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文檔簡(jiǎn)介
1、細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題及其解決1 .如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基?培養(yǎng)某一類(lèi)型細(xì)胞沒(méi)有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)??傊?,首選MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開(kāi)始。2 .何時(shí)須更換培養(yǎng)基?視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定,或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間,按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。3 .可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基?不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基,若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基,細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng),造成細(xì)胞無(wú)法存活。4可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類(lèi)?不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源,
2、所以血清的種類(lèi)和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清,在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同,血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。5 何謂FBS,FCS,CS,HS?FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思,兩者都是指胎牛血清,F(xiàn)CS乃錯(cuò)誤的使用字眼,請(qǐng)不要再使用。CS(calfserum)則是指小牛血清。HS(horseserum)則是指馬血清。6培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5%或10%CO2?或根本沒(méi)有影響?一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng),而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO
3、2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7g時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10%CO2;當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時(shí),則應(yīng)使用5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞。7 .Hank's平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么?Hank's平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別?HBS和EBS的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles(2.2g/L)中比在Hanks(0.35g/L)中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2中,溶液會(huì)變堿,Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變
4、酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織,需要用Eagles液,。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織,用Hanks液就可以了。8 .細(xì)胞之接種密度為何?依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤(pán)之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)之一重要原因。9 .懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理?一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中,稀釋細(xì)胞濃度即可,若培養(yǎng)液太多時(shí),可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高,直到無(wú)法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶,加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度,重復(fù)前述步驟即可。10 .冷凍管應(yīng)如何解凍?取出冷凍管后,須立即放入37C水槽中快速解凍,輕搖冷凍管
5、使其在1分鐘內(nèi)全部融化,并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿,否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí),必須注意安全,預(yù)防冷凍管之爆裂。11 .細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí),是否應(yīng)馬上去除DMSO?除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO敏感之細(xì)胞外,絕大部分細(xì)胞株(包括懸浮性細(xì)胞),在解凍之后,應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中,待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可,如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問(wèn)題。12 .附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA濃度?應(yīng)如何處理?一般使用之trypsin-EDTA濃度為0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。第一次開(kāi)瓶后應(yīng)
6、立即少量分裝于無(wú)菌試管中,保存于W0°C,避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin之活性降低,并可減少污染之機(jī)會(huì)。13 .欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái),其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速?欲回收動(dòng)物細(xì)胞,其離心速率一般為300xg(約1,000rpm),5-10分鐘,過(guò)高之轉(zhuǎn)速,將造成細(xì)胞死亡。14 .細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何?動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10%DMSO(dimethylsulfoxide)和90-95%原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意:由于DMSO稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能,故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中,必須使用前先行配制完成。15 .DMSO之等級(jí)和無(wú)菌過(guò)濾之
7、方式為何?冷凍保存使用之DMSO等級(jí),必須為T(mén)issueculturegrade之DMSO(如SigmaD2650),其本身即為無(wú)菌狀況,第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中,保存于4,避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物質(zhì),并可減少污染之機(jī)會(huì)。若要過(guò)濾DMSO,則須使用耐DMSO之Nylon材質(zhì)濾膜。16 .冷凍保存細(xì)胞之方法?冷凍保存方法一:冷凍管置于4C3060分鐘(-20C30分鐘*)f-80C1618小時(shí)(或隔夜)液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。冷凍保存方法二:冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3C至60c以下,再放入液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
8、*-20C不可超過(guò)1小時(shí),以防止冰晶過(guò)大,造成細(xì)胞大量死亡,亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80°C冰箱中,惟存活率稍微降低一些。17 .細(xì)胞欲冷凍保存時(shí),細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度?冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106cells/mlvial,融合瘤細(xì)胞則以5x106cells/mlvial為宜。18 .培養(yǎng)基中是否須添加抗生素?除于特殊篩選系統(tǒng)中外,一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。19 .應(yīng)如何避免細(xì)胞污染?細(xì)胞污染的種類(lèi)可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)
9、良好之細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。20 .如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí),應(yīng)如何處理?原則上:直接滅菌后丟棄之。當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí),研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母,把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開(kāi),用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái),檢查HEPA過(guò)濾器。高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性,因而,做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂(lè)菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。1 .在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞,稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。2 .分
10、散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi),把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。除J如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0mg/ml。3 .每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo),如脫落,出現(xiàn)空泡,匯合度下降和變圓。4 .確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度23倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞23代。5 .在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。6 .重復(fù)步驟4。7 .在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)46代,確定污染是否以已被消除。21 .支原體(mycoplasma)污染的細(xì)胞,是否能以肉眼觀察出異狀?不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專(zhuān)家外,大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株,無(wú)法以其外
11、觀分辨之。22 .支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響?支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù),代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前,必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free,實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。23 .偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí),該如何處理?直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細(xì)胞株。24 .CO2培養(yǎng)箱之水盤(pán)如何保持清潔?定期(至少每?jī)芍芤淮危┮詿o(wú)菌蒸儲(chǔ)水或無(wú)菌去離子水更換之。25 .為何培養(yǎng)基保存于4C冰箱中,顏色會(huì)偏暗紅色,且pH值會(huì)越來(lái)越偏堿性?培養(yǎng)基保存于4C冰箱中,培養(yǎng)基內(nèi)之CO2會(huì)逐漸溢出,造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenolred)的顏色也會(huì)隨堿性增加
12、而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果,將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí),可以通入無(wú)菌過(guò)濾之CO2,以調(diào)整pH值。26 .各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish,flask是否均相同?不同廠牌的dish或flask,其所coating的polymer不同,制造程序亦不同,雖對(duì)大部分細(xì)胞沒(méi)有太大之影響,惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish或flask而有顯著之生長(zhǎng)差異。27 .購(gòu)買(mǎi)之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后,為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形?研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少,大都是因?yàn)殡x心過(guò)程操作上的失誤,造成細(xì)胞的物理性損傷,以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心,應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。2
13、8 .購(gòu)買(mǎi)之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因?研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳,常見(jiàn)原因可歸納為:培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過(guò)程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后,加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于S0C太久。30 .L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎?它在溶液中不穩(wěn)定嗎?L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解,但是確切的降解率一直沒(méi)有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成,而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。31 .GlutaMA
14、X-I是什么?培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I?這個(gè)二肽有多穩(wěn)定?GlutaMAX-I二肽是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來(lái)保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎完全降解。32 .什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅?酚紅在培養(yǎng)基中用作PH值的指示劑:中性時(shí)為紅色,酸性時(shí)為黃色,堿性時(shí)為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類(lèi)激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類(lèi)反應(yīng),培養(yǎng)細(xì)胞,尤其是哺乳類(lèi)細(xì)胞時(shí),用不加酚紅的培養(yǎng)基。
15、由于酚紅干擾檢測(cè),一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí),不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。33 .如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞?用無(wú)血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到2002000個(gè)/毫升,在0.1毫升細(xì)胞懸液中加0.1毫升0.4%的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻,數(shù)分鐘后,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞?;罴?xì)胞排斥臺(tái)盼蘭,因而染成藍(lán)色細(xì)胞是死細(xì)胞。34 .培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么?丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源,盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒(méi)有葡萄糖的話,細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。35 .二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么?二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣
16、離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前,用EDTA清洗細(xì)胞,以消除來(lái)自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。36 .室溫下配制的Tris-HCl溶液,在37c使用時(shí)PH值是多少?緩沖液PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mMTris-HC溶液在4C,25C,37c時(shí),不同PH值。50mMTris-HC溶液在4C,25C,37c時(shí),不同PH值4C25°C37°C8.18.57.28.27.67.38.37.77.48.47.87.58.57.97.68.68.07.78.78.17.88.88.27.98.98.38.09.08.48.19.18.58.29.28.68
17、.39.38.78.49.48.88.537 .如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細(xì)胞?能用胰蛋白酶消化嗎?我們推薦使用脫落細(xì)胞的方法,此技術(shù)破壞性最小,生活力最高。通過(guò)使用巴斯德吸液管,讓細(xì)胞上培養(yǎng)基流動(dòng)。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在絕對(duì)必要的情況下,才使用胰酶消化細(xì)胞。38 .胰酶消化一個(gè)T25瓶的sf9細(xì)胞:1 .去除培養(yǎng)基。2 .用2ml1xPBS(足以覆蓋細(xì)胞表面)洗滌細(xì)胞,去除PBS。3 .加入2ml1x胰酶EDTA(恰好覆蓋細(xì)胞表面)。4 .37C孵育5到10分鐘。在儀器下檢測(cè)看到5分鐘后它們正在向上移動(dòng)。5 .向細(xì)胞中加入2ml細(xì)胞培養(yǎng)液,移入錐形管,用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁
18、,移入同一錐形管中。(培養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性。)6 .離心(1100rpm)沉淀細(xì)胞。去除培養(yǎng)基。7 .用新的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。傳代。39.在Sf9,Sf21,和highFive細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí),肝素的使用量是多少?為了防止懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集的形成,使用肝素濃度為10單位/毫升細(xì)胞懸液40 .在重新凍存sf9細(xì)胞前,它可以傳多少代?隨著傳代的次數(shù)的增加,它的感染能力會(huì)降低嗎?通常情況當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)30次傳代后,應(yīng)該返回凍存。無(wú)論什么時(shí)候計(jì)數(shù)時(shí),都應(yīng)該檢查細(xì)胞活力。如果超過(guò)95%的細(xì)胞保持有活力和在大約30小時(shí)左右加倍,細(xì)胞仍然可以使用。如果活力和加倍時(shí)間下降,它們的感染力將不在是有效的。4
19、1 .貯存在冰箱中的瓶口已開(kāi)的培養(yǎng)基,在放置幾天后顏色變紫?這主要是由于在暴露到周?chē)腃O2水平時(shí),碳酸氫納導(dǎo)致了pH值的上升。您可以在使用前松開(kāi)瓶口,在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15分鐘,來(lái)校正溶液的pH值(確定松開(kāi)瓶口以保證氣體交換)。42 .細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍,可否繼續(xù)使用?如果細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍,您應(yīng)該熔化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒(méi)有沉淀產(chǎn)生,培養(yǎng)基可以正常使用,如果出現(xiàn)沉淀,只能丟棄這些培養(yǎng)基。43 .無(wú)血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎?當(dāng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí),降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%o血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。在無(wú)血清培養(yǎng)條件下,抗
20、生素不被滅活,可能對(duì)于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。44 .培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后,可長(zhǎng)期保存嗎?一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí),您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_(kāi)始降解。45 .培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復(fù)凍融嗎?大部分添加物和試劑最多可以凍融3次,如果次數(shù)更多都會(huì)在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,將會(huì)影響它的性能。46 .為什么要在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4C冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?胰蛋白酶在4c就可能開(kāi)始降解,如果在室溫下放置超過(guò)30分鐘,就會(huì)變得不穩(wěn)定。47 .保存血清最好的方法?我們建議血清應(yīng)保存在-5C至-2OCo若存放于4c時(shí),請(qǐng)
21、勿超過(guò)一個(gè)月。若一次無(wú)法用完一瓶,建議無(wú)菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi),再放回冷凍。48 .如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損?將血清從冷凍箱取出后,先置于28c冰箱使之融解,然后在室溫下使之全融。但必須注意的是,融解過(guò)程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。49 .血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn),該如何處理?血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成,而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后,也會(huì)存在于血清中,亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物,并不影響血清本身的質(zhì)量。若欲去除這些絮狀沉淀物,可以將血清分裝至無(wú)菌離心管內(nèi),以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾。最好不使用過(guò)濾的方法去除這些絮狀沉淀物,因?yàn)樗赡軙?huì)阻塞過(guò)濾膜。50 .為什么要熱滅活血清?加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件,刺激平滑肌收縮,細(xì)胞和血小板釋放組胺,激活淋巴細(xì)胞
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