山羊基因克隆試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

1、山羊基因克隆實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)第五組1 .提取DNA2 .DNA檢測(cè)（電泳）3 .目的DNA片段基因擴(kuò)增（PCR4 .DNA檢測(cè)（電泳）5 .目的基因片段與載體連接6 .大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備7 .導(dǎo)入受體細(xì)胞與藍(lán)白斑篩選8 .陽(yáng)性克隆鑒定9 .DNA測(cè)序一、DNA提取【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹恐笇?dǎo)DNA提取原理（羔羊片），熟悉DNA提取步驟?！緦?shí)驗(yàn)原理】組織細(xì)胞被PK消化后，經(jīng)過(guò)萃取漂洗獲得純凈DNA?！緦?shí)驗(yàn)步驟】1 .30mg組織，用眼科剪剪碎，力口入200TLbuffer+20LPK55c水浴1-3h。2 .加入220LbufferBL,振蕩15s,70C放置10min,溶液變清亮。3 .10000r離心

2、2min,移上清液至新離心管。4 .加220科L無(wú)水乙醇，充分振蕩15s,可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。5 .將溶液和絮狀物加入到吸附柱中，12000r離心30s,棄廢液。6 .向吸附柱加入500LWB,12000r離心30s,棄廢液。7 .向吸附柱加入500Lwashbuffer,12000r離心30s,棄廢液，空濾一次。8 .將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈離心管，加入50科LTE放置5min,12000r離心2min,備檢。二、DNA電泳檢測(cè)【實(shí)驗(yàn)原理】瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)是分離、鑒定和提純DNA片斷的有效方法。凝膠分辨率決定于使用材料的濃度，并由此決定凝膠的孔徑。瓊脂糖凝膠可分辯0.16.0kb的雙鏈DNA片段。

3、瓊脂糖凝膠電泳是一個(gè)電場(chǎng)作用。它首先利用瓊脂糖的分子篩效應(yīng)，此外，在弱堿性條件下,DNA分子帶負(fù)電荷，從負(fù)極向正極移動(dòng)。根據(jù)DNA分子大小、結(jié)構(gòu)及所帶電荷的不同，它們以不同的速率通過(guò)介質(zhì)運(yùn)動(dòng)而相互分離。借助澳化乙錠（EB）能與雙鏈DNA結(jié)合的作用，利用EB染色，并通過(guò)紫外線(xiàn)激發(fā)即可觀察被分離DNA片段的位置?！緝x器與試劑】瓊脂糖、10XTAE電泳緩沖液（40mMTris,20mMNaAc,1mMEDTAPH8.0）、載體緩沖液（0.25%澳酚藍(lán)，30%甘油）、澳化乙錠水溶液（10mg/ml）、凝膠槽、電泳儀【實(shí)驗(yàn)步驟】1 .取瓊脂糖0.9g,加入100ml1xTAE電泳緩沖液于250ml燒瓶中

4、，100c加熱溶解。2 .平衡凝膠槽，放好兩側(cè)擋板，調(diào)節(jié)好梳子與底板的距離（一般高出底板0.51mm）。3 .鋪板：在溶解好的凝膠中加入終濃度為0.5ug/ml的澳化乙錠水溶液，輕輕混勻，待冷至50c左右倒入凝膠槽，膠厚一般為58mm。4 .待膠徹底凝固后，去掉兩側(cè)擋板，將凝膠放入盛有電泳液的槽中（加樣孔朝向負(fù)極端，DNA由負(fù)極向正極移動(dòng)），使液面高出凝膠23mm,小心拔出梳子。5 .DNA樣品與載體緩沖液5:1混合并加入凹孔中（樣品不可溢出）。6 .打開(kāi)電源，調(diào)節(jié)所需電壓，電壓與凝膠的長(zhǎng)度有關(guān)，一般使用電壓不超過(guò)5v/cmo7 .據(jù)指示染料移動(dòng)的位置，確定電泳是否終止（澳酚藍(lán)的涌動(dòng)距離在5s

5、RNA和0.3kbDNA帶之間）。8 .電泳完畢關(guān)閉電源。將凝膠放紫外燈下觀察并拍照。三、目的DNA片段基因擴(kuò)增（PCR方案1:遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)31,PCR擴(kuò)增基因片段萬(wàn)7K2:【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私舛嗑酆厦告湻磻?yīng)DNA擴(kuò)增技術(shù)的基本原理和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，掌握PCR反應(yīng)基本技術(shù)?！緦?shí)驗(yàn)原理】PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是1986年由KallisMullis發(fā)現(xiàn)。這項(xiàng)技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，它不僅可用于基因分離克隆和核酸序列分析，還可用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達(dá)調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病診斷，腫瘤機(jī)制探查，法醫(yī)鑒定等方面。PCR技術(shù)

6、已成為方法學(xué)上的一次革命，它必將2大大推動(dòng)分子生物學(xué)各學(xué)科的研究發(fā)展。PCR是一種利用兩種與相反鏈雜交并附著于靶DNA兩側(cè)的寡核甘酸引物經(jīng)酶促合成特異的DNA片段的體外方法，由高溫變性，低溫退火和適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，然后反復(fù)進(jìn)行，使目的的DNA得以迅速擴(kuò)增，主要過(guò)程如圖6。置待擴(kuò)增DNA于高溫下解鏈成為單鏈DNA模板；人工合成的兩個(gè)寡核甘酸引物在低溫條件下分別與目的片段兩側(cè)的兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合；DNA聚合酶在72c將單核甘酸從引物3端開(kāi)始摻入，沿模板5-3方向延伸，合成DNA新鏈。由于每一循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，所以PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加，經(jīng)2530次周期之后，理

7、論上可增加109倍，實(shí)際上可增加107倍。PCR技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、靈敏度高特異性強(qiáng)和對(duì)原始材料質(zhì)量要求低等優(yōu)點(diǎn)，但由于所用的TaqDNA聚合酶缺乏53核酶外切酶活性，不能糾正反應(yīng)中發(fā)生的錯(cuò)誤核昔酸摻入，估計(jì)每9000個(gè)核甘酸會(huì)導(dǎo)致一個(gè)摻入錯(cuò)誤，不過(guò)InnisMA發(fā)現(xiàn)，錯(cuò)誤摻入的堿基有終止鏈延伸的作用傾向，使得錯(cuò)誤不會(huì)擴(kuò)大。cyclQ1!111HliIiIiiiiiI1cycl*iQcmj9rmpriiterfixtenEion厚埋示eEl圖3-1PCR原理示意圖PCR技術(shù)應(yīng)用廣泛，不可能有這樣一套條件滿(mǎn)足所有的實(shí)驗(yàn)，但本實(shí)驗(yàn)所介紹的方法可適應(yīng)于大多數(shù)DNA擴(kuò)增反應(yīng)，即使有的不適應(yīng)，至少也

8、確定了一個(gè)共同的起點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上可以作多種變化。不過(guò)下列因素在實(shí)驗(yàn)應(yīng)用時(shí)應(yīng)予以特別注意，以求取得滿(mǎn)意結(jié)果。1、模板：?jiǎn)?、雙鏈DNA和RNA都可以作為PCR樣品，若起始材料是RNA,須先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得取第一條cDNA。雖然PCR可以?xún)H用極微量的樣品，但為了保證反應(yīng)的特異性，一般宜用ng量級(jí)的克隆DNA,ug級(jí)的染色體DNA,待擴(kuò)增樣品質(zhì)量要求較低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，TaqDNA聚合酶的抑制劑以及能結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)。2、引物：引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵，下列原則有助于引物的合理設(shè)計(jì)。（1）盡可能選擇堿基隨機(jī)分布，GC含量類(lèi)似于被擴(kuò)增片段的引物，盡量避免具有多聚喋吟、多聚喀咤或其它異常

9、序列的引物。（2）避免具有明顯二級(jí)結(jié)構(gòu)（尤其是在引物3,一末端）的序列。（3）防止引物間的互補(bǔ)，特別要注意避免具有3,末端重疊的序列。（4）引物的長(zhǎng)度約為20個(gè)堿基，較長(zhǎng)引物較好，但成本增加，短引物則特異性降低。（5）引物濃度不宜偏高，過(guò)高易形成二聚體，而且擴(kuò)增微量靶目標(biāo)或起始材料是粗制品，容易產(chǎn)生非特異產(chǎn)物。3、緩沖液：PCR緩沖液的變化通常會(huì)影響擴(kuò)增結(jié)果，特別是MgCl2,其濃度對(duì)專(zhuān)一性和擴(kuò)增量有重大影響，通常最適濃度為1.5mM左右（每種dNTP的濃度為0.2mM時(shí)），濃度過(guò)高，使反應(yīng)特異性降低；濃度過(guò)低，使產(chǎn)物產(chǎn)量降低。四種dNTP濃度通常每種都是0.05mM0.2mM。過(guò)高的濃度會(huì)導(dǎo)

10、致錯(cuò)誤摻入，濃度過(guò)低，則影響反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。四種dNTP濃度應(yīng)大體相同，其中一種若偏高，會(huì)誘發(fā)錯(cuò)誤摻入，降低合成速度，過(guò)早終止延伸反應(yīng)。另外dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離Mg2+濃度降低，所以如果dNTP的濃度有很大改變，MgCl2濃度也要改變。Taq聚合酶是一種耐高溫聚合酶，用量通常是14單位/100ul,濃度過(guò)高，產(chǎn)生過(guò)多的非特異片段。4、循環(huán)參數(shù)：PCR循環(huán)是把起始材料加熱到9095C,保持短時(shí)間使雙鏈DNA解鏈；然后冷卻至37-55C,使引物與模板退火；再升溫至70-75C,在TaqDNA聚合酶的作用下?lián)饺雴魏烁仕幔挂镅啬０逖由?。解鏈不完全是?dǎo)致PCR失敗的最主要原因。用DNA擴(kuò)

11、增儀時(shí)，94c保持1min可使模板的起始物完全變性。若用低于94c的條件，則應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。引物與模板退火溫度由引物的長(zhǎng)度及G+C含量決定。適時(shí)間退火（12）min有利于產(chǎn)物的特異性。引物延伸在7075C保溫的時(shí)間可根據(jù)擴(kuò)增DNA片段的長(zhǎng)短來(lái)調(diào)節(jié)。正常情況下，每min可延伸1Kb的長(zhǎng)度，常規(guī)PCR一般為25-40個(gè)循環(huán)，若循環(huán)加長(zhǎng)，則由于酶活性降低，聚合時(shí)間延長(zhǎng)，引物及單核甘酸減少等原因，反應(yīng)后期容易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，所以在滿(mǎn)足產(chǎn)物得率前提下，應(yīng)盡量減少周期次數(shù)?！緝x器與試劑】（一）儀器與器皿PRC擴(kuò)增儀（PE2400）,瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備，微量取樣器，一次性指形管，凝膠成像儀,玻片（二）試劑與材

12、料瓊脂糖凝膠電泳試劑：1）電泳緩沖液：Tris一乙酸0.04mol/LPH8.00.002mol/LEDTA;2）加樣緩沖液：0.25%澳酚蘭40%w/v蔗糖；3）澳化乙錠溶液：0.05mg/ml澳化乙錠/水；4）瓊脂糖、TaqDNA多聚酶、5反應(yīng)緩沖液：125mmol/LTris-HClpH8.2;10mmol/LMgCl2;0.5mg/mlgelatin;125mmol/L（NH4）2SO4;Formamide25%、混合dNTP液（dATPdGTPdTTPdCTP各2mmol/L）、DNA模板（每2ml中含有10fg待擴(kuò)增DNA）、引物1（25pmol/L）,5加入EcoRI粘性末端堿基

13、、引物2（25pmol/L）,5加入HindIII粘性末端堿基、無(wú)菌水【實(shí)驗(yàn)步驟】1.按順序在200ml指形管中加入以下試劑與樣品。（因購(gòu)入的試劑批次不同，加樣時(shí)有所差別，以預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)?？傮w積共100ml,也可以配成40ml的反應(yīng)體系）表3-1PCR所用試劑樣品及其用量試劑及樣品用量/mLddH2O7410Buffer10MgCl2（10Buffer如已加入MgCl2,則不必加）6dNTP2引物12引物22模板2TaqDNA聚合酶22 .在PCR擴(kuò)增儀上按表3-2反應(yīng)條件編入程序（以下為參考值，因擴(kuò)增的DNA片段不同，各類(lèi)PCR擴(kuò)增儀程序設(shè)定各不相同，編程過(guò)程視擴(kuò)增的DNA片段的要求及儀器

14、而定）。表3-2PCR反應(yīng)參數(shù)條件循環(huán)條件（30次）預(yù)變性變性復(fù)性延伸溫度94C94C55C55C時(shí)間2min40s35s2min10s3 .延長(zhǎng)延伸72C7min編完反應(yīng)程序，置反應(yīng)管于PCR擴(kuò)增儀的反應(yīng)孔中，開(kāi)動(dòng)機(jī)器，擴(kuò)增循環(huán)反應(yīng)開(kāi)始。4 .PCR擴(kuò)增完畢，配2%瓊脂糖凝膠，取15ml反應(yīng)液及相適應(yīng)的PCRmark分別點(diǎn)樣，加樣緩沖液應(yīng)為40%W/V蔗糖，電泳觀察結(jié)果。5 .凝膠成像儀或紫外燈下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是否已擴(kuò)增到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的DNA片段。四、DNA電泳檢測(cè)（具體方案見(jiàn)實(shí)驗(yàn)2）五、目的基因片段與載體連接【實(shí)驗(yàn)原理】克隆載體（T載體）：重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、

15、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個(gè)帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒(méi)有的特性，即能使兩個(gè)平末端的雙鏈DNA分子連接起來(lái)。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過(guò)提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來(lái)提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分為3步：首先，T4DNA連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復(fù)合物；然后，酶-ATP復(fù)合物再結(jié)合到具有5磷酸基和3羥基切口

16、的DNA上，使DNA腺昔化；最后產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把切口封起來(lái)。連接反應(yīng)通常將兩個(gè)不同大小的片斷相連。很多DNA聚合酶在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)會(huì)在PCR產(chǎn)物雙鏈DNA每條鏈的3端加上一個(gè)突出的堿基A。pUCm-T載體是一種已經(jīng)線(xiàn)性化的載體，載體每條鏈的3端帶有一個(gè)突出的To【pUCm-T載體（pUCm-TVector）是用于克隆含有A末端PCR產(chǎn)物的理想載體。】這樣，pUCm-T載體的兩端就可以和PCR產(chǎn)物的兩端進(jìn)行正確的AT配對(duì)，在連接酶的催化下，就可以把PCR產(chǎn)物連接到pUCm-T載體中，形成含有目的片斷的重組載體。連接反應(yīng)的溫度在37C時(shí)有利于連接酶的活性。但是在這個(gè)溫度下粘性末端的氫鍵

17、結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12-16C,連接12-16h（過(guò)夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定?！緝x器與試劑】旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭,1.5ml微量離心管，雙面離心管架，臺(tái)式離心機(jī)，干式恒溫氣浴。T載體，T4DNA連接酶，連接酶緩沖液，無(wú)菌ddWater【實(shí)驗(yàn)步驟】采用膠回收試劑盒回收2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后的目的條帶（目的基因）。PCR產(chǎn)物與T載體直接連接：1 .事先將干式恒溫儀（或冰盒里的水）溫度設(shè)定在1416C。2 .取4個(gè)滅菌的200L微量離心管，加入（需要調(diào)整）：4L目的基因、1LT載體、0.5LT4DNA連接酶（TAKA

18、RA,350U/ul）、1科L連接酶緩沖液10xbuffer、3.5LddWater;總量10L體系3 .上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于14C干式恒溫儀（或14c水中）中保溫過(guò)夜（12-16h）。4 .連接后的產(chǎn)物可以立即用來(lái)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞或置4C冰箱備用。六、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)菌在0CCaCl2低滲溶液中膨脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的感受態(tài)。【儀器與試劑】旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，50mL微量離心管，1.5mL微量離心管，臺(tái)式冷凍離心機(jī)，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，分光光度計(jì)，超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環(huán)，恒溫?fù)u床

19、，培養(yǎng)皿（已鋪好固體LB-Amp）,酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱，濾膜和過(guò)濾器E.coli菌種，LB培養(yǎng)基，0.1mol/LCaCl2溶液，無(wú)菌ddWater,LB培養(yǎng)基（不加抗菌素），LB培養(yǎng)基（加抗菌素），無(wú)菌ddwater,IPTGX-gal。【實(shí)驗(yàn)步驟】1 .在超凈工作臺(tái)中，將1mL大腸桿菌菌液加入100mLLB液態(tài)培養(yǎng)基（不含抗菌素），37C搖床培養(yǎng)過(guò)夜。2 .取0.5mL上述菌液轉(zhuǎn)接到含有50mLLB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37C下250r/min搖床培養(yǎng)23h,測(cè)定OD590為0.350.4左右（0.40.6,細(xì)胞數(shù)108/mL,此為關(guān)鍵參數(shù)）。（注意：此步搖菌的時(shí)候，要有一管不加菌

20、的LB培養(yǎng)液同時(shí)搖菌）3 .將1mL菌液加入到4支1.5mL預(yù)冷無(wú)菌的聚丙烯離心管中，于冰上放置10min,然后于4C,5000r離心5min。4 .將離心管倒置以倒盡上清液，加入1mL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液，立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置30min。5 .4C,5000r離心5min,棄上清液后，用100L冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂懸，插入冰中放置2h,可以直接用作轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，或立即放入-4C冰柜中保藏。七、導(dǎo)入受體細(xì)胞與藍(lán)白斑篩選【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆漳康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞的方法、了解藍(lán)白斑篩選法?！緦?shí)驗(yàn)原理】細(xì)菌在低溫下經(jīng)CaC2溶液處理，細(xì)菌細(xì)胞膨脹成球形，提高了

21、膜的通透性，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA,形成抗DNase的竣基-鈣磷酸復(fù)合物，粘附于細(xì)胞表面上，經(jīng)42C短時(shí)間熱沖擊處理，會(huì)使受體細(xì)菌中誘導(dǎo)產(chǎn)生出一種短暫的感受態(tài)。在此期間它們能夠攝取各種不同來(lái)源的DNA,如入噬菌體DNA或質(zhì)粒DNA等。目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，就可以隨著受體細(xì)胞的繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌的繁殖速度非常快，在很短的時(shí)間內(nèi)就能夠獲得大量的目的基因。一些載體（如PUC系列質(zhì)粒）帶有34乳糖甘酶（lacZ）N端”片段的編碼區(qū)，該編碼區(qū)中含有多克隆位點(diǎn)（MCS）,可用于構(gòu)建重組子。這種載體適用于僅編碼3-半乳糖甘酶C端3片段的突變宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒(méi)有半乳糖甘酶活性，但它們

22、同時(shí)存在時(shí)，“片段與3片段可通過(guò)a-互補(bǔ)形成具有酶活性的34乳糖甘酶。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)。由“-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ+ffl菌在誘導(dǎo)劑IPTG（異丙基硫代半乳糖甘）的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落。而當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地破壞”片段的編碼，使得帶有重組質(zhì)粒的LacZ細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，稱(chēng)為藍(lán)白斑篩選。【儀器與試劑】（一）儀器及工具超凈工作臺(tái)，高速離心機(jī)，恒溫?fù)u床，恒溫水浴鍋，消毒離心管（EP管），玻璃培養(yǎng)皿，玻璃涂布器，標(biāo)記筆。（二）試劑8LB液體培養(yǎng)基：80

23、0mL去離子水中加入10g胰蛋白月東，5g酵母提取物，10gNaCl,待完全溶解后，定容至1000mL,高壓滅菌后備用。LB固體培養(yǎng)基：取已配制好的LB液體培養(yǎng)基100mL,加入1.5g瓊脂粉，攪拌至溶解，高壓滅菌后置于超凈臺(tái)冷卻后備用。X-gal:用二甲基甲酰胺溶?溶解至濃度為20mg/mL的儲(chǔ)存液，小份分裝后用錫紙包裹貯存于-20C保存?zhèn)溆?。IPTG用10mL滅菌雙蒸水溶解100mgIPTG,濾膜過(guò)濾除菌，分裝后凍存于-20C保存?！緦?shí)驗(yàn)步驟】1 .在無(wú)菌條件下取將100科撼受態(tài)細(xì)胞置于無(wú)菌的1.5mL消毒離心管（EP管）中，加入目標(biāo)基因5輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物。2 .置于冰上放置30min

24、;3 .將盛有連接產(chǎn)物的離心管置于42C恒溫水浴鍋中，熱擊90s后，冰上放置12min;4 .在上述離心管中加入500的LB液體培養(yǎng)基；5 .37C搖床以150r/min培養(yǎng)1.5h;6 .取200口涂布于含有IPTG（異丙基硫代-3-D-半乳糖昔）和X-gal的LB瓊脂平板上，用玻璃涂布器涂布均勻；7 .室溫放置10min后，倒置培養(yǎng)1216h至單菌落形成；8 .挑取白色菌落接種于盛有1mLLB液體培養(yǎng)基的1.5mLEP管中，37C搖床培養(yǎng)過(guò)夜。八、陽(yáng)性克隆鑒定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)大腸桿菌轉(zhuǎn)化陽(yáng)性克隆的鑒定，學(xué)習(xí)堿法提取質(zhì)粒DNA的方法和技術(shù)【實(shí)驗(yàn)原理】重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細(xì)胞后，還需要對(duì)轉(zhuǎn)

25、化菌落進(jìn)行篩選鑒定。利用“互補(bǔ)現(xiàn)象進(jìn)行篩選是最常用是最常用的一種鑒定方法?，F(xiàn)在使用的許多載體（如pUC系列）都帶有一個(gè)大腸桿菌DNA的短區(qū)段，其中含有3斗乳糖甘酶基因（LacZ）的調(diào)控序列和3-半乳糖昔酶“肽鏈氨基端（146個(gè)氨基酸）的編碼信息。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)，它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到3-半乳糖甘酶的氨基端，而不影響功能。這種載體適用于可編碼3-半乳糖甘酶C端部分序列（3片段）的宿主細(xì)胞。雖然宿主和質(zhì)粒編碼的片段各自都沒(méi)有酶活性，但它們可以融為一體，形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。堿法提取質(zhì)粒是基于細(xì)菌染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性特征而達(dá)到分離目的的。在p

26、H高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而細(xì)菌染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開(kāi)，復(fù)性就不會(huì)那么迅速而準(zhǔn)確，它們相互纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，細(xì)菌染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物以及細(xì)菌碎片等一起沉淀下來(lái)而被除去。【儀器與試劑】（一）儀器恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅菌鍋等。（二）試劑上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒【實(shí)

27、驗(yàn)步驟】1 .將培養(yǎng)好的12mL細(xì)菌12,000r離心15s,去上清。2 .加100LSolutionI用槍頭或振蕩器充分懸浮細(xì)菌。3 .加入200LSolution,II立即上下顛倒510次，使細(xì)菌裂解，室溫放置2min。4 .加入350LSolutionLII立即上下顛倒510次，使之充分中和，室溫放置2min。5 .12,000r離心，5min。6 .將步驟5中的上清轉(zhuǎn)移到套放于2.0mL收集管內(nèi)的UNIQ-10柱中，10,000r室溫離心15s。7 .棄收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一只收集管中，吸取500ILWashSolution至UUNIQ-10柱，10,000r室溫離

28、心30s。8 .重復(fù)步驟7。9 .棄收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一只U集管中，10,000r室溫離心30s以徹底去除WashSolution。10 .將UNIQ-10柱放入新的潔凈1.5mL離心管中，力口50LDW（或HutionBuffer）,室溫放置2min后，10,000r室溫離心1min。離心管中的溶液即為所抽提的質(zhì)粒DNA。10九、DNA測(cè)序【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆针p脫氧鏈終止法測(cè)定DNA序列的原理與方法【實(shí)驗(yàn)原理】DNA聚合酶催化的DNA鏈延伸是在3-OH末端上進(jìn)行的。由于2,3-雙脫氧三磷酸核甘酸（ddNTP）的3-位脫氧而失去游離-OH,當(dāng)它參入到DNA鏈后，3-OH末端消

29、失，使DNA鏈的延伸終止。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)此原理，將待測(cè)DNA片段插入單鏈?zhǔn)删wM13載體，并用合成的寡聚核甘酸引物與該載體上插入待測(cè)片段的上游順序退火，隨后在T7DNA聚合酶催化下進(jìn)行延伸反應(yīng)。實(shí)際操作中同時(shí)進(jìn)行，分別終止于A、G、C和T的4個(gè)反應(yīng)體系。每個(gè)反應(yīng)體系均含4種脫氧三磷酸核甘酸（dNTP）底物，其中一種dATP為32P標(biāo)記物，以便能用放射自顯影法讀序。但在這4個(gè)反應(yīng)體系中，分別加一種低濃度的ddNTP（ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP）,這樣ddNTP可隨機(jī)參入正在延伸的DNA鏈上，使鏈延伸終止。例如在“障中加ddATP,反應(yīng)結(jié)束時(shí)，管內(nèi)所有新合成的DNA鏈都是以A結(jié)尾的

30、不同長(zhǎng)度的片段，而且這些片段都帶放射性。將反應(yīng)物加在高分辨凝膠上電泳，DNA片段則因其長(zhǎng)度不同（分子量大小不同）被分離，短的走在前端，長(zhǎng)的泳動(dòng)在后面。其他3管則分別為以G,C或T結(jié)尾的不同長(zhǎng)度DNA片段。由于：即使是長(zhǎng)短相差一個(gè)核甘酸的DNA片段，亦可根據(jù)其電泳距離的差異而加以區(qū)分；A、G、C和T4種反應(yīng)體系的產(chǎn)物在電泳凝膠中相鄰排列。故而在閱讀凝膠電泳的放射自顯影圖像時(shí)，由下至上按前后順序即可將DNA的核甘酸順序讀出。常用方法有如下3種（其中分析一種測(cè)序方法：雙脫氧鏈終止法測(cè)定DNA序列）：方法1、末端終止法2、化學(xué)裂解法3、DNA測(cè)序自動(dòng)化使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶

31、作用卜進(jìn)行延伸反應(yīng)，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長(zhǎng)度僅相用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)一簇各種長(zhǎng)度的短鏈，經(jīng)過(guò)PAGE放射自顯影類(lèi)似末端終止法，所不同的是用熒光染料標(biāo)記，計(jì)算機(jī)自動(dòng)讀出。11差1個(gè)核甘酸的ssDNA,從而完成測(cè)序的方法?？芍弊xDNA順序。優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)便、迅速、應(yīng)用廣泛。不需酶促反應(yīng)，可以對(duì)寡核甘酸測(cè)序1、局負(fù)荷，1塊膠口J測(cè)16個(gè)樣品；2、機(jī)讀不需放射自顯影；3、安全不用同位系；4、間單迅速8-10h?！緦?shí)驗(yàn)步驟】1 .單鏈模板與引物退火(1)用無(wú)菌蒸儲(chǔ)水按1:5稀釋通用引物(約4.44pg/nL)。(2)取1.5mL微量離心管1只，加入下列試劑：模板DNA

32、(1.5-2ugDNA/10科)10科匕稀釋通用引物2科匕退火緩沖液2pL總體積142 .鏈延伸/終止反應(yīng)(1)稀釋T7DNA聚合酶：取2以或4科)冷的酶稀釋緩沖液至1只微量離心管中，加入0.5科(或lp)T7DNA聚合酶，用加樣器輕輕抽吸和排出而混勻，置冰浴中待用。(2)另取4只微量離心管，分別用記號(hào)筆標(biāo)明“A”G”前T”依次將A-Mix、G-Mix、C-Mix和T-Mix液各2.5科L分別加入這4只微量離心管中，置37c預(yù)溫1min以上(說(shuō)明：4種mix液各又分為short和10ng兩種，前者中ddNTP濃度較高，用于500bp的DNA片段的測(cè)序，后者用于50-1000bp片段的測(cè)序。一般

33、應(yīng)用short即可)。(3)標(biāo)記反應(yīng)：在操作(1)的微量離心管中加入下列試劑：模板/引物14科(已有)；標(biāo)記用混合物(1abellingmix)3&1已標(biāo)記混合物(1abelledmix)1從1T7DNA聚合酶稀釋液2晨?？傮w積201。輕輕混勻，簡(jiǎn)短離心，置室溫5min,立即接下步反應(yīng)。(4)從標(biāo)記反應(yīng)”混合物中，分別取4.5加于4只預(yù)溫的反應(yīng)液中(注意：每一次轉(zhuǎn)移均應(yīng)換用新的吸頭)，輕輕混勻。簡(jiǎn)短離心，37c保溫5min。(5)向每只離心管中加入5反應(yīng)終止液，混勻，簡(jiǎn)短離心。(6)變性反應(yīng)：在電泳前進(jìn)行。在上述鏈延伸反應(yīng)終止后，最好即時(shí)進(jìn)行變性反應(yīng)并電泳，如不能及時(shí)電泳，終止反應(yīng)后樣品可儲(chǔ)于冰浴或4C。另取4只微量離心管，標(biāo)好“A7G”(口”或從上述每一鏈延長(zhǎng)/終止反應(yīng)的試管中取3dl分別加入4只