高效液相色譜法(2010)

1、1第十二章第十二章 高效液相色譜法高效液相色譜法 經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入氣相色譜法的理論和實驗技術(shù)，引入氣相色譜法的理論和實驗技術(shù)，高壓輸送流動相，高壓輸送流動相，高效固定相及高靈敏度檢測器，高效固定相及高靈敏度檢測器，現(xiàn)代液相色譜分析方法?，F(xiàn)代液相色譜分析方法。 2 顆粒極細(xì)（一般為顆粒極細(xì)（一般為10 m以下）、規(guī)則均勻的以下）、規(guī)則均勻的固定相，固定相，(鍵合相鍵合相)傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分離傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分離效率高；效率高； 高壓輸液泵輸送流動相，流速快，分析速度快；高壓輸液泵輸送流動相，流速快，分析速度快； 高靈敏度檢測器，靈敏度大大提高。紫外檢測高靈

2、敏度檢測器，靈敏度大大提高。紫外檢測器最小檢測限可達(dá)器最小檢測限可達(dá)10 9g，而熒光檢測器最小檢，而熒光檢測器最小檢測限可達(dá)測限可達(dá)10 12g。 3第第1 1節(jié)節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀4HPLC所用流動相必須預(yù)先脫氣，否則容易在所用流動相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作；還會影響檢系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作；還會影響檢測器的正常響應(yīng)。測器的正常響應(yīng)。 一、輸液系統(tǒng)一、輸液系統(tǒng)（一）溶劑脫氣與過濾（一）溶劑脫氣與過濾 抽真空脫氣抽真空脫氣 超聲波振蕩脫氣超聲波振蕩脫氣 吹氦脫氣吹氦脫氣 溶劑應(yīng)經(jīng)過溶劑應(yīng)經(jīng)過0.45m濾膜過濾，以除去溶劑中的固濾膜過濾，以除去溶劑

3、中的固體雜質(zhì)，防止堵塞色譜柱、管路系統(tǒng)，保護(hù)高壓泵體雜質(zhì)，防止堵塞色譜柱、管路系統(tǒng)，保護(hù)高壓泵 5（二）高壓輸液泵（二）高壓輸液泵對輸液泵的基本要求：對輸液泵的基本要求：流量準(zhǔn)確可調(diào)。流量準(zhǔn)確可調(diào)。流動相的流速在流動相的流速在0.5-2mL/min，流量控制精度通常，流量控制精度通常要求小于要求小于0.5%。 耐高壓。耐高壓。通常要求泵的輸出壓力達(dá)到通常要求泵的輸出壓力達(dá)到30-60MPa的高壓。的高壓。液流穩(wěn)定。液流穩(wěn)定。輸出的液流應(yīng)無脈動輸出的液流應(yīng)無脈動泵的死體積小。泵的死體積小。泵的死體積通常要求小于泵的死體積通常要求小于0.5mL。 密封性能好，耐腐蝕密封性能好，耐腐蝕6輸液泵按輸出

4、液恒定的因素分恒壓泵和恒流泵，恒輸液泵按輸出液恒定的因素分恒壓泵和恒流泵，恒流泵的應(yīng)用更廣泛。流泵的應(yīng)用更廣泛。7（三）梯度洗脫裝置（三）梯度洗脫裝置等度洗脫：等度洗脫：用恒定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫，方法用恒定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫，方法簡便、色譜柱易再生等是其優(yōu)點。簡便、色譜柱易再生等是其優(yōu)點。梯度洗脫：梯度洗脫：在一個分析周期內(nèi)，按一定程序不在一個分析周期內(nèi)，按一定程序不斷改變流動相的配比，逐步提高洗脫強(qiáng)度。梯度洗斷改變流動相的配比，逐步提高洗脫強(qiáng)度。梯度洗脫可以使一個復(fù)雜樣品中性質(zhì)差異較大的組分，都脫可以使一個復(fù)雜樣品中性質(zhì)差異較大的組分，都能在各自適宜的分離條件下分離。能在各自適宜的分離條件下

5、分離。梯度洗脫的特點：梯度洗脫的特點：縮短分析周期；縮短分析周期；提高分提高分離效果；離效果；改善峰形，很少拖尾；改善峰形，很少拖尾；增加檢測靈敏增加檢測靈敏度。度。基線漂移及重復(fù)性不佳基線漂移及重復(fù)性不佳 8等度洗脫與梯度洗脫等度洗脫與梯度洗脫（弱）（弱）（強(qiáng)）（強(qiáng)）AB（弱（弱強(qiáng)）強(qiáng)）9高壓梯度（外梯度）高壓梯度（外梯度）: 利用兩臺高壓輸液泵，將利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱混合后進(jìn)入色譜柱低壓梯度（內(nèi)梯度）低壓梯度（內(nèi)梯度）: 一臺高壓泵一臺高壓泵, 通過比例調(diào)通過比例調(diào)節(jié)閥節(jié)閥,將兩種

6、或多種不同極性的溶劑按一定的比將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。例抽入高壓泵中混合。10二、進(jìn)樣系統(tǒng)二、進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣器要求密封性好，死體積小，重復(fù)性好。進(jìn)樣器要求密封性好，死體積小，重復(fù)性好。 流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，結(jié)構(gòu)如圖所示：的六通閥進(jìn)樣裝置，結(jié)構(gòu)如圖所示：11三、分離系統(tǒng)三、分離系統(tǒng)使用色譜柱注意事項：使用色譜柱注意事項：1 溶劑和樣品應(yīng)過濾，溶劑和樣品應(yīng)過濾， 防止堵塞。防止堵塞。2 加前置柱。加前置柱。3 用完后要清洗用完后要清洗 色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管色譜柱是液相色譜的心臟

7、部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。金屬管用銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。金屬管用得較多。一般色譜柱長得較多。一般色譜柱長530cm，內(nèi)徑為，內(nèi)徑為45mm，12四、檢測系統(tǒng)四、檢測系統(tǒng)要求檢測器靈敏度高、噪聲低、死體積小、線性范圍寬、要求檢測器靈敏度高、噪聲低、死體積小、線性范圍寬、重復(fù)性好、適用范圍廣等。重復(fù)性好、適用范圍廣等。 （一）紫外檢測器（一）紫外檢測器應(yīng)用最廣，對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。應(yīng)用最廣，對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。13紫外檢測器包括固定波長、可變波長和光電二極紫外檢測

8、器包括固定波長、可變波長和光電二極管陣列檢測器管陣列檢測器141024個二極管陣列個二極管陣列10ms完成一次檢測，完成一次檢測，1s采集采集100000個含吸光度、波長、時間的數(shù)據(jù)，得到一個含吸光度、波長、時間的數(shù)據(jù)，得到一張吸光度、波長、保留時間的三維色譜圖。張吸光度、波長、保留時間的三維色譜圖。15 靈敏度高；靈敏度高； 線性范圍寬；線性范圍寬； 流通池可做得很小流通池可做得很小(1mm 10mm ，容積，容積 8L)； 對流動相的流速和溫度變化不敏感；對流動相的流速和溫度變化不敏感； 波長可選，易于操作；波長可選，易于操作； 可用于梯度洗脫?？捎糜谔荻认疵?。 特點：特點：（二）熒光檢測

9、器（二）熒光檢測器 高靈敏度，高選擇性。對多環(huán)芳烴，維生高靈敏度，高選擇性。對多環(huán)芳烴，維生素素B B，黃曲霉素，卟啉類化合物，農(nóng)藥，藥物，黃曲霉素，卟啉類化合物，農(nóng)藥，藥物，氨基酸，甾類化合物等有響應(yīng)。，氨基酸，甾類化合物等有響應(yīng)。1617（三）示差折光檢測器（三）示差折光檢測器 通用型檢測器，通用型檢測器，但靈敏度低，但靈敏度低，對溫度敏感，對溫度敏感，不能用于梯度不能用于梯度洗脫洗脫 可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度成正比。折光指數(shù)差值。差值與濃度成正比。18（四）蒸發(fā)光散射檢測器（四）蒸發(fā)光散射檢測器 這種檢測器可用于

10、揮發(fā)性低于流動相的任何樣這種檢測器可用于揮發(fā)性低于流動相的任何樣品組分的檢測，但對于有紫外吸收的組分的檢測靈品組分的檢測，但對于有紫外吸收的組分的檢測靈敏度較低，主要用于糖類、高分子化合物、高級脂敏度較低，主要用于糖類、高分子化合物、高級脂肪酸及甾體等幾十類化合物。肪酸及甾體等幾十類化合物。 在一定的條件下，光散射強(qiáng)度正比于溶質(zhì)粒子的在一定的條件下，光散射強(qiáng)度正比于溶質(zhì)粒子的大小和數(shù)量。散射光強(qiáng)度與樣品微粒質(zhì)量的關(guān)系為大小和數(shù)量。散射光強(qiáng)度與樣品微粒質(zhì)量的關(guān)系為 I = k mI = k mb b式中，式中，m m為微粒質(zhì)量，為微粒質(zhì)量，k k、b b為實驗條件（如溫度、流為實驗條件（如溫度、

11、流動相性質(zhì)）決定的常數(shù)。因此可根據(jù)散射光強(qiáng)度對動相性質(zhì)）決定的常數(shù)。因此可根據(jù)散射光強(qiáng)度對樣品進(jìn)行定量分析。樣品進(jìn)行定量分析。1920五、數(shù)據(jù)記錄處理和計算機(jī)控制系統(tǒng)五、數(shù)據(jù)記錄處理和計算機(jī)控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)又稱色譜工作站：它可對分析全過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)又稱色譜工作站：它可對分析全過程（分析條件、儀器狀態(tài)、分析狀態(tài)）進(jìn)行在線程（分析條件、儀器狀態(tài)、分析狀態(tài)）進(jìn)行在線顯示，自動采集、處理和儲存分析數(shù)據(jù)。顯示，自動采集、處理和儲存分析數(shù)據(jù)。21第第2 2節(jié)節(jié) 基本理論基本理論高效液相色譜法的塔板理論與氣相色譜法完全相同，高效液相色譜法的塔板理論與氣相色譜法完全相同，速率理論略有差異。速率理論略有差異

12、。 一、柱內(nèi)展寬一、柱內(nèi)展寬uCCCuBAHssmm)(/1.渦流擴(kuò)散項渦流擴(kuò)散項 渦流擴(kuò)散項與氣相色譜法相同，渦流擴(kuò)散項與氣相色譜法相同， A2dp 高效液相色譜多使用高效液相色譜多使用310um球形固定相顆粒球形固定相顆粒 ,以均漿高壓裝填，以均漿高壓裝填，A較小。較小。222.分子擴(kuò)散項分子擴(kuò)散項 uD2uBm3.流動相傳質(zhì)阻力項流動相傳質(zhì)阻力項 流動相傳質(zhì)阻力，實際包括兩方面，一是移流動相傳質(zhì)阻力，實際包括兩方面，一是移動流動相傳質(zhì)阻力動流動相傳質(zhì)阻力Hm，二是滯流（靜態(tài)）流動，二是滯流（靜態(tài)）流動相傳質(zhì)阻力相傳質(zhì)阻力Hsm。 組分在液體中的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一組分在液體中的擴(kuò)散

13、系數(shù)僅為氣體的萬分之一，在高效液相色譜中，在高效液相色譜中,B/u很小，可忽略不計。很小，可忽略不計。2324a.移動流動相傳質(zhì)阻力（移動流動相傳質(zhì)阻力（Cmu） 當(dāng)流動相在色譜柱內(nèi)流動時，離固定相較遠(yuǎn)的組分當(dāng)流動相在色譜柱內(nèi)流動時，離固定相較遠(yuǎn)的組分流動較快，處于固定相顆粒表面的組分流動較慢，流動較快，處于固定相顆粒表面的組分流動較慢，由于這種差別，會使組分的色譜峰擴(kuò)展由于這種差別，會使組分的色譜峰擴(kuò)展. 展寬大小與展寬大小與固定相顆粒直徑平方成正比，與流動相線速度成正固定相顆粒直徑平方成正比，與流動相線速度成正比，與組分在流動相中的擴(kuò)散系數(shù)比，與組分在流動相中的擴(kuò)散系數(shù)Dm成反比：成反比：

14、 uDdCuCm2pmmb.滯流流動相傳質(zhì)阻力（滯流流動相傳質(zhì)阻力（Csmu） 2526 流動相在色譜柱中流動時，有部分流動相進(jìn)入流動相在色譜柱中流動時，有部分流動相進(jìn)入到多孔的固定相深孔中，滯留后難以流動。組分分到多孔的固定相深孔中，滯留后難以流動。組分分子進(jìn)入滯留區(qū)造成色譜峰擴(kuò)展，使柱效降低，子進(jìn)入滯留區(qū)造成色譜峰擴(kuò)展，使柱效降低，uDdCuCm2psmsm4.固定相傳質(zhì)阻力項固定相傳質(zhì)阻力項 （Csu） 組分分子在固定液中傳質(zhì)時，因所受到的阻組分分子在固定液中傳質(zhì)時，因所受到的阻力不同而引起色譜峰擴(kuò)展力不同而引起色譜峰擴(kuò)展uDdCuCS2fSS 在鍵合相色譜法中，在鍵合相色譜法中，d d

15、f f很?。▎畏肿訉樱?，固定很小（單分子層），固定相傳質(zhì)阻力可以忽略。相傳質(zhì)阻力可以忽略。 27在高效液相色譜中，范第姆特方程可寫成：在高效液相色譜中，范第姆特方程可寫成： HA + CuA+Cmu+Csmu 隨著隨著u的增大，的增大，H增增 大，柱效降低，故其最佳流大，柱效降低，故其最佳流速就在速就在u很小的地方。很小的地方。28為了減小柱內(nèi)展寬，提高柱效，可采取以下措施：為了減小柱內(nèi)展寬，提高柱效，可采取以下措施： (1)用小而均勻的球形固定相，填充均勻，以減少用小而均勻的球形固定相，填充均勻，以減少渦流擴(kuò)散。渦流擴(kuò)散。 （2）使用低粘度的小分子溶劑作流動相，減小流）使用低粘度的小分子溶劑

16、作流動相，減小流 動相傳質(zhì)阻力；動相傳質(zhì)阻力；(3)流動相的流速低，一般控制在流動相的流速低，一般控制在1mL/min左右左右二、柱外展寬二、柱外展寬（4）柱溫）柱溫25左右為宜。左右為宜。柱溫太高，雖柱溫太高，雖D Dmm增大，傳質(zhì)阻力減小，但增大，傳質(zhì)阻力減小，但易產(chǎn)易產(chǎn)生氣泡，太低不僅減小生氣泡，太低不僅減小D Dmm，使傳質(zhì)阻力增大，使傳質(zhì)阻力增大，而且流動相的粘度增大，柱阻加大。而且流動相的粘度增大，柱阻加大。 29采用采用 小體積檢測器，小體積檢測器，管道對接宜呈流線形，管道對接宜呈流線形，減少減少柱外死體積，從而減小柱外展寬，提高柱效。柱外死體積，從而減小柱外展寬，提高柱效。30

17、 HPLC 高效液相 LSC 液固LLC液液IEC離子交換SEC空間排阻AC親和色譜IC離子色譜BPC化學(xué)鍵合相NPBPC正相RPBPC反相PIC離子對ISC離子抑制第第3節(jié)節(jié) 各類高效液相色譜法各類高效液相色譜法31一、吸附色譜法一、吸附色譜法 固定相固定相：固體吸附劑為硅膠、氧化鋁等，：固體吸附劑為硅膠、氧化鋁等，較常使用的是較常使用的是510m的硅膠吸附劑的硅膠吸附劑. 有時也用有時也用（吸附（吸附+分配并兼有小孔凝膠分配并兼有小孔凝膠作用）作用） 以固體吸附劑為固定相，基于其對不同組分吸以固體吸附劑為固定相，基于其對不同組分吸附能力的差異進(jìn)行混合物的分離。附能力的差異進(jìn)行混合物的分離。

18、 流動相流動相：常用混合溶劑，主體溶劑為正己烷或常用混合溶劑，主體溶劑為正己烷或環(huán)己烷，以一氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷或環(huán)己烷，以一氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷或丙酮等作為調(diào)節(jié)劑，用于調(diào)整流動相的極性。丙酮等作為調(diào)節(jié)劑，用于調(diào)整流動相的極性。32a.表面多孔型表面多孔型 b.無定形全多孔無定形全多孔 c.球形全多孔球形全多孔 d.堆積全多孔堆積全多孔 應(yīng)用：應(yīng)用：主要用于分離能溶于有機(jī)溶劑的極性與弱主要用于分離能溶于有機(jī)溶劑的極性與弱極性混合物及異構(gòu)體的分離。極性混合物及異構(gòu)體的分離。二、化學(xué)鍵合相色譜法二、化學(xué)鍵合相色譜法以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法稱為化學(xué)鍵合以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法稱為

19、化學(xué)鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜法。相色譜法，簡稱鍵合相色譜法。強(qiáng)極性組分后出峰，弱極性組分先出峰強(qiáng)極性組分后出峰，弱極性組分先出峰 33（一）化學(xué)鍵合固定相（一）化學(xué)鍵合固定相用化學(xué)反應(yīng)的方法將有機(jī)分子鍵合在載體表面上，用化學(xué)反應(yīng)的方法將有機(jī)分子鍵合在載體表面上，所形成的填料稱為化學(xué)鍵合固定相，簡稱鍵合相。所形成的填料稱為化學(xué)鍵合固定相，簡稱鍵合相?；瘜W(xué)鍵合相已廣泛用于正相與反相色譜法、離子對化學(xué)鍵合相已廣泛用于正相與反相色譜法、離子對色譜法等諸多色譜法中。色譜法等諸多色譜法中。1、鍵合反應(yīng)、鍵合反應(yīng)化學(xué)鍵合相的載體是硅膠，表面有化學(xué)鍵合相的載體是硅膠，表面有SiOH，能與能與合適的有機(jī)化合

20、物反應(yīng)，使具有不同極性功能團(tuán)的合適的有機(jī)化合物反應(yīng)，使具有不同極性功能團(tuán)的有機(jī)分子鍵合在表面而獲得不同性能的化學(xué)鍵合相，有機(jī)分子鍵合在表面而獲得不同性能的化學(xué)鍵合相，它的制備方法主要是用有機(jī)氯硅烷與硅醇基發(fā)生反它的制備方法主要是用有機(jī)氯硅烷與硅醇基發(fā)生反應(yīng)（硅烷化應(yīng)（硅烷化 ），生成），生成Si-O-Si-C鍵合相。鍵合相。 34由于空間位阻效應(yīng)，不可能將較大的有機(jī)官能團(tuán)由于空間位阻效應(yīng)，不可能將較大的有機(jī)官能團(tuán)鍵合到全部硅醇基上，使得部分硅醇基未反應(yīng)。鍵合到全部硅醇基上，使得部分硅醇基未反應(yīng)。 殘余的硅醇基對鍵合相的性能有很大影響，殘余的硅醇基對鍵合相的性能有很大影響，它可以減小鍵合相表面的

21、疏水性，對極性溶質(zhì)產(chǎn)它可以減小鍵合相表面的疏水性，對極性溶質(zhì)產(chǎn)生次級化學(xué)吸附，從而使保留機(jī)制復(fù)雜化，降低生次級化學(xué)吸附，從而使保留機(jī)制復(fù)雜化，降低了鍵合相填料的穩(wěn)定性，使組分的峰形拖尾。為了鍵合相填料的穩(wěn)定性，使組分的峰形拖尾。為盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應(yīng)后，要用盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應(yīng)后，要用小分子三甲基氯硅烷等進(jìn)行鈍化處理，稱封尾。小分子三甲基氯硅烷等進(jìn)行鈍化處理，稱封尾。 35362. 鍵合相的分類鍵合相的分類（1）非極性鍵合相）非極性鍵合相這類鍵合相表面基團(tuán)為非極性烴基，如十八烷這類鍵合相表面基團(tuán)為非極性烴基，如十八烷基、辛烷基、甲基與苯基等。十八烷基鍵合相基、辛烷基

22、、甲基與苯基等。十八烷基鍵合相（ODS）是最常用的非極性鍵合相。）是最常用的非極性鍵合相。371-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯固定相：固定相：C1固定相：固定相：C8固定相：固定相：C18非極性鍵合相常用于反相色譜。鍵合烷基的鏈長非極性鍵合相常用于反相色譜。鍵合烷基的鏈長增加，極性降低，載樣量增大、增加，極性降低，載樣量增大、k值增大，值增大，C18分分離效果優(yōu)于離效果優(yōu)于C8 , C138（2）中等極性鍵合相）中等極性鍵合相中等極性鍵合相常見的有醚基鍵合相（如中等極性鍵合相常見的有醚基鍵合相（如YWG-ROR

23、）。這種鍵合相可作正相或反相色譜）。這種鍵合相可作正相或反相色譜的固定相，視流動相的極性而定。的固定相，視流動相的極性而定。（3）極性鍵合相）極性鍵合相常用氨基、氰基鍵合相。分別將氨丙硅烷基常用氨基、氰基鍵合相。分別將氨丙硅烷基Si(CH2 )3 NH2 及氰乙硅烷基及氰乙硅烷基Si(CH2 )2 CN鍵合在硅膠上而制成。它們可用作正相色譜的固定鍵合在硅膠上而制成。它們可用作正相色譜的固定相。相。 （4）離子交換鍵合相）離子交換鍵合相離子交換基團(tuán)如離子交換基團(tuán)如-SO3，-NR3鍵合在擔(dān)體表面。鍵合在擔(dān)體表面。 393. 鍵合相的性質(zhì)鍵合相的性質(zhì) （1 1）穩(wěn)定性）穩(wěn)定性鍵合相在鍵合相在pH2

24、-8.5pH2-8.5范圍內(nèi)穩(wěn)定，太高的范圍內(nèi)穩(wěn)定，太高的pHpH值會值會使硅膠溶解，太低的使硅膠溶解，太低的pHpH值會使鍵合的烷基脫落。值會使鍵合的烷基脫落。 （2）鍵合量）鍵合量鍵合相的鍵合量常用含碳量鍵合相的鍵合量常用含碳量(C%)來表示，按來表示，按含碳量的不同，可分為高碳、中碳及低碳型鍵合含碳量的不同，可分為高碳、中碳及低碳型鍵合相。相。40高碳高碳ODSODS鍵合相鍵合相：若：若R R1 1、R R2 2是二個甲基，構(gòu)成高碳是二個甲基，構(gòu)成高碳ODSODS鍵合相鍵合相 Si-O-Si(CHSi-O-Si(CH3 3) )2 2-C-C1818H H3737。 中碳中碳ODSODS

25、鍵合相鍵合相：若：若R R1 1是氫，是氫，R R2 2是氯，氯與硅膠的另是氯，氯與硅膠的另一個硅醇基脫一個硅醇基脫HClHCl，則生成中碳，則生成中碳ODSODS鍵合相鍵合相 （Si-O-)Si-O-)2 2Si(H)-CSi(H)-C1818H H3737；低碳低碳ODSODS鍵合相鍵合相：若：若R R1 1、R R2 2都是氯，與硅膠的另二個都是氯，與硅膠的另二個硅醇基再脫二分子硅醇基再脫二分子HClHCl，生成低碳，生成低碳ODSODS鍵合相鍵合相 (Si-O-)(Si-O-)3 3Si-CSi-C1818H H3737。 41（3）表面覆蓋度）表面覆蓋度載體單位表面鍵合有機(jī)分子微摩爾

26、數(shù)表面覆蓋度載體單位表面含有可反應(yīng)的硅羥基微摩爾數(shù)覆蓋度的大小決定鍵合相是分配還是吸附占主導(dǎo)。覆蓋度的大小決定鍵合相是分配還是吸附占主導(dǎo)。 PartisilPartisil 5-ODS 5-ODS的表面覆蓋度為的表面覆蓋度為9898，即殘，即殘存存2 2的硅醇基，分配占主導(dǎo)。的硅醇基，分配占主導(dǎo)。 PartisilPartisil 10-ODS 10-ODS的表面覆蓋度為的表面覆蓋度為5050，既，既有分配又有殘余硅醇基的吸附作用有分配又有殘余硅醇基的吸附作用。含碳量大，則載樣量大，保留能力強(qiáng)含碳量大，則載樣量大，保留能力強(qiáng)42（二）正相鍵合相色譜法（二）正相鍵合相色譜法 最常用的有氰基（最常

27、用的有氰基（-C N-C N）氨基（）氨基（-NH2-NH2）、二）、二醇基（醇基（DIOLDIOL）極性鍵合相。流動相一般用非極性）極性鍵合相。流動相一般用非極性或弱極性有機(jī)溶劑，如正己烷溶劑，或其中加入或弱極性有機(jī)溶劑，如正己烷溶劑，或其中加入一定量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等），以一定量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等），以調(diào)節(jié)流動相的洗脫強(qiáng)度。通常用于分離能溶于有調(diào)節(jié)流動相的洗脫強(qiáng)度。通常用于分離能溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性的分子型化合物。機(jī)溶劑的極性至中等極性的分子型化合物。4. 鍵合相的特點鍵合相的特點 固定相不易流失，壽命長固定相不易流失，壽命長 選擇性好選擇性好 穩(wěn)定性好穩(wěn)定

28、性好 傳質(zhì)快，柱效高傳質(zhì)快，柱效高 適于作梯度洗脫。適于作梯度洗脫。43分離選擇性：分離選擇性： 極性強(qiáng)的組分極性強(qiáng)的組分k k大，后洗脫出柱。大，后洗脫出柱。 流動相的極性增強(qiáng)，洗脫能力增加，使組流動相的極性增強(qiáng)，洗脫能力增加，使組分分k k減小，減小，t tR R 減小。減小。分離機(jī)制分離機(jī)制分配：把有機(jī)鍵合層作為一個液膜看待，溶質(zhì)分配：把有機(jī)鍵合層作為一個液膜看待，溶質(zhì)在兩相的溶解在兩相的溶解吸附：溶質(zhì)與鍵合極性基團(tuán)間的誘導(dǎo)、氫鍵和吸附：溶質(zhì)與鍵合極性基團(tuán)間的誘導(dǎo)、氫鍵和定向作用定向作用44（二）反相鍵合相色譜法（二）反相鍵合相色譜法 典型的反相鍵合色譜法是用非極性固定相和極典型的反相鍵

29、合色譜法是用非極性固定相和極性流動相組成的色譜體系。固定相，常用十八烷性流動相組成的色譜體系。固定相，常用十八烷基（基（ODS或或C18）鍵合相；流動相常用甲醇）鍵合相；流動相常用甲醇-水或水或乙腈乙腈-水。水。 反相色譜的保留機(jī)制還沒有一致的看法，有反相色譜的保留機(jī)制還沒有一致的看法，有分配與吸附之爭，還有疏溶劑理論等。分配與吸附之爭，還有疏溶劑理論等。鍵合基團(tuán)的覆蓋率高，分配為主；覆蓋率鍵合基團(tuán)的覆蓋率高，分配為主；覆蓋率低，吸附為主。如果覆蓋率高，對殘余硅低，吸附為主。如果覆蓋率高，對殘余硅醇基封尾，則吸附作用大為降低。醇基封尾，則吸附作用大為降低。45 疏溶劑理論把非極性的烷疏溶劑理論

30、把非極性的烷基鍵合相，看作是在硅膠表面基鍵合相，看作是在硅膠表面上覆蓋了一層鍵合的烷基的上覆蓋了一層鍵合的烷基的“分子毛分子毛”，這種，這種“分子毛分子毛”有強(qiáng)的疏水特性。有強(qiáng)的疏水特性。一方面，非極性組分分子或組分分子的非極性部一方面，非極性組分分子或組分分子的非極性部分，由于疏溶劑的作用，將會從極性流動相中被分，由于疏溶劑的作用，將會從極性流動相中被“擠擠”出來，與固定相上的疏水烷基之間產(chǎn)生締出來，與固定相上的疏水烷基之間產(chǎn)生締合作用。另一方面，被分離物的極性部分受到極合作用。另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動的親合作用，使它離開固定相，減少保留性流動的親合作用，使它離開固定相，減少

31、保留值，此即解締過程。顯然，這兩種作用力之差，值，此即解締過程。顯然，這兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。決定了分子在色譜中的保留行為。46保留行為的主要影響因素保留行為的主要影響因素1、溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（極性）、溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（極性） 極性越弱，疏水性越強(qiáng)，極性越弱，疏水性越強(qiáng)，k越大，越大，tR也越大。也越大。同系物碳數(shù)越多，極性越弱，同系物碳數(shù)越多，極性越弱，k越大；越大；2、固定相、固定相硅膠表面鍵合烷基越大，覆蓋度越大，則溶硅膠表面鍵合烷基越大，覆蓋度越大，則溶質(zhì)的質(zhì)的k越大。越大。 3、流動相、流動相極性越強(qiáng)，洗脫能力越弱，使溶質(zhì)的極性越強(qiáng)，洗脫能力越弱，使溶質(zhì)的k越大越

32、大溶劑種類：水為弱溶劑，醇、已腈為強(qiáng)溶劑溶劑種類：水為弱溶劑，醇、已腈為強(qiáng)溶劑溶劑比例：水的比例增加，使溶劑比例：水的比例增加，使k增大增大47稠環(huán)芳烴的分析稠環(huán)芳烴的分析 固定相：十八烷基硅烷化鍵合相固定相：十八烷基硅烷化鍵合相 流動相：流動相：20%甲醇甲醇-水水 100%甲醇甲醇 線性梯度淋洗，線性梯度淋洗，2%/min 流流 速：速：1mL/min 柱柱 溫：溫：30 C 柱柱 壓：壓：70 104 Pa 檢測器：紫外檢測器檢測器：紫外檢測器48反相鍵合相色譜法是應(yīng)用最廣的色譜法，主要反相鍵合相色譜法是應(yīng)用最廣的色譜法，主要用于分離非極性至中等極性的各類分子型化合用于分離非極性至中等極

33、性的各類分子型化合物物. 派生的離子抑制法、離子對法還可用于酸、派生的離子抑制法、離子對法還可用于酸、堿、鹽的分析。堿、鹽的分析。 在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，極在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。性小的組分后流出。（三）反相離子對色譜法（三）反相離子對色譜法 把離子對試劑加入到含水流動相中，組分離子把離子對試劑加入到含水流動相中，組分離子在流動相中與離子對試劑的反離子（在流動相中與離子對試劑的反離子（counter counter ionion）生成中性離子對，增加溶質(zhì)與非極性固）生成中性離子對，增加溶質(zhì)與非極性固定相的作用，使定相的作用，使k k增加，改

34、善分離效果。增加，改善分離效果。 49原理原理 OWW)B(ABA樣品離子樣品離子反離子反離子 中性締合物中性締合物（只溶于有機(jī)相）只溶于有機(jī)相） WWOABBABAEWABWOBABAECCKmsAHHA有機(jī)堿有機(jī)堿 A固定相固定相 + NaRSONaRSO33 s33)RSO(AH)RSO(AH 離子對試劑離子對試劑水相水相50影響容量因子的因素影響容量因子的因素離子對試劑的種類和濃度：離子對試劑的種類和濃度：碳鏈長度增加，碳鏈長度增加，溶質(zhì)的溶質(zhì)的k增大；在一定范圍內(nèi)試劑的濃度升增大；在一定范圍內(nèi)試劑的濃度升高，溶質(zhì)的高，溶質(zhì)的k增大增大 流動相的流動相的pH：有利于組分和離子對試劑離子

35、有利于組分和離子對試劑離子化時（離子對的形成），組分的化時（離子對的形成），組分的k值最大值最大固定相固定相 、流動相性質(zhì)、流動相性質(zhì)（同一般（同一般RP-HPLC）。）。 離子對試劑的選擇離子對試劑的選擇分析酸類或帶負(fù)電荷物質(zhì)：用季銨鹽，如分析酸類或帶負(fù)電荷物質(zhì)：用季銨鹽，如四丁基銨磷酸鹽（四丁基銨磷酸鹽（TBA）和溴化十六烷基三）和溴化十六烷基三甲基銨（甲基銨（CTAB）等）等51分析堿類或帶正電荷的物質(zhì)：用烷基磺酸分析堿類或帶正電荷的物質(zhì)：用烷基磺酸鹽或硫酸鹽，如正戊烷基磺酸鈉鹽或硫酸鹽，如正戊烷基磺酸鈉（PICB5）、正己烷基磺酸鈉（）、正己烷基磺酸鈉（PICB6）、）、 適用范圍：有

36、機(jī)酸、堿、鹽等離子型和非離子適用范圍：有機(jī)酸、堿、鹽等離子型和非離子型化合物的混合物。型化合物的混合物。反相離子對色譜很易實現(xiàn)，用反相離子對色譜很易實現(xiàn)，用ODS柱，在流動相柱，在流動相甲醇甲醇-水或乙腈水或乙腈-水中加入水中加入0.030.01mol/L的的離子對試劑即可。離子對試劑即可。反相離子對色譜法分析奶粉中三聚氰胺反相離子對色譜法分析奶粉中三聚氰胺流動相：含流動相：含10mM檸檬酸檸檬酸和和10mM辛烷磺酸鈉辛烷磺酸鈉的緩的緩沖液沖液(pH3.0):甲醇甲醇=7:3 52（四）離子抑制色譜法（四）離子抑制色譜法 用反相色譜法，通過調(diào)節(jié)流動相的用反相色譜法，通過調(diào)節(jié)流動相的pH值，值，

37、抑制組分的解離，增加它在固定相中的溶解抑制組分的解離，增加它在固定相中的溶解度，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸、弱堿的目的，這度，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸、弱堿的目的，這種技術(shù)稱為離子抑制色譜法。種技術(shù)稱為離子抑制色譜法。 1抑制劑抑制劑 通過向流動相中加入少量弱酸（常用醋酸）、通過向流動相中加入少量弱酸（常用醋酸）、弱堿（常用氨水）或緩沖鹽（常用磷酸鹽及弱堿（常用氨水）或緩沖鹽（常用磷酸鹽及醋酸鹽）為抑制劑，調(diào)節(jié)醋酸鹽）為抑制劑，調(diào)節(jié)pH值，抑制組分值，抑制組分的解離，增加中性分子存在的幾率。的解離，增加中性分子存在的幾率。如分離十二烷酸時，可在流動相乙腈如分離十二烷酸時，可在流動相乙腈/水中水中加入少量乙酸

38、，以抑制十二烷酸的離解加入少量乙酸，以抑制十二烷酸的離解 532容量因子及其影響因素容量因子及其影響因素 除與反相色譜法有相同的影響因素外，除與反相色譜法有相同的影響因素外，主要受流動相的主要受流動相的pH值的影響。對于弱酸，值的影響。對于弱酸，即流動相的即流動相的pH值小于它的值小于它的pka值時，主要以值時，主要以分子形式分子形式HB存在，存在，k值增大，值增大，tR增大；反之，增大；反之，pHpka ，組分以離子形式，組分以離子形式B為主，為主，k值變值變小，小，tR減小，對于弱堿，情況相反。減小，對于弱堿，情況相反。 HBBHKBHHBa 時時當(dāng)當(dāng)1 aKHBHB543適用范圍適用范圍

39、 適用于適用于3.0pKa7.0的弱酸；的弱酸；6.0pKb7.0的弱堿。對于的弱堿。對于pKa3.0的的酸及酸及pKb6.0的堿，應(yīng)采用離子對色譜法或的堿，應(yīng)采用離子對色譜法或離子交換色譜法。離子交換色譜法。 在進(jìn)行離子抑制色譜法時，流動相的在進(jìn)行離子抑制色譜法時，流動相的pH需在需在28之間之間 流動相的流動相的pH值應(yīng)調(diào)節(jié)至比組分的值應(yīng)調(diào)節(jié)至比組分的pK值大值大（對堿）或?。▽λ幔▽A）或小（對酸）12個單位以上，使分個單位以上，使分子形式的的分布系數(shù)較大，有較大的子形式的的分布系數(shù)較大，有較大的k值。值。 55（四）分離類型的選擇（四）分離類型的選擇56第第4 4節(jié)節(jié) 改善分離度的方

40、法改善分離度的方法在高效液相色譜分析中，實際上固定相種類的選在高效液相色譜分析中，實際上固定相種類的選擇十分有限，當(dāng)色譜柱選定后，主要通過調(diào)節(jié)流擇十分有限，當(dāng)色譜柱選定后，主要通過調(diào)節(jié)流動相的組成改善分離動相的組成改善分離. kknR114雖然雖然n也受流動相的影響，但主要由色譜柱的性也受流動相的影響，但主要由色譜柱的性能所決定，溶劑系統(tǒng)主要影響容量因子能所決定，溶劑系統(tǒng)主要影響容量因子k和分配和分配系數(shù)比系數(shù)比。選擇不同種類的溶劑或改變多元溶劑。選擇不同種類的溶劑或改變多元溶劑系統(tǒng)的配比，都會改變系統(tǒng)的配比，都會改變k和和值，影響分離度。值，影響分離度。57一、對流動相的要求一、對流動相的要

41、求與固定相不互溶與固定相不互溶 純度高純度高 不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”粘度低粘度低 若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有水、丙酮、甲醇、乙晴等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離. 58與檢測器匹配與檢測器匹配 對樣品有適宜的溶解度對樣品有適宜的溶解度 毒性小毒性小1.加入調(diào)節(jié)劑加入調(diào)節(jié)劑 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)k 二、改善分離度的方法二、改善分離度的方法使用使用UV檢測器時，溶劑截止波長要小于測量檢測器時，溶劑截止波長要小于測量波長波長 ；使用折光率檢測器，溶劑的折光率要；使用折光率檢測器，溶劑的折光率要與待測

42、物有較大差異。與待測物有較大差異。59 通常希望組分的容量因子通常希望組分的容量因子k保持在保持在210范圍內(nèi)，若組分的范圍內(nèi)，若組分的k值大于值大于10或小于或小于2時，可時，可通過調(diào)節(jié)流動相的極性，來獲取適用的通過調(diào)節(jié)流動相的極性，來獲取適用的k值。值。 在在正相色譜正相色譜中常采用飽和烷烴如正己烷中常采用飽和烷烴如正己烷作主體溶劑，加入具有不同選擇性的溶劑如乙作主體溶劑，加入具有不同選擇性的溶劑如乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷等，來調(diào)節(jié)溶劑的洗醚、二氯甲烷、三氯甲烷等，來調(diào)節(jié)溶劑的洗脫強(qiáng)度。脫強(qiáng)度。極性增加，溶劑的洗脫能力增強(qiáng)，保極性增加，溶劑的洗脫能力增強(qiáng)，保留時間縮短。留時間縮短。若組分的

43、保留時間短，表明溶劑若組分的保留時間短，表明溶劑的極性太大的極性太大,改用極性小的溶劑。若組分的保改用極性小的溶劑。若組分的保留時間太長，可改用極性較大的溶劑。留時間太長，可改用極性較大的溶劑。 60在反相色譜中則常采用水為主體溶劑，加入甲醇、在反相色譜中則常采用水為主體溶劑，加入甲醇、乙腈、四氫呋喃等來調(diào)節(jié)溶劑的洗脫強(qiáng)度，乙腈、四氫呋喃等來調(diào)節(jié)溶劑的洗脫強(qiáng)度， 溶溶 劑劑溶劑極性參數(shù)溶劑極性參數(shù)Pk減少倍數(shù)減少倍數(shù) * 水水 二甲亞砜二甲亞砜 乙乙 二二 醇醇 乙乙 腈腈 甲甲 醇醇 二氧雜環(huán)己烷二氧雜環(huán)己烷 四氫呋喃四氫呋喃 異異 丙丙 醇醇10.27.26.95.85.14.84.03.

44、91.51.52.02.02.22.83.0* 以加以加10%溶劑到水中，溶劑到水中，k減少的倍數(shù)。減少的倍數(shù)。 61表中溶劑極性參數(shù)表中溶劑極性參數(shù)P越大，溶劑的極性越強(qiáng)，在越大，溶劑的極性越強(qiáng)，在反相色譜中的洗脫能力越弱，保留時間延長。反相色譜中的洗脫能力越弱，保留時間延長。 當(dāng)當(dāng)k值值10時，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的比例。時，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的比例。 由于反相離子對色譜法的固定相就是普通反由于反相離子對色譜法的固定相就是普通反相鍵合相色譜的固定相，所以只要改變流動相的相鍵合相色譜的固定相，所以只要改變流動相的成分就可轉(zhuǎn)變?yōu)榉聪嚯x子對色譜法。常用的流動成分就可轉(zhuǎn)變?yōu)榉聪嚯x子對色譜法。常用的流動相是加有離子對試劑和某些改性劑的水相是加有離子對試劑和某些改性劑的水/甲醇或甲醇或水水/乙腈緩沖溶液。流動相中的有機(jī)溶劑增加，乙腈緩沖溶液。流動相中的有機(jī)溶劑增加，溶劑強(qiáng)度也增加，溶劑強(qiáng)度也增加，k值減小。值減小。通過調(diào)節(jié)離子對試通過調(diào)節(jié)離子對試劑的濃度，可改變被分離樣品離子的劑的濃度，可改變被分離樣品離子的k值值。 622.加入改性劑加入改性劑 改善選擇性和峰形改善選擇性和峰形抑制組分分子離解抑制組分分子離解 反相鍵合相色譜分離弱酸或弱堿樣品時會發(fā)生拖反相鍵合