只限于實(shí)驗(yàn)室使用。2.2.空氣過濾除菌的原理空氣過濾除菌的原理p深層過濾所用的介質(zhì)間歇一般大于固體顆粒。那么，空氣中的菌體如何被除去呢？ 是依靠氣流通過濾層時(shí)，基于濾層纖維網(wǎng)格的層層阻礙，迫使氣流不斷改變氣速大小和方向，使菌體與濾層纖維間發(fā)生慣性撞擊、攔截滯留、布朗擴(kuò)散、重力沉降和靜電吸附等作用，來達(dá)到過濾除菌的目的。3.3.空氣過濾的對(duì)數(shù)穿透定律空氣過濾的對(duì)數(shù)穿透定律p空氣過濾時(shí)，微粒在濾層內(nèi)的減少速率，正比于微粒的濃度，即：KNdldN式中：dN/dl通過單位濾層厚度時(shí)，菌體數(shù)的減少； k阻塞因數(shù)（1/cm或1/m

18、）。KLNN0ln4.4.常用的過濾介質(zhì)常用的過濾介質(zhì)p棉花 p玻璃纖維 p活性碳p超細(xì)玻璃纖維紙p燒結(jié)材料過濾介質(zhì) p新型過濾介質(zhì) 如超濾膜5.5.空氣過濾流程空氣過濾流程a.高空采風(fēng)、兩次冷卻、兩次分油水、適當(dāng)加熱流程 p特點(diǎn)特點(diǎn) ：兩次冷卻、兩次分油水、適當(dāng)加熱?？諝獾谝淮卫鋮s到3035，第二級(jí)冷卻至2025，經(jīng)分水后加熱到3035，因?yàn)闇囟壬?，相?duì)濕度下降。b.冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程特點(diǎn) ：省去一級(jí)冷卻和分離設(shè)備及空氣再加熱設(shè)備，簡(jiǎn)化了流程，使冷卻水用量也降低了。壓縮空氣從貯罐出來分兩路，一部分進(jìn)冷卻器，經(jīng)分離器分離水、油霧后與另一部分未處理過的

19、高溫壓縮空氣混合，使混合后的空氣溫度為3035，相對(duì)濕度為5060%。 第四節(jié)第四節(jié) 工業(yè)相關(guān)滅菌技術(shù)工業(yè)相關(guān)滅菌技術(shù) 反應(yīng)器的滅菌操作是生化反應(yīng)過程重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。滅菌不徹底會(huì)造成染菌，給生產(chǎn)帶來嚴(yán)重危害，防止雜菌污染是任何發(fā)酵工廠的一項(xiàng)重要工作內(nèi)容。尤其是無菌程度要求高的液體深層發(fā)酵，污染防止工作的重要性更為突出。 所謂“雜菌”， 是指在發(fā)酵培養(yǎng)中侵入了有礙生產(chǎn)的其他微生物。幾乎所有的發(fā)酵工業(yè)，都有可能遭受雜菌的污染。染菌的結(jié)果，輕者影響產(chǎn)量或產(chǎn)品質(zhì)量，重者可能導(dǎo)致倒罐，甚至停產(chǎn)。p發(fā)酵反應(yīng)器的滅菌發(fā)酵反應(yīng)器的滅菌p染菌的防治染菌的防治染菌原因染菌原因百分率，百分率，%外界帶入雜菌（取樣、

20、補(bǔ)料帶入）外界帶入雜菌（取樣、補(bǔ)料帶入）8.20設(shè)備穿孔設(shè)備穿孔7.60空氣系統(tǒng)帶菌空氣系統(tǒng)帶菌26.00停電罐壓跌零停電罐壓跌零1.60接種接種11.00蒸汽壓力不夠或蒸汽量不足蒸汽壓力不夠或蒸汽量不足0.60管理問題管理問題7.09操作違反規(guī)程操作違反規(guī)程1.60種子帶菌種子帶菌0.60原因不明原因不明35.00從染菌的規(guī)模來分析染菌原因從染菌的規(guī)模來分析染菌原因 p大批發(fā)酵罐染菌 ：空氣系統(tǒng)p部分發(fā)酵罐(或罐組)染菌：前期可能是種子帶雜菌，或滅菌不徹底，中后期則可能是中間補(bǔ)料系統(tǒng)或油管路系統(tǒng)發(fā)生問題所造成的p個(gè)別發(fā)酵罐連續(xù)染菌：設(shè)備問題(如閥門的滲漏或罐體腐蝕磨損)，設(shè)備的腐蝕磨損所引起

21、的染菌會(huì)出現(xiàn)每批發(fā)酵的染菌時(shí)間向前推移的現(xiàn)象p個(gè)別發(fā)酵罐偶然染菌：原因比較復(fù)雜，因?yàn)楦鞣N染菌途徑都可能引起。 從染菌的時(shí)間來分析從染菌的時(shí)間來分析p發(fā)酵早期染菌：種子帶菌、培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底、設(shè)備或管道有死角p中、后期染菌：中間補(bǔ)料、設(shè)備滲漏、操作不合理從染菌的類型來分析從染菌的類型來分析p耐熱性芽抱桿菌：死角或滅菌不徹底p球菌、酵母：可能是從蒸汽的冷凝水或空氣中帶來的p淺綠色菌落(革蘭氏陰性桿菌) ：發(fā)酵罐的冷卻管或夾套滲漏p霉菌：滅菌不徹底或無菌操作不嚴(yán)格p種子帶菌的防止 a.種子帶雜菌是發(fā)酵前期染菌的原因之一。在每次接種后應(yīng)留取少量的種子懸浮液進(jìn)行平板、肉湯培養(yǎng)，借以說明是否是種子中帶雜菌。種子培養(yǎng)的設(shè)備和裝置有無菌室、滅菌鍋和搖瓶機(jī)等。b.把無菌