外源基因在酵母中的表達(dá)

1、重組DNA技術(shù)與基因工程523416重組DNA技術(shù)與基因工程的基本概念重組DNA技術(shù)所需的基本條件重組DNA技術(shù)的操作過程目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)外源基因在酵母中的表達(dá)A 酵母作為表達(dá)外源基因受體的特征6 外源基因在酵母中的表達(dá) 酵母（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞半知菌類（半知酵母），共由56個(gè)屬、500多個(gè)種組成。如果說大腸桿菌是外源基因最成熟的原核生物表達(dá)系統(tǒng)，則酵母菌是最成熟的真核生物表達(dá)系統(tǒng)。酵母的分類學(xué)特征真核生物，分屬于子囊菌綱（子囊酵母）、擔(dān)子菌綱（擔(dān)子酵母）、A 酵母作為表達(dá)外源基因受體的特征6 外源基因在酵母中的表達(dá)酵

2、母表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)全基因組測(cè)序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡便能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中具有原核細(xì)菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡單、成本低廉不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國FDA認(rèn)定為安全的基因工程受體系統(tǒng)（Generally Recognized As Safe GRAS）酵母菌是最簡單的真核模式生物B 酵母的宿主系統(tǒng)6 外源基因在酵母中的表達(dá)提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿主抑制超糖基化作用的突變宿主減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主目前已廣泛用于外源基因表達(dá)和研究的酵母

3、包括：酵母屬 如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）克魯維酵母屬 如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）畢赤酵母屬 如巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）裂殖酵母屬 如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）漢遜酵母屬 如多態(tài)漢遜酵母（Hansenula polymorpha）其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因最理想。提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿主能導(dǎo)致釀酒酵母中重組蛋白產(chǎn)量提高或質(zhì)量改善的突變類型：ssc1ssc2rgr1ose1ssc11 rho-突變類型生物效應(yīng)作

4、用位點(diǎn)改善重組蛋白分泌鈣離子依賴型的ATP酶提高重組蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄水平提高重組蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平提高重組蛋白表達(dá)改善重組蛋白分泌羧肽酶Y轉(zhuǎn)錄水平提高重組蛋白表達(dá)抑制超糖基化作用的突變宿主能抑制超糖基化的突變類型mnnalgoch突變類型生物效應(yīng) 許多真核生物的蛋白質(zhì)在其天門冬酰胺側(cè)鏈上接有寡糖基團(tuán)，它們常常影響蛋白質(zhì)的生物活性。整個(gè)糖單位由糖基核心和外側(cè)糖鏈兩部分組成。 酵母菌普遍擁有蛋白質(zhì)的糖基化系統(tǒng)，但野生型釀酒酵母對(duì)異源蛋白的糖基化反應(yīng)很難控制，呈超糖基化傾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。甘露糖生物合成缺陷型天門冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷型外側(cè)糖鏈添加缺陷型減少泛素依賴型蛋白降解作用的突

5、變宿主泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解作用蛋白酶體LysHOOCUbiquitin 76 aa ubiquitin ligase E3 Lysubiquitin ligase E3 Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主酵母菌泛素依賴型蛋白降解系統(tǒng)的編碼基因酵母菌共有四個(gè)泛素編碼基因：UBI 1 編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 對(duì)數(shù)生長期表達(dá) 穩(wěn)定期關(guān)閉UBI 2 編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 對(duì)數(shù)生長期表達(dá) 穩(wěn)定期關(guān)閉UBI 3 編碼泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76） 對(duì)數(shù)生長期表達(dá) 穩(wěn)定期關(guān)閉UBI 4 編碼泛素五聚體 對(duì)數(shù)生長期關(guān)閉 穩(wěn)定期表達(dá)酵母菌共有

6、七個(gè)泛素連接酶基因：UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主泛素降解途徑衰減的釀酒酵母在釀酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表達(dá)，UBI 4-突變株能UBI 4缺陷型：正常生長，但細(xì)胞內(nèi)游離泛素分子的濃度比野生株要低得多，因此UBI 4缺陷突變株是外源基因表達(dá)理想的受體。UBA 1缺陷型：UBA1編碼泛素激活酶E1，UBA1突變株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介導(dǎo)的蛋白降解。Ubc4 - ubc5 雙突變型：七個(gè)泛素連接酶基因的突變對(duì)衰減蛋白降解作用同樣有效。C 酵母的載體系統(tǒng)6 外源基

7、因在酵母中的表達(dá)酵母克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建酵母中的野生型質(zhì)粒酵母中的野生型質(zhì)粒釀酒酵母中的2m環(huán)狀質(zhì)粒幾乎所有的釀酒酵母中都含有2m雙鏈同源重組REP1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB環(huán)狀質(zhì)粒，拷貝數(shù)達(dá)50至100個(gè)。IRs 反向重復(fù)序列，600 bp，重組FLP 編碼產(chǎn)物驅(qū)動(dòng)IRs的同源重組REP 編碼產(chǎn)物控制質(zhì)粒的穩(wěn)定性STB REP的結(jié)合位點(diǎn)接合酵母屬中的pSR1和pSB1，以及克魯維酵母屬中的pKD1等均與2m質(zhì)粒類似。酵母克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建含有ARS的YRp質(zhì)粒的構(gòu)建 ARS為酵母菌中的自主復(fù)制序列，0.8-1.5kb，染色體上每30-40kb就有一個(gè)ARS元件。酵母菌自主復(fù)

8、制型質(zhì)粒的構(gòu)建組成包括復(fù)制子、標(biāo)記基因、提供克隆位點(diǎn)的大腸桿菌質(zhì)粒DNA。 以ARS為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YRp 上述兩類質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達(dá)200個(gè)，但培養(yǎng)幾代 以2m質(zhì)粒上的復(fù)制元件為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YEp后，質(zhì)粒的丟失率高達(dá)50%-70%，主要是由于分配不均勻所致。酵母克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建含有CEN的YCp質(zhì)粒的構(gòu)建 CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關(guān)的序列 將CEN DNA插入含ARS的質(zhì)粒中，獲得的新載體稱為YCp YCp質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數(shù)只有1 - 5個(gè)含有TEL的YAC質(zhì)粒的構(gòu)建酵母克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質(zhì)

9、粒的構(gòu)建 在大腸桿菌質(zhì)粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標(biāo)記基因，構(gòu)建出來的質(zhì)粒稱為Yip。目的基因表達(dá)盒通常插在染色體DNA特定序列中，這樣目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體DNA區(qū)域。D 酵母的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)6 外源基因在酵母中的表達(dá)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的命運(yùn)酵母菌的轉(zhuǎn)化程序用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因酵母的轉(zhuǎn)化程序酵母原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法在Ca2+和PEG的存在下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1-2%。但該程序操作周期長，而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)再生率的嚴(yán)重制約。 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的一個(gè)顯著特點(diǎn)是，一個(gè)受體細(xì)胞可同時(shí)接納多個(gè)質(zhì)粒分子，而且這種共

10、轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25-33%。酵母的轉(zhuǎn)化程序堿金屬離子介導(dǎo)的酵母完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 釀酒酵母的完整細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）、PEG、熱休克處理后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA，而且具有下列特性：吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極為罕見酵母的轉(zhuǎn)化程序酵母電擊轉(zhuǎn)化法 酵母菌原生質(zhì)體和完整細(xì)胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA，但在此過程中應(yīng)避免使用PEG，它對(duì)受電擊的細(xì)胞具有較很大的負(fù)作用電擊轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)是不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件適用范圍廣，而且轉(zhuǎn)化率可高達(dá)105 / mg DNA。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的命運(yùn)單雙鏈DNA均可轉(zhuǎn)化酵母菌，但單鏈的轉(zhuǎn)化率是

11、雙鏈的10-30倍；含有復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，能準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)化為雙鏈并復(fù)制；不含復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，能高效地同源整合入染色體這對(duì)于體內(nèi)定點(diǎn)突變酵母基因組極為有利；克隆在YIp整合型質(zhì)粒上的外源基因，如果含有受體細(xì)胞的染色體DNA的同源序列，會(huì)發(fā)生高頻同源整合，整合子占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的50-80%。用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因 用于酵母菌轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因主要有營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因和顯性基因兩大類： 營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE 但對(duì)于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺陷型的受體非常困難。營養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)基因用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記

12、基因 顯性標(biāo)記基因 顯性標(biāo)記基因的編碼產(chǎn)物大都是毒性物質(zhì)的抗性蛋白 aph 氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶 抗G418 cat 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 抗氯霉素 dhfr 二氫葉酸還原酶 抗氨甲喋呤和磺胺 cup1 銅離子螯合物 耐受銅離子 suc2 蔗糖轉(zhuǎn)化酶 耐受高濃度蔗糖 ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草劑標(biāo)記基因編碼產(chǎn)物遺傳表型E 酵母的表達(dá)系統(tǒng)6 外源基因在酵母中的表達(dá)外源基因在酵母菌中表達(dá)的限制因素酵母菌啟動(dòng)子的可控性酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇酵母啟動(dòng)子的可控性 溫度控制型啟動(dòng)子a - a a 型啟動(dòng)子：釀酒酵母有a和a a兩種單倍體，分別由MATa和MATa aa 型啟動(dòng)子hmla a2-102 MA

13、Taa1Sir3-8TSa 型啟動(dòng)子 受體細(xì)胞基因組 重組質(zhì)粒a 型啟動(dòng)子hmla a2-102 MATaa1Sir3-8TSa 型啟動(dòng)子a a2a a12535兩個(gè)等位基因決定。a a1因子決定a a細(xì)胞特征表達(dá)a a2因子阻遏a細(xì)胞特征表達(dá)a1-a2阻遏a a細(xì)胞特征表達(dá)編碼a a2因子的基因突變型hmla a2-102能產(chǎn)生a a2變體，它能滅活a1，同時(shí)阻遏a型酵母啟動(dòng)子的可控性釀酒酵母超誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖誘導(dǎo)效果不明顯，基因基底水平表達(dá)GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖誘導(dǎo)時(shí)，GAL4高效表達(dá)，GAL1、GAL1

14、、GAL10超高效表達(dá)GAL10Promoter的半乳糖利用酶系由 G A L 1 G A L 7 和 G A L 1 0基因編碼外源基因在酵母中表達(dá)的限制因素外源基因穩(wěn)態(tài)mRNA的濃度外源基因mRNA的翻譯活性酵母菌對(duì)密碼子的偏愛性在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質(zhì)（如甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脫氫酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25個(gè)密碼子編碼的。酵母表達(dá)系統(tǒng)的選擇 釀酒酵母的基因表達(dá)系統(tǒng)最為成熟，包括轉(zhuǎn)錄活性較高的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)酶基因ADH所屬的啟動(dòng)子，多種重組外源蛋白獲得成功表達(dá)。 釀酒

15、酵母表達(dá)系統(tǒng)的最大問題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細(xì)胞緊密結(jié)合，而不能大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達(dá)系統(tǒng)來彌補(bǔ)。酵母表達(dá)系統(tǒng)的選擇 乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產(chǎn)的高效表達(dá)穩(wěn)定性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)能穩(wěn)定遺傳40代以上。 乳酸克魯維酵母表達(dá)分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。酵母表達(dá)系統(tǒng)的選擇 巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)菌，能在低廉的含甲醇培養(yǎng)基中生巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)長，甲醇可高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達(dá)，因此生長迅速、乙醇氧化酶基因AOX

16、1所屬強(qiáng)啟動(dòng)子、表達(dá)的可誘導(dǎo)性是巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的三大優(yōu)勢(shì)。但甲醇易揮發(fā)，操作條件差。 由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復(fù)制型載體，所以外源基因的表達(dá)序列一般整合入受體的染色體DNA上。在此情況下，外源基因的有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。高效表達(dá)在很大程度上取決于整合拷貝數(shù)的多寡。目前已有50余種具酵母表達(dá)系統(tǒng)的選擇 多型漢遜酵母也是一種甲基營養(yǎng)菌。其自主復(fù)制序列HARS已被克多型漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)隆，并用于構(gòu)建克隆表達(dá)載體，但與巴斯德畢赤酵母相似，這種載體在受體細(xì)胞有絲分裂時(shí)顯示出不穩(wěn)定性。所不同的是，HARS質(zhì)粒能高頻自發(fā)地整合在受體的染色體DNA上，甚至可以

17、連續(xù)整合100多個(gè)拷貝， 目前，包括乙型肝炎表面抗原在內(nèi)的數(shù)種外源蛋白在該系統(tǒng)中獲得因此重組多型漢遜酵母的構(gòu)建也是采取整合的策略。成功表達(dá)。F 利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗6 外源基因在酵母中的表達(dá) 由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴(yán)重的傳染病，每年約有200萬病人死亡，并有3億人成為HBV攜帶者，其中相當(dāng)一部分人可能轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌患者。目前對(duì)乙型肝炎病毒還沒有一種有效的治療藥物，因此高純度乙型疫苗的生產(chǎn)對(duì)預(yù)防病毒感染具有重大的社會(huì)效益，而利用重組酵母大規(guī)模生產(chǎn)乙型疫苗為其廣泛應(yīng)用提供了可靠的保證。乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 乙肝病毒是一種蛋白包裹型的雙鏈DNA病毒，具有感

18、染力的病毒顆乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)粒呈球面狀，直徑為42 nm，基因組僅為3.2 kb。病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化和非糖基化兩種形式。顆粒內(nèi)的蛋白成份包括核心抗原（HBcAg）、病毒DNA 除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝臟還能合成并釋放大量的22聚合酶、微量病毒蛋白。nm的空殼亞病毒顆粒，其免疫原性是未裝配的各種包裝蛋白組份的1000倍。包裝蛋白共有三種轉(zhuǎn)膜糖蛋白：S、M、L多肽。乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因ATGATGATGTAA108 aa55 aa226 aapreS1preS2SS 多肽226 aaM 多肽28

19、1 aaL 多肽399 aa乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 乙肝病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備苗是從病毒攜帶者的肝細(xì)胞質(zhì)膜上提取出來的。雖然這種質(zhì)膜來源的疫苗具有較高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母 20世紀(jì)80年代開始選擇釀酒酵母表達(dá)重組HBsAg，主要工作包括將S多肽的編碼置于ADH1啟動(dòng)子控制下，轉(zhuǎn)化子能表達(dá)出具有免疫活性的重組蛋白，它在細(xì)胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在，平均顆粒直徑為22nm，其結(jié)構(gòu)和形態(tài)均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中的病毒顆粒相同。 目前，由釀酒酵母生產(chǎn)的重組HBsAg顆粒已作為乙肝疫苗

20、商品化重組產(chǎn)物的最終產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞總蛋白量的1%-2%。 進(jìn)一步的研究表明，M多肽和L多肽對(duì)S型疫苗具有顯著的增效作用，由三者（或兩者）構(gòu)成的復(fù)合型乙肝疫苗還可以誘導(dǎo)那些對(duì)S抗原缺乏響應(yīng)的人群的免疫反應(yīng)。產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母整合型重組巴斯德畢赤酵母的構(gòu)建PARS2Bgl II5 AOX1HBsAgPHIS43 AOX1Bgl IIpBSAG15111 kbBgl II5 AOX1 HBsAgPHIS43 AOX1his+的轉(zhuǎn)化子重組分子轉(zhuǎn)化his-的受體細(xì)胞染色體DNA產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母重組巴斯德畢赤酵母的性能 由于巴斯德畢赤酵母染色體DNA上還擁有第二個(gè)乙醇氧化酶

21、基因AOX2，所以整合型重組菌仍能在含有甲醇的培養(yǎng)基上生長。 重組菌首先在含有甘油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待甘油耗盡后，加入甲醇誘導(dǎo)HBsAg表達(dá)，最終S蛋白的產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞可溶性蛋白總量的3%在大規(guī)模的生產(chǎn)過程中，巴斯德畢赤酵母工程菌在一個(gè)240L的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，最終可獲得90克22nm的HBsAg顆粒，足夠制成900萬份乙肝疫苗。G 酵母糖蛋白生產(chǎn)的人源化改造6 外源基因在酵母中的表達(dá) 除抗體外，哺乳動(dòng)物絕大多數(shù)糖蛋白的半衰期和功能依賴于糖鏈末端的唾液酸，其它裸露的末端糖（如甘露糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖等）會(huì)被糖特異性的受體或凝集素清除。由于不少藥用糖蛋白需要唾液酸化，因此其生產(chǎn)目前只能依靠哺乳動(dòng)

22、物受體，因?yàn)楹笳吣苓M(jìn)行人樣化的N-糖基化反應(yīng)，包括在末端加唾液酸的能力。酵母和絲狀真菌作為重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)，與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比，具有較高的重組蛋白表達(dá)率、較短的發(fā)酵周期、能在化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中生長等很多優(yōu)勢(shì)。然而，野生型酵母往往將高甘露糖型的多糖鏈加在蛋白質(zhì)上，直接影響表達(dá)產(chǎn)物在人體內(nèi)的穩(wěn)定性與功效。ERER兩種多糖合成途徑的比較人類糖蛋白側(cè)鏈多聚糖的成熟，涉及下列基因編碼的酶系：MnsI： a-1,2-甘露糖苷酶 IMnsII：a-1,2-甘露糖苷酶 IIGnTI： -1,2-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶 IGnTII：-1,2-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶 IIGalT： -1,4-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶Si

23、aT： a-2,6-唾液酸苷轉(zhuǎn)移酶巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中不存在上述酶系。巴斯德畢赤酵母糖鏈合成的人源化改造JC308 WTRDP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH551Stephen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2006敲除4個(gè)基因，摧毀巴斯德畢赤酵母原有的超糖基化系統(tǒng)： Doch1，Dpno1，Dmnn4B，Dbmt2導(dǎo)入9個(gè)基因，構(gòu)建人的糖基化系統(tǒng)： UgnT：小鼠的UDP-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 UgnT：克魯維酵母的UDP-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 MnsI：小鼠的a-1,2-甘露糖苷酶 I MnsII：果蠅的a-1,2-

24、甘露糖苷酶 II GnTI：人的-1,2-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶 I GnTII：大鼠的-1,2-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶 II GalE：裂殖酵母的半乳糖差向異構(gòu)酶 GalE：果蠅的UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 GalT：人的-1,4-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶YSH577rEPO巴斯德畢赤酵母糖鏈合成的人源化改造JC308 WTRDP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH551Stephen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2006YSH577rEPOJC308 WTRDP750-1,N-GlcNAc-1,4-GlcNAc-1,2-GlcNAc-1,4-

25、Mana-1,6-Mana-1,3-Mana-1,2-Man-1,4-Gal巴斯德畢赤酵母糖鏈合成的人源化改造JC308 WTRDP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH551Stephen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2006YSH577rEPO再導(dǎo)入5個(gè)基因，構(gòu)建末端唾液酸的添加系統(tǒng)： GNE：人的UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向異構(gòu)酶 / SPS：人的N-乙酰甘露糖胺丙酮酸-9-磷酸合成酶 CSS：人的CMP-唾液酸合成酶 CST：小鼠的CMP-唾液酸運(yùn)輸因子 ST： 人的唾液酸轉(zhuǎn)移酶與酵母II型轉(zhuǎn)膜定位肽 遺憾的是，YSH

26、577株并未像預(yù)期的那樣在糖基末端有效添加唾液酸。N-乙酰甘露糖胺激酶融合體巴斯德畢赤酵母糖鏈合成的人源化改造JC308 WTRDP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH551Stephen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2006YSH577rEPO改善唾液酸化反應(yīng)的效率：優(yōu)化GNE、SPS、CSS、CST基因的密碼子；構(gòu)建其它形式的唾液酸轉(zhuǎn)移酶（ST）融合肽，發(fā)現(xiàn)來自小鼠a-2,6-ST的催化功能域與釀酒酵母甘露糖基轉(zhuǎn)移酶1將上述五個(gè)基因全部克隆在一個(gè)表達(dá)載體上，并用該表（Mnt1）的靶向信號(hào)肽相融合的嵌合體，特別有效；達(dá)載體轉(zhuǎn)化

27、YSH577株，獲得YSH597株。巴斯德畢赤酵母糖鏈合成的人源化改造JC308 WTRDP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH551Stephen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2006YSH577rEPOJC308 WTYSH597-1,N-GlcNAc-1,4-GlcNAc-1,2-GlcNAc-1,4-Mana-1,6-Mana-1,3-Mana-1,2-Man-1,4-Gala-2,6-SiaRDP750重組巴斯德畢赤酵母分泌的rEPO的鑒定JC308 WTRDP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH55

28、1YSH577rEPO重組rEPO的HPLC圖譜分析：重組巴斯德畢赤酵母分泌的rEPO的鑒定JC308 WTRDP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH551YSH577rEPO重組rEPO的血細(xì)胞比容分析：YSH551株YSH597株注射第 8 天注射第15天H 酵母轉(zhuǎn)錄機(jī)器的基因工程綜合改造6 外源基因在酵母中的表達(dá) 化石能源的日益消耗大大促進(jìn)了可再生型生物燃料（如乙醇等）的開發(fā)與生產(chǎn)。然而，大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的關(guān)鍵是酵母對(duì)高濃度乙醇和葡萄糖的耐受性。長期以來，人們普遍關(guān)注的是對(duì)乙醇生物合成基因和耐受基因的遺傳操作，這些努力雖然取得了顯著的進(jìn)步，但似乎觸及了極限?；蚬?/p>

29、程改良能否突破這一極限呢？Hal Alper等人提出的所謂轉(zhuǎn)錄機(jī)器綜合基因操作戰(zhàn)略（Global transcription machineryengineering，gTME）讓我們看到了新的希望。釀酒酵母轉(zhuǎn)錄機(jī)器的定向改造在釀酒酵母中，乙醇生物合成基因與其他看家基因一樣，由RNA聚合酶 II 負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶 II 系統(tǒng)包含 75 種一般轉(zhuǎn)錄因子或共激活因子，其中最關(guān)鍵的是TFIID復(fù)合物，包含TATA-BOX結(jié)合蛋白（TBP，由基因 SPT15 編碼）及其及 14 種激活因子（TAFs）。有證據(jù)顯示，TATA-BOX結(jié)合蛋白的突變會(huì)改變RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子的特異性識(shí)別性質(zhì)，進(jìn)而影響

30、眾多不同基因的表達(dá)譜。這便是轉(zhuǎn)錄機(jī)器綜合基因操作戰(zhàn)略的Hal Alper et al. Science 314. 1565. 2006理論基礎(chǔ)。TATA-BOXTBPTAFsTFIID complex釀酒酵母轉(zhuǎn)錄機(jī)器的定向改造 Hal Alper et al. Science 314. 1565. 2006利 用 易 錯(cuò) P C R 技 術(shù) 構(gòu) 建SPT15的突變文庫，轉(zhuǎn)入釀酒酵母標(biāo)準(zhǔn)單倍體BY4741株，該單倍體含有內(nèi)源性野生型的SPT15染色體拷貝。然后在逐次提高的高濃度乙醇和葡萄糖存在下篩選耐受突變株。當(dāng)篩選壓力增加到6%的乙醇和120g/L的葡萄糖時(shí)，獲得spt15-300突變株，它相對(duì)野生株的耐受倍數(shù)達(dá)13倍。釀酒酵母轉(zhuǎn)錄機(jī)器的定向改造 Hal Alper et al. Science 314. 1565. 2006利 用 易 錯(cuò) P C R 技 術(shù)