同源重組的應(yīng)用專題講義

1、同源重組的應(yīng)用09生工夏章傳同源重組概述同源重組（homologous recombination）即一般重組，是染色體之間進行遺傳信息的方式之一，幾乎所有生物都發(fā)生同源重組。如真核生物減數(shù)分裂中染色體的交換，細菌結(jié)合、轉(zhuǎn)化、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的遺傳重組都屬于同源重組。同源重組要求兩個DNA分子的序列同源，同源區(qū)越長越有利于重組；同源區(qū)太短，則難于發(fā)生重組。因為它依賴于大范圍DNA同源順序的聯(lián)會，負責DNA配對和重組的蛋白質(zhì)因子無堿基序列特異性，只要兩條DNA序列相同或相近，重組便可以在聯(lián)會部分的任何位置發(fā)生。當然，也存在重組熱點，即某些序列發(fā)生重組的概率高于其它序列。同源重組也是對損傷DNA修復(fù)的一

2、種重要途徑，即重組修復(fù)。同源重組的應(yīng)用同源重組的應(yīng)用價值 主要是用于基因敲除（knock-out）和基因敲進(knock-in) 研究基因功能 轉(zhuǎn)基因動物的制備 用于藥物篩選的動物模型 轉(zhuǎn)基因動物可作為“生物反應(yīng)器”生產(chǎn)藥物基因敲進和敲進基因敲除（knock out of gene）:是基因打靶技術(shù)的一種，指外源DNA與受體細胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，從而代替受體細胞基因組中的相同或相似的基因序列，整合入受體細胞的基因組中?；蚯眠M（knock in of gene）：利用基因同源重組，將外源有功能的基因轉(zhuǎn)入基因組中不存在或已失活的細胞中與其基因組中同源序列進行同源重組，在細

3、胞內(nèi)獲得表達，這一技術(shù)稱為基因敲進?；蚯贸颓眠M的原理都是同源重組，即同源雙交換，用克隆的外源基因取代基因組中野生型等位基因。兩者不同點在于，基因敲除導(dǎo)入的外源基因是失活的、無功能的基因，基因敲進導(dǎo)入的是有活性和功能的基因。因而兩者的具體用途有所不同。基因敲除和敲進都可用于基因功能的研究，基因敲進則也可用于突變基因的修復(fù)。 基因敲除是自80年代末以來發(fā)展起來的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)，是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計的同源片段替代靶基因片段，從而達到基因敲除的目的。隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，除了同源重組外，新的原理和技術(shù)也

4、逐漸被應(yīng)用，比較成功的有基因的插入突變和iRNA，它們同樣可以達到基因敲除的目的。小鼠基因敲除實驗基因敲出實際操作簡要步驟：1、克隆目的基因及其兩側(cè)的DNA序列。2、通過插入抗性基因或者DNA缺失，對克隆的目的基因進行體外遺傳改造，使克隆的目的基因失活。3、將經(jīng)體外改造失活的目的基因引入受體細胞，使之與野生型基因進行同源重組。這兩種基因取代，都是是利用內(nèi)源基因序列兩側(cè)或外面的斷裂點，用同源序列的目的基因整個置換內(nèi)源基因。目前用于基因敲除的技術(shù)有Cre/Lox P系統(tǒng)、FLPI系統(tǒng)等。此法可產(chǎn)生精確的基因突變，也可正確糾正機體的基因突變。 研究基因功能細菌和一些低等真核生物在進行基因取代時，克隆

5、的基因能精確地插入到染色體的同源部位，所以他們是研究基因取代的理想材料?；蛉〈ǔ晒τ糜诩毦徒湍妇幕蚍治鐾猓€成功地應(yīng)用到老鼠和雞的基因功能分析中。 轉(zhuǎn)基因動物的制備轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用領(lǐng)域1、生物反應(yīng)器：藥用或食品蛋白的大量生產(chǎn)，即轉(zhuǎn)基因動物制藥；2、疾病的動物模型：用于研究、藥物篩選、藥物治療、毒物測試；3、通過增加或刪除基因來研究基因的功能、調(diào)控和發(fā)育，如癌基因、免疫系統(tǒng)等；4、異種器官的移植；5、家畜品種的改良。轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用領(lǐng)域 用于藥物篩選的動物模型誘發(fā)性或?qū)嶒炐詣游锬Ｐ停‥xperimentalAnimalModels） 用同源重組的方法，將致病因素作用于動物，造成動物組

6、織、器官或全身一定的損害，出現(xiàn)某些類似人類疾病時的功能、代謝或毒使動物患相應(yīng)的傳染病，又如用化學(xué)致癌劑、放射線、致癌病毒誘發(fā)動物的腫瘤等。誘發(fā)性疾病動物模型具有能在短時間內(nèi)復(fù)制出大量疾病模型，并能嚴格控制各種條件使復(fù)制出的疾病模型適合研究目的需要等特點，因而為近代醫(yī)學(xué)研究所常用，特別是藥物篩選研究工作所首選。但誘發(fā)模型和自然產(chǎn)生的疾病模型在某些方面畢竟存在一定差異。因此在設(shè)計誘發(fā)性動物模型要盡量克服其不足，發(fā)揮其特點。 用于藥物篩選的動物模型用于藥物篩選的動物模型例如：帕金森病動物模型，用于藥物篩選。建立抗丙型肝炎病毒藥物篩選的動物模型。精神分裂癥動物模型及其藥物篩選。高尿酸血癥動物模型的建立

7、及抗痛風中藥的篩選。要求：（一）相似性（二）重復(fù)性（三）可靠性（四）適用性和可控性 （五）易行性和經(jīng)濟性。 用于藥物篩選的動物模型動物模型的意義和優(yōu)越性 ：（一）避免了在人身上進行實驗所帶來的風險 。（二）臨床上平時不易見到的疾病可用動物隨時復(fù)制出來。（三）可以克服人類某些疾病潛伏期長，病程長和發(fā)病率低的缺點 。（四）可以嚴格控制實驗條件，增強實驗材料的可比性 。（五）可以簡化實驗操作和樣品收集 。（六）有助于更全面地認識疾病的本質(zhì)。 轉(zhuǎn)基因動物可作為“生物反應(yīng)器”生產(chǎn)藥物。轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物不僅開辟了制藥業(yè)的新紀元，而且它也是轉(zhuǎn)基因動物研究最活躍的領(lǐng)域?；蚬こ趟幬? 個階段:1、細菌基因工

8、程，即把目的基因通過適當?shù)母慕▽?dǎo)入大腸桿菌中，再通過細菌等原核微生物表達的目的蛋白作為藥物;2、是細胞基因工程藥物，這是把人或哺乳動物的基因直接導(dǎo)入哺乳動物的細胞中，生產(chǎn)有生物活性的產(chǎn)品;3、其三是利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)低成本、高活性的藥物。、其三是利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)低成本、高活性的藥物。一、轉(zhuǎn)基因動物一、轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物是把外源基因?qū)朕D(zhuǎn)基因動物是把外源基因?qū)雱游锏纳臣毎袆游锏纳臣毎?，并整合該并整合該細胞后發(fā)育成為個體整合的外細胞后發(fā)育成為個體整合的外源基因源基因，整合的外源基因又能整合的外源基因又能影響其后代遺傳的動物。影響其后代遺傳的動物。藥用蛋白基因藥用蛋白基因表達細胞株表達

9、細胞株細胞核細胞核轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥用蛋白的基本過程轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥用蛋白的基本過程受體動物受體動物供體動物供體動物受精卵受精卵無核受精卵無核受精卵組裝的核細胞組裝的核細胞多細胞胚胎多細胞胚胎假孕假孕動物動物動物幼崽動物幼崽雌性轉(zhuǎn)基因動物雌性轉(zhuǎn)基因動物乳汁乳汁藥用蛋白藥用蛋白轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物的優(yōu)點：1、品種多、產(chǎn)量高、質(zhì)量好。2、設(shè)備簡單、不耗能、無環(huán)鏡污染。3、生產(chǎn)周期短。4、生產(chǎn)成本低。2006年報道：我國目前已有乳鐵蛋白、白蛋白、凝血因子等進入臨床試驗階段，首個轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的藥物有望在5年內(nèi)上市。“究竟是哪種轉(zhuǎn)基因藥物率先上市，還得由臨床療效說了算?！?轉(zhuǎn)基因動物就是指通過實驗方法，人工地把外源基因?qū)雱游锏氖芫眩?使外源基因與動物本身的基因組整合在一起，因而外源基因能隨細胞的分裂而增殖，并能穩(wěn)定地遺傳給下一代。在此基礎(chǔ)上，人們只要將事先提取到的藥用蛋白注射到牛、羊等身上，當它們的下一代出生，人們便可以從其體內(nèi)提取更多的藥用蛋白。簡單地說，就像在動物的體內(nèi)批量生產(chǎn)藥物一樣。此前，我國科