第6章 膜親和過濾

1、6 膜親和過濾法膜親和過濾法親和膜分離技術(shù)親和膜分離技術(shù)親和膜過濾親和膜過濾1.1親和作用的本質(zhì)親和作用的本質(zhì)具有親和作用的分子對具有“鑰匙”和“鎖孔”的關(guān)系，在結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的部位通過靜電作用、氫鍵、疏水相互作用、配位鍵、弱共價鍵相互結(jié)合。1.生物親和作用生物親和作用1.2親和分離技術(shù)被認(rèn)為是解決生物工程下游產(chǎn)品回收和純化的高效方法。主要有親和分配、親和沉淀、親和色譜等技術(shù)正在迅速發(fā)展，其中親和色譜已成為色譜領(lǐng)域中的一個重要分支，它的選擇性和特異性極強(qiáng)，是其他技術(shù)無法比擬的。親和色譜的不足：流速低、擴(kuò)散傳遞慢，不易大規(guī)模應(yīng)用。1.3 膜分離技術(shù)具有高效快捷、操作方便、易于自動化等特點(diǎn)，適合工業(yè)大規(guī)

2、模生產(chǎn)，但單獨(dú)使用膜分離，難以達(dá)到較好的分離效果。1.4 膜親和過濾技術(shù) 就是將膜分離技術(shù)與親和分離有機(jī)結(jié)合，發(fā)揮各自長處的重要分離手段，它包括兩項(xiàng)技術(shù)：親和膜分離技術(shù)，制備帶有親和膜分離技術(shù)，制備帶有親和配基的分離膜親和配基的分離膜，直，直接進(jìn)行產(chǎn)物分離接進(jìn)行產(chǎn)物分離;親和錯流膜過濾，將水溶性或非水溶性高分子親和錯流膜過濾，將水溶性或非水溶性高分子親親和載體與產(chǎn)物進(jìn)行特異反應(yīng)和載體與產(chǎn)物進(jìn)行特異反應(yīng)，然后用膜進(jìn)行錯流過濾。，然后用膜進(jìn)行錯流過濾。2 2 親和膜分離技術(shù)親和膜分離技術(shù)親和膜分離原理親和膜分離原理2.1 原理原理親和膜分離是利用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質(zhì)親和純化目標(biāo)蛋白質(zhì)

3、，是親和層析的變型，又叫膜親和層析。2.2 特點(diǎn)特點(diǎn)傳質(zhì)阻力小、壓力小、配基利用率高、流速快2.3 2.3 親和膜分離親和膜分離過程過程（1） 分離膜的改性一個間隔臂(Spacer), 3C（2 ）親和膜制備一個適合的親和配基(Ligand)（3 ）親和絡(luò)合 配基和配位物(Ligate)為一體的復(fù)合物(Complex) （4 ）洗脫改變條件，如洗脫液的組成、pH值、離子強(qiáng)度、溫度等，使復(fù)合物產(chǎn)生解離,并將解離物收集起來，進(jìn)一步處理。（5 ）親和膜再生將解離后的親和膜進(jìn)行洗滌、再生、平衡，以備下次分離操作時再用。12345（1 ）膜表面要有足夠多并可利用的化學(xué)基團(tuán)(一般為-OH，-NH2，SH或

4、COOH基)，使其能進(jìn)行活化，接上合適的間隔臂和配基。（2 ）要有足夠數(shù)量可利用的化學(xué)基團(tuán)則必需有足夠高的表面積，要便于讓生物大分子自由地出入膜，必需有足夠大的孔徑。（3 ）孔分布應(yīng)窄而均勻，以獲得高的通透量和分離效能。（4） 為了實(shí)現(xiàn)快速分離，常要為了實(shí)現(xiàn)快速分離，常要加壓加壓操作，因此要求膜有一定操作，因此要求膜有一定的機(jī)械強(qiáng)度，能承受一定的壓力，長期使用不變形。的機(jī)械強(qiáng)度，能承受一定的壓力，長期使用不變形。（5 ）親和膜要耐酸、耐堿、耐高濃度的緩沖液和有機(jī)溶劑。親和膜要耐酸、耐堿、耐高濃度的緩沖液和有機(jī)溶劑。 常見的有：葡聚糖、瓊脂糖、纖維素、聚丙烯酰胺、聚羥乙基常見的有：葡聚糖、瓊脂糖

5、、纖維素、聚丙烯酰胺、聚羥乙基甲基丙烯酸酯、多孔玻璃和硅膠等甲基丙烯酸酯、多孔玻璃和硅膠等2.4 2.4 親和膜對膜材料的要求親和膜對膜材料的要求2.5 2.5 親和膜分離技術(shù)的應(yīng)用親和膜分離技術(shù)的應(yīng)用一些親和膜的特征和應(yīng)用一些親和膜的特征和應(yīng)用舉例：舉例：IgGIgG的親和膜分離的親和膜分離1.1.起始膜材料的選擇起始膜材料的選擇：細(xì)胞的尺寸大于：細(xì)胞的尺寸大于10m10m，蛋白質(zhì)小于，蛋白質(zhì)小于0.01m0.01m選擇中空纖維微濾膜選擇中空纖維微濾膜2.2.膜表面的預(yù)處理膜表面的預(yù)處理：聚砜類微孔膜表面改性親水化（：聚砜類微孔膜表面改性親水化（OHOH）3.3.接配基反應(yīng)接配基反應(yīng)表氯醇法

6、活化羥基，將配基表氯醇法活化羥基，將配基L LNHNH2 2偶聯(lián)在膜上偶聯(lián)在膜上4.4.膜分離膜分離a.a.細(xì)胞培養(yǎng)液細(xì)胞培養(yǎng)液IgGIgG單抗液（單抗液（pH8.0pH8.0）引入膜中錯流過濾）引入膜中錯流過濾b. PBS b. PBS 淋洗雜質(zhì)淋洗雜質(zhì)c.c.洗脫洗脫pH3.5 PBSpH3.5 PBSd.d.膜再生膜再生pH8.0 PBSpH8.0 PBS3 親和膜過濾親和膜過濾3.1 原理 親和-膜過濾又稱親和過濾或親和錯流過濾 (Affinity Cross-Flow Filtration),是一種新型大規(guī)模分離純化技術(shù)。這一技術(shù)是生物化學(xué)、化學(xué)工程和生物工程等多門學(xué)科的前沿交叉點(diǎn)，

7、它將親和層析和膜過濾特別是超濾技術(shù)有機(jī)地結(jié)合起來，兼有親和層析和膜過濾的優(yōu)點(diǎn)，從而成為目前研究的熱點(diǎn)。3.2 親和載體親和載體3.2.1親和親和載體結(jié)構(gòu)載體結(jié)構(gòu)內(nèi)核內(nèi)核特定基團(tuán)特定基團(tuán)生物分子無特異吸附性生物分子無特異吸附性對所提取的蛋白質(zhì)有對所提取的蛋白質(zhì)有一定的特異吸附性一定的特異吸附性載體的內(nèi)核的類型載體的內(nèi)核的類型1.水溶性水溶性的大相對分子質(zhì)量聚合物：載體與分離的大相對分子質(zhì)量聚合物：載體與分離對象的結(jié)合更為有效并更為迅速，表面基團(tuán)在與對象的結(jié)合更為有效并更為迅速，表面基團(tuán)在與蛋白結(jié)合時，消除了空間障礙，大大提高了過程蛋白結(jié)合時，消除了空間障礙，大大提高了過程速率。速率。2.非水溶性

8、非水溶性的粒子：粒子具有盡量大的表面積，的粒子：粒子具有盡量大的表面積，也就是說要求粒子的直徑盡可能小。也就是說要求粒子的直徑盡可能小。3.2.2親和載體的制備親和載體的制備1.先于載體粒子上嫁接間隔臂后，先于載體粒子上嫁接間隔臂后，再共價結(jié)合親和配基；再共價結(jié)合親和配基；2.間隔臂與親和配基共價結(jié)合后，間隔臂與親和配基共價結(jié)合后，與載體粒子相連。與載體粒子相連。3.33.3分離過程分離過程（1 1）親和載體與蛋白質(zhì)）親和載體與蛋白質(zhì)復(fù)合體復(fù)合體（2 2）膜分離蛋白質(zhì)復(fù)合體被截留，雜蛋白隨液）膜分離蛋白質(zhì)復(fù)合體被截留，雜蛋白隨液體透過膜體透過膜（3 3）復(fù)合體中蛋白質(zhì)釋放改變緩沖溶液）復(fù)合體中蛋白質(zhì)釋放改變緩沖溶液（4 4）膜分離親和載體被截留，目標(biāo)蛋白透過膜）膜分離親和載體被截留，目標(biāo)蛋白透過膜（5 5）親和載體的再生）親和載體的再生親和錯流過濾流程總圖親和錯流過濾流程總圖分子量102k,截斷1000k3.3 親和親和-膜過濾的應(yīng)用膜過濾的應(yīng)用4-6章復(fù)習(xí)題 1.簡述各種膜分離方法的