杞菊地黃丸定性檢查及含量測定

1、 杞菊地黃丸定性檢查及含量測定 前言：實驗依據(jù)：有熟地之膩補腎水,即有澤瀉之宣泄腎濁以濟之;有英肉之溫澀肝經(jīng),即有丹皮之清瀉肝以佐之;有山藥收攝脾經(jīng),即有獲菩之淡滲脾濕以和之。藥止六味,而大開大合,三陰并治,詢補方之正鵲也”。本方配伍具有“三補”、“三瀉”的特點,但中熟地黃用量是山萸肉、山藥兩藥之和,且三辛傭明顯重于三瀉。枸杞和菊花增加了清肝明目的效果。現(xiàn)對杞菊地黃丸中各味藥材進行定性鑒別和含量測定。 關(guān)鍵詞;杞菊地黃丸；定性鑒別；含量測定； 1.地黃(鮮躍全) 定性鑒別（TLC法）實驗儀器：超聲發(fā)生器、研缽、燒杯、微量移液管、吹風機、研缽、燒杯、硅膠G薄層板、實驗材料：杞菊地黃丸 熟地黃 澤

2、瀉 茯苓 枸杞子 牡丹皮 山茱萸 山藥細粉 菊花 實驗試劑：乙酸乙酯、冰醋酸、10%硫酸、蒸餾水正丁醇、甲苯、冰醋酸、無水乙醇、10%硫酸、蒸餾水 試驗方法 1.1供試品溶液的制備 1.1.1取杞菊地黃丸(濃縮丸) 6g，研碎，加乙醇超聲處理分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇使溶解，作為供試品溶液。 1.1.2供試品溶液的制備 稱取顆粒劑2.2 g，研磨成細粉，加甲醇40 ml，超聲振蕩30 min。過濾。濾液濃縮至干,加乙酸乙酯2 ml溶解,得供試液。 1.2對照品的制備 另取毛蕊花糖苷對照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。 1.3對照藥材的制備 稱取熟地黃浸膏粉0.5 g

3、，按照供試品溶液制備方法，制得熟地黃藥材的對照液。 1.4陰性對照液的制備 按處方比例，取除去熟地黃以外的其余藥材，同供試品溶液制備方法分別制成陰性對照液。稱取澤瀉0.75g、茯苓0.75g，30ml水加熱回流提取1個小時，過濾，提取液濃縮至一定濃度；取枸杞子0.5g、牡丹皮0.75g,山茱萸1g和菊花0.5g，70%乙醇加熱回流提取1個小時，過濾，濃縮成適當濃度；合并以上兩種濃縮液，加山藥細粉1g；加70%乙醇20 mL，加熱回流提取1個小時，濾過，蒸干，加適量水溶解，分別用10ml乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇lml使溶解，作為陰性對照溶液。 1.5薄層色譜法 1.5.1照

4、薄層色譜法中國藥典(2010年版)附錄YIB試驗，吸取上述溶液各5uL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯乙酸乙醋冰醋酸(24 : 8 : 1)為展開劑展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105加熱至斑點顯色清晰。 1.5.2薄層色譜照薄層色譜法中國藥典(2010年版)附錄YIB試驗，吸取上述溶液各5uL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水-甲醇(6332)為展開劑展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105加熱至斑點顯色清晰，顯相同顏色的斑點且陰性對照液色譜在該位置上不顯斑點。2.山藥（周開放）【性味與歸經(jīng)】味甘，性平。歸脾、肺、腎經(jīng)?！竟δ芘c主治】補脾養(yǎng)胃，生津

5、益肺，補腎澀精。 實驗材料：回流裝置、冷凝裝置、水浴鍋、坩堝、燒杯、微量移液管、硅膠G薄層板、吹風機。 實驗試劑：乙酸乙酯、甲醇、濃氨試液、無水乙醇、10磷鉬酸。試驗方法2.1供試品溶液的制備 取本品（杞菊地黃丸）粉末5g，加二氯甲烷30ml，加熱回流2小時，濾過，濾液蒸干，殘渣加二氯甲烷1ml使溶解，作為供試品溶液。2.2對照品的制備 另取山藥對照藥材5g，同法制成對照藥材溶液。對照藥材加二氯甲烷同法制成對照藥材溶液。2.3陰性對照液的制備 按處方比例，取除去山藥以外的其余藥材，同供試品溶液制備方法分別制成陰性對照液。 1.稱取澤瀉0.75g、茯苓0.75g和熟地黃2g，30ml水加熱回流提

6、取1個小時，過濾，提取液濃縮至一定濃度； 2.取枸杞子0.5g、山茱萸1g、牡丹皮0.75g和菊花0.5g，70%乙醇加熱回流提取1個小時，過濾，濃縮成適當濃度； 3.合并以上兩種濃縮液;加70%乙醇20mL，加熱回流提取1個小時，濾過，蒸干，加適量水溶解，分別用10ml乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇lml使溶解，作為陰性對照溶液。2.5薄層色譜法試驗 照薄層色譜法中國藥典(2010年版)附錄YIB試驗，吸取上述溶液各5uL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液(9：1：0.5)為展開劑展開，取出，晾干，噴以10磷鉬酸乙醇溶液，在105加熱至斑點顯色清晰，供試

7、品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點且陰性對照液色譜在該位置上不顯斑點。 3.茯苓（劉保松） 實驗器材：50ml圓底燒瓶，冷凝管，蒸發(fā)皿，水浴鍋，過濾裝置，硅膠G薄層板，紫外檢測儀，吹風機 實驗材料：茯苓對照藥材、杞菊地黃丸實驗試劑：乙醚，甲醇，甲苯，乙酸乙酯，甲酸，2%香草醛硫酸溶液，乙醇。 3.1供試品溶液制備 取杞菊地黃丸濃縮丸6g，研碎，加乙醚50ml(量筒)，超聲處理10分鐘，濾過(濾紙，漏斗)，濾液蒸干(蒸發(fā)皿，水浴鍋)，殘渣加甲醇1ml使溶解(移液管)，作為供試品溶液。 3.2對照品藥材制備 取茯苓對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液。 3.3陰性對

8、照溶液制備 按處方比例，取除去茯苓以外的其余藥材，同供試品溶液制備方法制成缺茯苓陰性對照液。3.4薄層色譜法試驗 照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取上述兩種溶液各2ul，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯一乙酸乙酯一甲酸(20 ：5 ：0.5)為展開劑(移液管)，展開，取出，晾干，噴以2%香草醛硫酸溶液一乙醇(4：1)混合溶液，在105加熱至斑點顯色清晰(吹風機)。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的主斑點?；蛘哒毡由V法(中國藥典20015年版中國藥典)試驗，吸取上述溶液各5uL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯一乙酸乙酯一冰醋酸(24 : 8 : 1)為展開劑，

9、展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。 4.澤瀉（王金龍） 實驗器材：氧化鋁柱，水浴鍋，蒸發(fā)皿，過濾裝置，硅膠H薄層板，紫外檢測儀，吹風機 實驗材料：澤瀉對照藥材、杞菊地黃丸實驗試劑：乙酸乙酯，23-乙酰澤瀉醇B對照品，環(huán)己烷，乙酸乙酯，5%硅鎢酸乙醇。 4.1供試品溶液制備 取杞菊地黃丸濃縮丸6g，研碎，加乙酸乙酯20 m1(量筒)，超聲處理30分鐘，濾過(濾紙，漏斗)，濾液加于氧化鋁柱(200-300目，5g，內(nèi)徑為l cm，干法裝柱)上，用乙酸乙酯10ml洗脫(移液管)，收集洗脫液，

10、蒸干，殘渣加乙酸乙酯l ml(移液管)使溶解，作為供試品溶液。 4.2對照品藥材制備 取澤瀉對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液。 4.3對照品溶液制備 另取23-乙酰澤瀉醇B對照品，加乙酸乙酯制成每1 ml含2mg的溶液，作為對照品溶液。 4.4陰性對照溶液制備 按處方比例，取除去澤瀉以外的其余藥材，同供試品溶液制備方法制成缺澤瀉陰性對照液。稱取澤瀉0.75g、熟地黃2g，30ml水加熱回流提取1個小時，過濾，提取液濃縮至一定濃度；取枸杞子0.5g、山茱萸1g、牡丹皮0.75g和菊花0.5g，70%乙醇加熱回流提取1個小時，過濾，濃縮成適當濃度；合并以上兩種濃縮液，加山藥細粉1g；加70%乙醇

11、20 mL，加熱回流提取1個小時，濾過，蒸干，加適量水溶解，分別用10ml乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇lml使溶解，作為陰性對照溶液。 4.5薄層色譜法試驗 照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取上述兩種溶液各5ul，分別點于同一硅膠H薄層板上，以環(huán)己烷一乙酸乙酯(1 : 1）為展開劑(移液管)，展開，取出，晾干，噴以5%硅鎢酸乙醇溶液，在105加熱至斑點顯色清晰(吹風機)。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點?；蛘哒毡由V法(中國藥典20015年版中國藥典)試驗，吸取上述溶液各5uL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯一乙酸乙酯一冰醋酸(24 : 8

12、 : 1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。 5.丹皮（雷銘宇） 儀器：加熱回流裝置、薄層板、紫外光燈材料：乙酸乙酯、蒸餾水、甲醇、牡丹皮對照藥材、乙醚、丙酮、丹皮酚對照品、環(huán)己烷、鹽酸、三氯化鐵、乙醇定性鑒別（TLC法） 5.1 供試品溶液的制備 取本品15g（天平），研碎，加水100ml，加熱回流3 0分鐘，放冷，離心，取上清液，用乙酸乙酯50ml（50ml量筒）振搖提取，分取乙酸乙酯液，蒸干（水浴鍋），殘渣加甲醇lml使溶解，作為供試品溶液。 5.2對照藥材溶液提取 取

13、牡丹皮對照藥材1g（天平），研碎，加乙醚40ml，加熱回流1 小時，濾過，濾液揮去乙醚，殘渣加丙酮lml（量筒）使溶解，作為供試品溶液。 5.3對照品溶液的制備 取丹皮酚對照品，加丙酮制成每lml含lmg的溶液，作為對照品溶液。 5.4陰性對照溶液的制備 取處方中除丹皮外的其余藥味，稱取澤瀉0.75g、茯苓0.75g、熟地黃2g和山茱萸1g，30ml水加熱回流提取1個小時，過濾，提取液濃縮至一定濃度（水浴鍋）；取枸杞子0.5g和菊花0.5g，70%乙醇加熱回流提取1個小時，過濾，濃縮成適當濃度；合并以上兩種濃縮液，加山藥細粉1g；加70%乙醇20 mL，加熱回流提取1個小時，濾過，蒸干，加適量

14、水溶解，分別用10ml乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇lml使溶解，作為陰性對照溶液。 5.5.1薄層條件 照薄層色譜法（通則0502)試驗，吸取上述三種溶液各10ul分別點于同一硅膠G 薄層板上，使成條狀，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（3：1)為展開劑（層析缸），展開，取出，晾干，噴以鹽酸酸性5 %三氯化鐵乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的條斑。 5.5.2薄層板 硅膠薄層板20200.4,105 ,活化30備用;展開劑:-環(huán)乙烷-乙酸已酯-冰醋酸(1010.1);斑點觀察:置紫外燈下(=254)檢識定位5.6丹皮酚的含量測

15、定 5.6.1材料與方法 紫外分光光度計、 型電熱恒溫鼓風干燥箱 、紫外分析儀劑均為99.9%無水乙醇、水為二次蒸餾水 5.6.1.2材料 牡丹皮、丹皮酚對照品 5.6.1.3對照品標準溶液的制備 精確稱取丹皮酚對照品0.005g置于 50ml燒杯中，以無水乙醇溶解 轉(zhuǎn)至 100ml容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，得到 50ug/ml 的丹皮酚對照品溶液 5.6.1.4結(jié)果與分析5.6.1.4.1測定波長的選擇 以無水乙醇為對照品，在274nm出測的最大波長 5.6.1.4.2線性關(guān)系考察 分別吸取對照品溶液0.5ml，1ml，1.5ml，2ml，2.5ml，3.0ml，3.5ml，4m

16、l，置于25ml容量瓶中!，用無水乙醇稀釋至刻度搖勻 。以無水乙醇為空白溶液在 274nm 波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標樣品濃度為橫坐標繪制標準曲線。 5.6.1.4.3丹皮酚含量測定 準確稱取牡丹皮粉末 3.000g（分析天平），置于50ml錐形瓶中，加入25ml無水乙醇，60度恒溫水浴2h，趁熱過濾，置于25ml容量瓶中用無水乙醇溶液定容，作為供試品溶液。量取5份0.1ml牡丹皮供試品溶液分別置于25ml容量瓶中。用無水乙醇定容至刻度，搖勻，以無水乙醇為空白對照，于274nm波長處測定吸光度，測量三次，取平均值。丹皮酚含量測定結(jié)果如下表。吸光度檢出量ug/ml平均檢出量ug/ml丹皮

17、酚含量 6.菊花（鄔學良）定性鑒別（TLC法）實驗器材：水浴鍋，超聲提取儀，過濾裝置，硅膠H薄層板,聚酰胺薄膜，紫外檢測儀、錐形瓶、分析天平、回流裝置、蒸發(fā)皿、5ml量瓶、25ml棕色量瓶實驗材料：菊花，綠原酸供試品、杞菊地黃丸實驗試劑：稀鹽酸，乙酸乙酯，甲醇，乙醇，正丁醇，甲酸，冰醋酸、氯仿實驗方法 6.1供試品溶液制備方法 6.1.1取本品杞菊地黃丸（濃縮丸），研細(過一號篩)取約1g，精密稱定（分析天平）,置錐形瓶中,精密加人50甲醇50ml,稱定重量,加熱回流2小時,冷卻,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,精密量?。?0ml移液管）續(xù)濾液10ml,蒸干殘渣加氯仿5ml,浸漬

18、3分鐘,棄去氯仿液,殘渣揮去氯仿（水浴，蒸發(fā)皿）,加水適量使溶解,并轉(zhuǎn)移5ml棕色量瓶中,加水至刻度,搖勻,即得。 6.2對照品溶液的制備 取綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加50甲醇制成每1 ml含綠原酸35g的溶液，即得(10以下保存)。 6.3對照藥材溶液制備 另取菊花對照藥材粉末1g，同供試品溶液制法制成對照藥材溶液。 6.4陰性對照溶液的制備 取處方中除菊花外的其余藥味，按上述供試品溶液制備陰性對照溶液。稱取澤瀉0.75g、茯苓0.75g和熟地黃2g，30ml水加熱回流提取1個小時，過濾，提取液濃縮至一定濃度；取枸杞子0.5g、牡丹皮0.75g和山茱萸1g，70%乙醇加熱回

19、流提取1個小時，過濾，濃縮成適當濃度；合并以上兩種濃縮液，加山藥細粉1g；加70%乙醇20 mL，加熱回流提取1個小時，濾過，蒸干，加適量水溶解，分別用10ml乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇lml使溶解，作為陰性對照溶液。 6.5照薄層色譜法 6.5.1薄層板 薄層板：硅膠板H 乙酯-甲酸-冰醋酸-水(1：15：1：1：2)的上層溶液，乙酸乙酯-甲酸-水（7：2.5：2.5）的上層溶液，乙酸乙脂:甲酸:水:乙醇(1:1:1:0.2)上層液，乙酸乙酯-正丁醇-水（4:5:1）的上層溶液 6.5.2薄層板 聚酰胺薄膜板展開劑：36%乙酸吸取上述四種溶液各0.51l，分別點于同一硅膠

20、板上，用展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。7.山茱萸（陳明璐）實驗儀器：加熱回流裝置、高效液相色譜儀、滲漏裝置、吹風機、十八烷基硅烷鍵合硅膠實驗材料：杞菊地黃丸、蒸餾水、乙酸乙酯、甲醇、山茱萸藥材、熊果酸對照品、甲苯、乙酸乙酯、冰醋酸、磷酸、莫諾苷、馬錢苷 7.1.供試品溶液的制備 取本品15g ，研碎，加水100ml ，加熱回流 30 分鐘，放冷，離心，取上清液，用乙酸乙酯 50ml 振搖提取，分取乙酸乙酯液， 蒸干，殘渣加甲醇 lml 使溶解，作為供試品溶液。 7.2對照藥材溶液的制備 取

21、山茱萸對照藥材1g，加乙醚 40ml，加熱回流1小時，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯 lml 使溶解，作為對照藥材溶液。 7.3樣品溶液的制備 另取熊果酸對照品 ，加乙酸乙酯制成每lml 含 lmg的溶液，作為對照品溶液 7.4陰性對照品溶液的制備 按處方比例和制法制備不含山茱萸的陰性樣品，制成陰性樣品溶液。稱取澤瀉0.75g、茯苓0.75g和熟地黃2g，30ml水加熱回流提取1個小時，過濾，提取液濃縮至一定濃度；取枸杞子0.5g、牡丹皮0.75g和菊花0.5g，70%乙醇加熱回流提取1個小時，過濾，濃縮成適當濃度；合并以上兩種濃縮液，加山藥細粉1g；加70%乙醇20 mL，加熱回流提取1個小

22、時，濾過，蒸干，加適量水溶解，分別用10ml乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇lml使溶解，作為陰性對照溶液。 7.5定性檢測 照薄層色譜法（通則0502 )試驗，吸取鑒別（5 )項下的供試品溶液及上述對照藥材溶液和對照品溶液各 5l，分別點于同一硅膠 G 薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯 - 冰醋酸（24 : 8 : 1) 為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10% 硫酸乙醇溶液，在 105C 加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中， 在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上， 顯相同的紫紅色斑點。 7.5山茱萸的含量測定 照高效液相色譜法（通則0512) 測定。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八

23、烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑； 以乙腈為流動相A，以0. 3 % 磷酸溶液為流動相B，按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫；莫諾苷和馬錢苷檢測波長為240nm，柱溫為40C 。理論板數(shù)按莫諾苷、馬錢苷峰計算均應不低于4000 。時間（分鐘）流動相A（）流動相B（）0-55895925-2089220-35820928035-452060804045-556040 7.5.1.對照品溶液的制備 取莫諾苷對照品、馬錢苷對照品對照品適量，精密稱定，加7 0 % 甲 醇制成每lml中含莫諾苷與馬錢苷各20 l的混合溶液，即得。 7.5.2.供試品溶液的制備 取重量差異項下的本品，研細，取約0 .3g，精密稱定，置具

24、塞錐形瓶中，精密加入7 0 % 甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流1小時，放冷， 再稱定重量， 用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。 7.5.3含量測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10l，注入液相色譜儀，測定， 即得。 8.枸杞(李帥) 實驗器材：水浴鍋，離心機，回流裝置（圓底燒瓶，冷凝管），抽濾裝置（或漏斗），毛細管，層析缸，硅膠G薄層板，紫外檢測儀，高相液相色譜儀實驗試劑與材料：乙酸乙酯，冰醋酸，氯仿，甲苯，甲醇，甲酸，硫酸乙醇溶液，熊果酸對照品，杞菊地黃丸，枸杞子，山茱萸 薄層層析 8.1.供試品溶液的制備 8.1.1取本品15g ，研碎，加水100ml ，加熱回流 30 分鐘，放冷，離心，取上清液，用乙酸乙酯 50ml 振搖提取，分取乙酸乙酯液， 蒸干，殘渣加甲醇 lml 使溶解，作為供試品溶液。 8.1.2取本品粉末3.5g，加水煮沸，放冷，濾過，濾液用醋酸乙酯振搖提取，提取液濃縮至1ml，作為供試品溶液。 8.2對照藥材溶液的制備 另取枸杞子對照藥材 0.5g ，加水50ml，加熱回流30 分鐘，放冷，離心，取上清液，用乙酸乙酯 30ml 振搖提取，分取乙酸乙酯液， 蒸干，殘渣加甲醇 lml 使溶解，作為對照藥材溶液。 8.3陰性樣品溶液的制備 按處方比例和制法制備不含枸杞子的陰性樣品，制成陰性樣品溶液。稱取澤瀉0.75g、茯苓0.