Bac-to-bac中文說(shuō)明書

1、Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)試劑盒內(nèi)容物：Introduction：Overview：Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)提供快速有效的方法產(chǎn)生重組桿狀病毒。此方法基于讓已經(jīng)轉(zhuǎn)入桿狀病的質(zhì)粒（桿粒）的位點(diǎn)特意轉(zhuǎn)座子的表達(dá)框的質(zhì)粒在Ecoli中擴(kuò)增。Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)主要包括：*pFastBac捐獻(xiàn)質(zhì)粒的選擇，它要能夠產(chǎn)生包含目的位點(diǎn)的表達(dá)結(jié)構(gòu)，這個(gè)目的基因的產(chǎn)生被桿狀病毒特意位點(diǎn)啟動(dòng)子控制。*一個(gè)Ecoli宿主，DH10Bac，包含桿狀病毒質(zhì)粒（桿粒）和輔助質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染pFastBac 表達(dá)結(jié)構(gòu)后可以產(chǎn)生重組桿粒。*一個(gè)控制表達(dá)的質(zhì)粒，包括Gus和/或CAT基因，以便

2、在感染細(xì)胞后產(chǎn)生重組桿狀病毒，表達(dá)-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)：使用這個(gè)系統(tǒng)產(chǎn)生重組桿狀病毒較傳統(tǒng)的同源重組有以下優(yōu)點(diǎn)：*與使用同源重組產(chǎn)生重組桿狀病毒所需的4-6周相比，鑒別純化重組病毒少于兩周*減少了從斑點(diǎn)篩選重組病毒DNA所包含親緣和非重組病毒的幾率*可以快速同時(shí)進(jìn)行大量重組，適合表達(dá)功能性研究的蛋白選擇pFastBac菌體（Vector）：大量的pFastBac菌體都適于進(jìn)行Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)。選擇對(duì)于你的需要最合適的菌體。Vector特點(diǎn)參考pFastBacTM1高水平表達(dá)的強(qiáng)AcMNPV聚乙烯（PH）啟動(dòng)子用于簡(jiǎn)單克隆的大量克隆

3、位點(diǎn)Anderon 1996pFastBacTMHT高水平表達(dá)的聚乙烯啟動(dòng)子；N-末端含有6XHis，可以用來(lái)純化重組蛋白，并可用TEV蛋白酶切去；提供3個(gè)閱讀框Polayes 1996pFastBacTMDual兩個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子（PH和p10）可以同時(shí)表達(dá)兩種蛋白；兩個(gè)大的克隆位點(diǎn)Harris和Polaye 1997指南用途：指南提供了一個(gè)對(duì)于Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)的概述，并對(duì)以下提供指導(dǎo)：1、 克隆目的基因到pFastBacTM供體質(zhì)粒的選擇2、 轉(zhuǎn)化pFastBacTM 結(jié)構(gòu)到最高效的DH10BacTM產(chǎn)生重組質(zhì)粒3、 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒DNA到昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生重組桿狀病毒4、 擴(kuò)增滴定（Amp

4、lify and titer）桿狀病毒株，使用病毒株感染昆蟲細(xì)胞表達(dá)目的重組蛋白重要的：Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是用來(lái)幫助你產(chǎn)生重組桿狀病毒，在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行高水平表達(dá)目的基因的系統(tǒng)。雖然他可以幫助你很容易的產(chǎn)生桿狀病毒表達(dá)你的重組蛋白，但是使用這系統(tǒng)更傾向于有桿狀病毒生物學(xué)和昆蟲表達(dá)背景的使用者。我們高度推薦使用者具有病毒和組織培養(yǎng)的技術(shù)和知識(shí)。Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)的成分：表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)單高效的產(chǎn)生重組桿狀不能給黨?；贚uckow1993年的方法，此系統(tǒng)利用了位點(diǎn)特意的專座子Tn7區(qū)簡(jiǎn)化和提高重組質(zhì)粒DNA*系統(tǒng)的第一個(gè)成分是用來(lái)克隆目的基因的pFastBacTM菌

5、株?；趐FastBacTM菌株的選擇，表達(dá)基因被AcMNPV的PH或p10啟動(dòng)子控制，在昆蟲細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)表達(dá)框被Tn7 的左右臂包圍，并且包含一個(gè)慶大霉素抗性點(diǎn)和SV40多腺苷酸化信號(hào)，形成一個(gè)微型的Tn7 *第二個(gè)主要結(jié)構(gòu)是Ecoli的DH10BacTM品系，用來(lái)作為pFastBacTM菌株的宿主。DH10BacTM細(xì)胞包含帶有微型-attTn7靶位點(diǎn)的病毒質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒（詳細(xì)見(jiàn)下文）。一旦pFastBacTM表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH10Bac細(xì)胞，轉(zhuǎn)化就會(huì)發(fā)生在pFastBacTM菌株的微型Tn7單位和微型-attTn7的靶位點(diǎn)之間產(chǎn)生重組質(zhì)粒。這個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)發(fā)生在輔助質(zhì)粒提供的轉(zhuǎn)化蛋白處。如

6、果你已經(jīng)完成了轉(zhuǎn)化反應(yīng)，你需要分離這個(gè)高分子量的重組質(zhì)粒DNA并將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染如昆蟲細(xì)胞趨產(chǎn)生重組桿狀病毒，用來(lái)進(jìn)行初步表達(dá)實(shí)驗(yàn)。在桿狀病毒株擴(kuò)增和滴定后，高效價(jià)的病毒株可以用來(lái)感染細(xì)胞，進(jìn)行大規(guī)模的重組蛋白的表達(dá)。桿狀病毒菌株：病毒菌株（桿粒），bMON14272(136KB)，在DH10Bac Ecoli中包括：*一個(gè)低拷貝的 微型F復(fù)制子*卡那霉素的抗性標(biāo)記*一個(gè)來(lái)自于pUC載體的編碼LacZa肽的DNA片段，用來(lái)接觸病毒轉(zhuǎn)座子，Tn7（微型attTn7）已經(jīng)被插入。插入的微型attTn7不會(huì)中斷LacZa肽的閱讀框。桿粒在具有卡那抗性的大的質(zhì)粒Ecoli DH10Bac中擴(kuò)增，在顯色

7、物質(zhì)如Bluo-gal 或X-gal和誘導(dǎo)劑IPTG存在時(shí)，能補(bǔ)充染色體LacZ的缺失形成藍(lán)斑（LacZ+）輔助質(zhì)粒：DH10Bac Ecoli也包含輔助質(zhì)粒，pMON7124(13.2kb)，他編碼轉(zhuǎn)移酶和四環(huán)素抗性基因。這個(gè)輔助質(zhì)粒提供Tn7 轉(zhuǎn)化功能。圖示Bac-toBac系統(tǒng)：下圖刻畫了重組病毒的產(chǎn)生和目的基因的表達(dá)實(shí)驗(yàn)輪廓：流程：下圖揭示了表達(dá)目的基因的一般步驟1、 pFastBac donor 質(zhì)粒（步驟：目的基因的克隆 ） 得到2、 pFastBac重組體 （轉(zhuǎn)化至DN10Bac細(xì)胞（含有桿粒和helper） 得到3、 含有重組桿粒的Ecoli細(xì)胞 （重新劃線） 得到4、 驗(yàn)證過(guò)

8、的含有重組桿粒的Ecoli細(xì)胞 （過(guò)夜培養(yǎng)，分離重組桿粒DNA） 得到5、 重組桿粒DNA （使用Cellfectin試劑感染細(xì)胞） 得到6、 P1 重組桿狀病毒株（106pfu/ml） （感染昆蟲細(xì)胞擴(kuò)增病毒） 得到7、 P2 重組桿狀病毒株（107pfu/ml） （滴定感染昆蟲細(xì)胞） 得到8、 蛋白的表達(dá)培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞：一般指導(dǎo)：介紹：對(duì)于您的桿狀病毒轉(zhuǎn)移菌，我們推薦使用Sf9和Sf21昆蟲細(xì)胞作為宿主。在開(kāi)始你的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和表達(dá)之前，確定你有收獲的Sf9和Sf21，并將其凍存。使用無(wú)血清的介質(zhì)：昆蟲細(xì)胞可能在無(wú)血清的條件下收獲。我們推薦使用Sf900 SFM。Sf900 SFM對(duì)于維持Sf9

9、 和Sf21以及對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白，都是無(wú)蛋白的最優(yōu)的介質(zhì)。昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)參考指導(dǎo)：維持和傳代昆蟲細(xì)胞在貼壁和懸浮條件下 冷凍細(xì)胞 使用無(wú)血清的介質(zhì) 按比例增加細(xì)胞產(chǎn)量一般指導(dǎo)：昆蟲細(xì)胞對(duì)于環(huán)境很敏感，此外化學(xué)和營(yíng)養(yǎng)因素，物理因素都可以影響昆蟲細(xì)胞的成長(zhǎng)。需要優(yōu)化以得到最大產(chǎn)量?？紤]以下培養(yǎng)條件：*溫度：細(xì)胞的感染和成長(zhǎng)的最適合范圍是27-28度*PH：對(duì)于許多培養(yǎng)系統(tǒng)6.1-6.4時(shí)合適的范圍。Sf900 SFM在此范圍內(nèi)支持一般的空氣和開(kāi)蓋培養(yǎng)*同滲重摩：鱗翅類細(xì)胞使用介質(zhì)的最優(yōu)同滲重摩是345-380 mOsm/kg*通風(fēng)：對(duì)于最優(yōu)生長(zhǎng)條件和蛋白的表達(dá)，昆蟲細(xì)胞要求被動(dòng)的通氧。積極的通

10、氧系統(tǒng)要求溶氧飽和在10%-50%*剪切力：懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生機(jī)械剪切力。生長(zhǎng)的昆蟲細(xì)胞在含有血清的介質(zhì)中（10%-20% FBS），對(duì)于細(xì)胞的剪切力一般會(huì)得到足夠的保護(hù)。如果你的細(xì)胞在無(wú)血清條件下生長(zhǎng)，加入剪切力保護(hù)劑例如PluronicF-68。注意：在Sf900 SFM中生長(zhǎng)的細(xì)胞不需要加入剪切力保護(hù)劑。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞：你需要的是對(duì)數(shù)期的細(xì)胞95%發(fā)育能力，可以完成成功的轉(zhuǎn)染。產(chǎn)生重組的pFastBacTM菌株（Vector）一般信息：介紹：為了產(chǎn)生包含目的基因的重組質(zhì)粒，使用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，你需要使用限制酶消化和連接，將你的目的基因克隆進(jìn)入pFastBac 菌的其中一種。一

11、般分子生物學(xué)技術(shù)：為了幫助限制酶消化和連接DNA的序列，需要其他一般的分子生物學(xué)技術(shù)擴(kuò)增和保存質(zhì)粒：pFastBac菌種和他的相應(yīng)的表達(dá)對(duì)照質(zhì)粒包含氨芐青霉素抗性基因，可以使用Ecoli進(jìn)行Amp篩選。為了擴(kuò)增和保存pFastBac和pFastBac對(duì)照質(zhì)粒，使用以下方法：1、 使用載體株系感染一個(gè)recA ,endA Ecoli株，例如Top10，DH10B或者DH52、 在含有100ug/ml Amp的LB瓊脂糖平板選擇轉(zhuǎn)化株。3、 選擇含有質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子制備甘油菌以便長(zhǎng)期保存克隆進(jìn)入pFastBacTM1介紹：為了幫助你設(shè)計(jì)策略克隆你的目的基因進(jìn)入pFastBacTM1，參考以下建議和表格

12、克隆考慮事項(xiàng)：pFastBacTM1菌株是非融合菌株（無(wú)融合標(biāo)簽）。為了保證重組蛋白的表達(dá)，你的插入必須含有：*一個(gè)ATG起始密碼子用于轉(zhuǎn)錄起始*一個(gè)終止密碼子。注意：終止密碼子包含在所有三個(gè)閱讀框中的多克隆位點(diǎn)中注意：重組蛋白的產(chǎn)生要求你的插入包含一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始ATG。一般來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)移載體包含完整的PH引導(dǎo)序列，可以提高表達(dá)的產(chǎn)量。蛋白翻譯能夠起始于多克隆位點(diǎn)上游突變的ATG（ATT），盡管如此，從這個(gè)位點(diǎn)起始的效率是低的，而且一般不干涉表達(dá)和重組蛋白的檢測(cè)。pFastBacTM1的多克隆位點(diǎn)：下圖是pFastBacTM1的多克隆位點(diǎn)。限制位點(diǎn)標(biāo)出來(lái)以便顯示實(shí)際切刻位點(diǎn)。潛在的終止密碼子下劃線表

13、示。pFastBacTM1的全序列可以從網(wǎng)站下載。pFastBacTM1的圖譜和描述見(jiàn)后綴克隆進(jìn)入pFastBacTMHT A，B，C 介紹：pFastBacTMHT載體由三個(gè)讀碼框（A，B，C）提供的多克隆位點(diǎn)從而實(shí)現(xiàn)克隆目的基因，并且在N端帶有6XHis?？寺。簆FastBacTMHT菌株是融合菌株。為了保證表達(dá)重組蛋白，你必須：*克隆你的基因要帶有ATG，位于4050-4052堿基對(duì)間。這個(gè)將會(huì)產(chǎn)生融合表達(dá)，帶有6XHis標(biāo)簽，可以用TEV切除*你的插入要含有終止密碼注意：重組蛋白的產(chǎn)生要求你的插入包含一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始ATG。一般來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)移載體包含完整的PH引導(dǎo)序列，可以提高表達(dá)的產(chǎn)量。蛋白

14、翻譯能夠起始于多克隆位點(diǎn)上游突變的ATG（ATT），盡管如此，從這個(gè)位點(diǎn)起始的效率是低的，而且一般不干涉表達(dá)和重組蛋白的檢測(cè)pFastBacTMHT A的多克隆位點(diǎn)：下圖是pFastBacTMHT A的多克隆位點(diǎn)。其實(shí)ATG用黑體標(biāo)出。限制性位點(diǎn)標(biāo)出來(lái)以便顯示實(shí)際切刻位點(diǎn)。pFastBacTMHT B的多克隆位點(diǎn)：下圖是pFastBacTMHT A的多克隆位點(diǎn)。其實(shí)ATG用黑體標(biāo)出。限制性位點(diǎn)標(biāo)出來(lái)以便顯示實(shí)際切刻位點(diǎn)?？蜃〉暮塑账犸@示出的是易變區(qū)域。pFastBacTMHT C的多克隆位點(diǎn)：下圖是pFastBacTMHT A的多克隆位點(diǎn)。其實(shí)ATG用黑體標(biāo)出。限制性位點(diǎn)標(biāo)出來(lái)以便顯示實(shí)際切刻

15、位點(diǎn)?？蜃〉暮塑账犸@示出的是易變區(qū)域。注意pFastBacTMHT C在Xba 位點(diǎn)內(nèi)有一個(gè)終止密碼子，他在N端標(biāo)簽框內(nèi)。確定你的基因的5端是在Xba 位點(diǎn)上游開(kāi)始?？寺∵M(jìn)入pFastBacTMDual介紹：pFastBacTMDual包含兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，可以同時(shí)表達(dá)兩個(gè)異源基因，一個(gè)通過(guò)PH啟動(dòng)子控制，另一個(gè)通過(guò)P10啟動(dòng)子控制。參見(jiàn)下列建議以便有助于你的基因克隆克隆事項(xiàng)：pFastBacTMDual是一個(gè)非融合載體。為了保證重組蛋白的表達(dá)，你的插入必須含有以下兩點(diǎn)*一個(gè)ATG起始密碼子*如果你不使用多克隆位點(diǎn)中的終止密碼子，就必須要有一個(gè)終止密碼子注意：重組蛋白的產(chǎn)生要求你的插入包含一個(gè)轉(zhuǎn)

16、錄起始ATG。一般來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)移載體包含完整的PH引導(dǎo)序列，可以提高表達(dá)的產(chǎn)量。對(duì)于插入克隆上游的聚乙烯啟動(dòng)子，注意到蛋白翻譯能夠起始于多克隆位點(diǎn)上游突變的ATG（ATT），盡管如此，從這個(gè)位點(diǎn)起始的效率是低的，而且一般不干涉表達(dá)和重組蛋白的檢測(cè)。PH啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)：下圖是pFastBacTMDual中PH啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)的圖示。限制性位點(diǎn)標(biāo)記出來(lái)顯示了實(shí)際的切刻位點(diǎn)。潛在的終止密碼子有下劃線標(biāo)出。P10啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)：下圖是pFastBacTMDual的AcMNPV p10啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)。限制性位點(diǎn)標(biāo)記出來(lái)以便顯示實(shí)際切刻位點(diǎn)。潛在的終止密碼子標(biāo)記下劃線。轉(zhuǎn)化和分析

17、介紹：如果你已經(jīng)完成了你的連接反應(yīng)，你就要準(zhǔn)備把你的pFastBacTM結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化進(jìn)Ecoli了。很多Ecoli宿主菌和轉(zhuǎn)化程序都是可以使用的。一般推薦轉(zhuǎn)化Ecoli和分析轉(zhuǎn)化在下面列出Ecoli宿主：一旦你把你的插入序列克隆進(jìn)入了pFastBacTM，你需要轉(zhuǎn)化連接反應(yīng)到Ecoli，并選擇優(yōu)Amp抗性的轉(zhuǎn)化株。你可以使用任何recA，end A Ecoli菌。包括Top10，DH10B或者DH5進(jìn)行轉(zhuǎn)化。不要轉(zhuǎn)化連接反應(yīng)進(jìn)入DH10Bac細(xì)胞。注意TOP10和DH10B感受態(tài)細(xì)胞可以從Invitrogen得到轉(zhuǎn)化方法：你可以選擇使用任何方法對(duì)Ecoli進(jìn)行轉(zhuǎn)化。化學(xué)轉(zhuǎn)化是最便利的方法，而電轉(zhuǎn)對(duì)

18、大質(zhì)粒是最有效的方法。選擇好轉(zhuǎn)化株，使用含有100ug/ml Amp 的LB平板。轉(zhuǎn)化株分析：一旦你得到Amp抗性轉(zhuǎn)化株，我們有以下推薦：1、 選出10個(gè)轉(zhuǎn)化株，在含有100ug/ml的Amp的LB或S.O.B培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)2、 使用你選的方法分離質(zhì)粒DNA。我們推薦使用公司的試劑盒3、 使用限制性方法分析質(zhì)粒，證明是重組質(zhì)粒并證明插入起始的正確。使用限制性酶或者酶化合物對(duì)Vector和插入端各進(jìn)行一次酶切。使用PCR對(duì)轉(zhuǎn)化株進(jìn)行分析：你也可以使用PCR方法對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株進(jìn)行分析。使用合適的PCR引物和Amp條件。如果你是第一次使用此方法，你最好使用限制性分析作平行試驗(yàn)。使用錯(cuò)誤的引物或污染的平

19、板可能會(huì)得到假象。以下方法可以給你提供便利。其他方法也是可用的。需要的材料：高保真PCRSuperMix，合時(shí)的PCR前后引物過(guò)程：1、對(duì)于每個(gè)樣品，在0.5ml的小離心管加入48ul的高保真PCR SuperMix和各1ul的前后引物。 2、選出10個(gè)克隆，在上述離心管中進(jìn)行重懸（記得做一個(gè)Patch板保護(hù)克隆以便進(jìn)行更深的分析） 3、94度10分鐘溶解細(xì)胞滅活核酸酶 4、20-30個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增 5、延伸使用72度10分鐘。4度儲(chǔ)存 6、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)測(cè)序：對(duì)于你的結(jié)構(gòu)需要進(jìn)行測(cè)序證明目的基因是正確的起始以便表達(dá)。如果你是將基因克隆進(jìn)入了pFastBacTMHT，證明的基因進(jìn)入了N末端

20、標(biāo)簽的讀框中。長(zhǎng)期保存：一旦你證明了測(cè)序的正確，確定克隆的純度并制作甘油菌長(zhǎng)期保存。推薦儲(chǔ)存質(zhì)粒DNA在-20度1、 在含有100ug/ml的LB平板上對(duì)原始的克隆進(jìn)行劃線培養(yǎng)2、 挑單克隆在1-2ml含有Amp的LB撫育3、 培養(yǎng)至穩(wěn)定期4、 在0.85ml的培養(yǎng)物中混合0.15ml的過(guò)濾甘油，轉(zhuǎn)到冷凍小管5、 -80度儲(chǔ)存重組質(zhì)粒的產(chǎn)生轉(zhuǎn)化到DH10Bac Ecoli介紹：一旦你有了你的pFastBacTM結(jié)構(gòu)，你就可以準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化純化的質(zhì)粒DNA進(jìn)入DH10BacTMEcoli，轉(zhuǎn)變成為桿粒。你可以使用藍(lán)/白斑選出含有重組桿粒的克隆。Bac-toBac表達(dá)系統(tǒng)提供高效DH10BacTM感受態(tài)

21、細(xì)胞。陽(yáng)性對(duì)照：每個(gè)pFastBacTM質(zhì)粒都提供相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照用來(lái)作為陽(yáng)性轉(zhuǎn)染和表達(dá)對(duì)照（下表）。根據(jù)pFastBacTMVecctor的使用，我們推薦在你的DH10Bac轉(zhuǎn)染試驗(yàn)中作相應(yīng)的對(duì)照。所需材料：開(kāi)始之前你需要有以下材料 *純化的pFastBacTM結(jié)構(gòu)（200pg/ul儲(chǔ)存于PH8.0的TE） *陽(yáng)性表達(dá)對(duì)照 *高效DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞（表達(dá)系統(tǒng)提供，每個(gè)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)使用1管細(xì)胞） *pUC19（與DH10Bac一起提供，用來(lái)做對(duì)照） *LB平板，包含Kan，Gen（慶大），Tetracycline（四環(huán)素），Bluo-gal（鹵代吲哚基-beta-D-半乳糖苷）和IPTG。

22、 （每個(gè)轉(zhuǎn)化3個(gè)板，使用新鮮平板，推薦見(jiàn)下文） *LB板含有100ug/mlAmp（用于pUC19轉(zhuǎn)化對(duì)照） *S.O.C介質(zhì) *15ml圓底塑料管 *42度水域和37度搖床及37度培養(yǎng)箱。你需要準(zhǔn)備LB瓊脂糖平板，包含50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline，100ug/ml Biuo-gal，40ug/ml IPTG，用來(lái)進(jìn)行DH10BacTM轉(zhuǎn)化株的篩選?？梢詮奈夜绢A(yù)訂抗生素，Bbluo-gal，IPTG，在后面有制備平板的指導(dǎo)。如果你正準(zhǔn)備的LB平板使用的是事先混合好的，我們推薦使用Luria Broth Base代替LB。

23、使用LB板將會(huì)降低顏色敏感度，并可能降低克隆的數(shù)量。注意：在藍(lán)/白斑篩選中使用Bluo-gal代替X-Gal。Bluo-gal產(chǎn)生的藍(lán)斑顏色要比X-Gal深。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化：對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)化，你都需要一小瓶感受態(tài)細(xì)胞和三個(gè)平板。 *42度水域平衡 *37度烘板30分鐘 *室溫放置SOC介質(zhì) *對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)預(yù)冷一個(gè)15ml管子轉(zhuǎn)化過(guò)程：按照以下過(guò)程用高效DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化pFastBacTM結(jié)構(gòu)。我們推薦做陽(yáng)性對(duì)照的轉(zhuǎn)化來(lái)幫助你證明你的結(jié)果。1、 整管高效DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞冰上解凍。2、 每個(gè)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，輕輕地混合，將100ul高效DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞倒入預(yù)冷的15ml管

24、子3、 向細(xì)胞中加入適量的質(zhì)粒DNA，輕輕混合。千萬(wàn)不要上下吹吸混合*pFastBacTM結(jié)構(gòu)：1ng(5ul)*pFastBacTM對(duì)照質(zhì)粒：1ng*pUC19對(duì)照：50pg（5ul）4、 冰上撫育30分鐘5、 42度熱激45秒6、 立即冰上2分鐘7、 加入900ul室溫的SOC培養(yǎng)基8、 pFastBacTM轉(zhuǎn)化：37度225轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)4小時(shí)。 pUC19轉(zhuǎn)化：37度225轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)1小時(shí)9、 對(duì)于每個(gè)pFastBacTM的轉(zhuǎn)化：準(zhǔn)備10折連續(xù)（不知道什么意思）用SOC稀釋的細(xì)胞（10-1，10-2，10-3），每個(gè)稀釋用100ul鋪一個(gè)LB平板，平板包含50ug/ml Kan，7ug/m

25、l Gentamicin，10ug/ml tetracycline，100ug/ml Biuo-gal，40ug/ml IPTG。對(duì)于pUC19轉(zhuǎn)化：用SOC培養(yǎng)基1：100稀釋細(xì)胞，鋪100ul稀釋物在含有100ug/mlAmp的LB平板。10、37度撫育48小時(shí)。分析篩選的克隆（參見(jiàn)推薦）。注意：我們不推薦早于48小時(shí)挑單克隆，因?yàn)檫@樣可能會(huì)難于區(qū)分藍(lán)白斑。重要的：微型Tn7 插入到微型attTn7 附屬位點(diǎn)會(huì)干擾LacZa肽的表達(dá)，所以包含重組質(zhì)粒的克隆在藍(lán)色背景下是白色的，可能隱藏在未改變的質(zhì)粒中。選擇白斑分析。真正的白斑克隆比較大；因此為了避免選擇成假陽(yáng)性，選擇最大的，最獨(dú)立的白斑。

26、避免挑出現(xiàn)灰色的或者在中間的菌落，因?yàn)樗麄兛赡苁前召|(zhì)粒的細(xì)胞核重組細(xì)胞的混合。驗(yàn)證顯性：1、挑10個(gè)白色的克隆，重新劃線在新鮮LB平板（50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline，100ug/ml Biuo-gal，40ug/ml IPTG）。37度過(guò)夜培養(yǎng)。 2、在包含Bluo-Gal和IPTG的重新劃線的平板上選出單克隆證明是白色的顯性，嫁接至有50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline的液體中 3、使用我公司的試劑盒抽提重組質(zhì)粒DNA。選擇性的，你可以使用附錄提供的操作

27、步驟。這個(gè)過(guò)程源于抽提大的質(zhì)粒DNA（100kb），適用于分離質(zhì)粒DNA。 4、分析重組質(zhì)粒DNA證明成功轉(zhuǎn)化到了桿粒中。我們推薦使用PCR分析桿粒DNA。 注意：適用瓊脂糖凝膠電泳可以證明轉(zhuǎn)化的成功與否，他可以分出高分子量的DNA。這個(gè)方法要比PCR分析可信度低，因?yàn)楦叻肿恿緿NA是很難見(jiàn)到的。使用PCR分析重組質(zhì)粒介紹：重組桿粒DNA要大于135kb。既然限制性分析很難完成這么大的DNA分析，我們推薦使用PCR分析鑒定重組桿粒中的目的基因。桿粒包含M13 正負(fù)引物位點(diǎn)，位于LacZa互不區(qū)域的微型attTn7 位點(diǎn)兩側(cè)，可以完成PCR檢驗(yàn)。本節(jié)提供使用M13 引物的PCR檢驗(yàn)指導(dǎo)。使用M1

28、3引物進(jìn)行PCR分析：使用PCR法證明你的目的基因在重組桿粒中，你可能會(huì)： *使用M13Forward（-40）和M13 Reverse引物 *使用M13Forward（-40）或M13 Reverse引物于你的插入片段雜交成聯(lián)合物DNA聚合酶：你可能會(huì)使用任何DNA聚合酶在你的PCR試驗(yàn)中，包括Platinum Taq酶。如果希望PCR產(chǎn)物4kb，我們推薦使用聚合酶混合物。例如高保真的Platinum Taq酶得到PCR產(chǎn)物：使用下面過(guò)程擴(kuò)增重組桿粒DNA，適用M13正反引物和Platinum Taq酶。如果你使用M13F或M13 R與一個(gè)你的基因特意引物混合，你需要自己決定擴(kuò)增的條件。如果

29、你使用其它的聚合酶，依照供應(yīng)商提供的建議。注意：如果你的插入片段4kb擴(kuò)增條件需要被優(yōu)化.1、 每個(gè)樣品，在0.5ml微型管子中裝入50ul的量進(jìn)行PCR反映重組桿粒DNA（100ng） 1ul10XPCR Buffer 5ul 10mM dNTP Mix 5ul50mM MgCl2 1.5ulPCR引物（1.25ul/10uM） 2.5ul蒸餾水 38.5總體積 50ul2、 一滴礦物油覆蓋3、 一下參量進(jìn)行擴(kuò)增4、 從反應(yīng)產(chǎn)物吸取5-10ul進(jìn)行瓊脂糖電泳分析你將會(huì)看到：如果轉(zhuǎn)化發(fā)生了，而且你使用的是M13正負(fù)引物擴(kuò)增，你將會(huì)在電泳上看到下列PCR產(chǎn)物大小如果你使用的是M13 和你的特異引

30、物進(jìn)行的擴(kuò)增，你需要決定PCR產(chǎn)物是否是希望的。12頁(yè)的圖有助于你計(jì)算。重組桿狀病毒的產(chǎn)生轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞：介紹：一旦你證明了你的重組桿粒含有你的目的基因，就可以準(zhǔn)備進(jìn)行昆蟲細(xì)胞的轉(zhuǎn)染了，以產(chǎn)生重組桿狀病毒。本章提供指導(dǎo)和建議以便完成昆蟲細(xì)胞的轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備質(zhì)粒：你可以使用任何方法準(zhǔn)備純化的重組桿粒DNA。桿粒DNA必須沒(méi)有酚和NaCl的污染，他們會(huì)殺死細(xì)胞，鹽類會(huì)干擾脂類復(fù)合物，降低轉(zhuǎn)染效率。我們推薦使用本公司產(chǎn)品提質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染方法：推薦使用一個(gè)陽(yáng)離子脂質(zhì)體，例如Cellfectin試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。此試劑用來(lái)提供給表達(dá)系統(tǒng)使用。Cellfectin試劑：不做翻譯昆蟲細(xì)胞系：推薦使用Sf9 和Sf21進(jìn)行轉(zhuǎn)

31、染。High Five and Mimic Sf9不推薦因?yàn)樗麄冝D(zhuǎn)染效率低下。不過(guò)，如果你有了你的桿狀病毒株，你可以進(jìn)行High Five and Mimic Sf9表達(dá)試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染介質(zhì)：為了高效的轉(zhuǎn)染，我們推薦在無(wú)Grace的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中完成轉(zhuǎn)染。注意Grace的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)該不含有FBS（血糖），因?yàn)榈鞍自谘呛推溲a(bǔ)充物中會(huì)與Cellfectin試劑互作，影響轉(zhuǎn)染。 注意：如果你在Sf-900 SFM中收獲了Sf9或Sf21，你可以在不含有Grace的培養(yǎng)基中完成轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后可以容易的將Sf-900 SFM轉(zhuǎn)變回去陽(yáng)性對(duì)照：如果你有了從pFastBac對(duì)照質(zhì)粒中得到的重組桿粒，我們推

32、薦，包括這個(gè)陽(yáng)性對(duì)照在你的試驗(yàn)中和轉(zhuǎn)化中能夠評(píng)估你的結(jié)果。在這些桿粒中，包括-葡糖甘酶（Gus）和/或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）將會(huì)在PH或者P10啟動(dòng)子控制下表達(dá)。在轉(zhuǎn)染過(guò)后，表達(dá)的Gus和CAT可以適當(dāng)進(jìn)行驗(yàn)證。所需材料：開(kāi)始之前需要有下列材料： *從pFastBacTM結(jié)構(gòu)（500ng/ul TE溶解，PH8.0）中純化的重組桿粒DNA *從合適的pFastBacTM對(duì)照結(jié)構(gòu)中純化的重組桿粒DNA *合適培養(yǎng)基收獲的Sf9或者Sf21 *Cellfectin試劑（4度保存） *Graces昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，未被補(bǔ)充的（培養(yǎng)基不含有補(bǔ)充劑，F(xiàn)BS或者抗生素） *6孔培養(yǎng)板或者其它組織 培養(yǎng)用

33、具 *12X75mm滅菌管 *培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的完全培養(yǎng)基計(jì)算出你的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)所需的Sf9 細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)行擴(kuò)增。轉(zhuǎn)染前確定細(xì)胞健康且繁殖能力97%。轉(zhuǎn)染條件：我們通常使用下列條件在Sf9中擴(kuò)增桿狀病毒株。對(duì)于你的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)這些條件應(yīng)該作為一個(gè)起始點(diǎn)，你可以通過(guò)改變DNA和Cellfectin試劑的濃度以及細(xì)胞密度對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化。 轉(zhuǎn)染步驟：適用下列步驟在6孔板進(jìn)行Sf9 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。如果你想在其它細(xì)胞培養(yǎng)用具中轉(zhuǎn)染細(xì)胞，你需要對(duì)你的條件進(jìn)行優(yōu)化。記得使用無(wú)補(bǔ)充的Graces培養(yǎng)基，他不含有FBS或抗生素1、 在6孔板或35mm組織培養(yǎng)板，與每個(gè)孔2ml含有抗生素的培養(yǎng)基中（例如：2ml的SF900SF

34、M包含50單位/ml青霉素和50ug/ml鏈霉素）接種9X105Sf9細(xì)胞。2、 27度細(xì)胞最少接觸1小時(shí)3、 對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)染的樣品，準(zhǔn)備桿粒DNA：Cellfectin試劑混合在12X75mm的滅菌管中1） 將1ug純化的桿粒DNA稀釋進(jìn)入100ul未補(bǔ)充Grace培養(yǎng)基2） 完全混勻Cellfectin試劑，翻轉(zhuǎn)混合5-10次。吸出6ulCellfectin試劑稀釋進(jìn)100ul未補(bǔ)充Grace培養(yǎng)基。3） 使用稀釋的Cellfectin試劑連接稀釋的桿粒DNA（總體積約210ul）。輕混合，室溫?fù)嵊?5-45分鐘。4、 在DNA/脂肪混合體撫育過(guò)程中，從細(xì)胞中除去培養(yǎng)基并用2ml未補(bǔ)充Gra

35、ce培養(yǎng)基清洗。棄去清洗培養(yǎng)基。5、 向每個(gè)含有混合體的管子中加入0.8ml未補(bǔ)充Grace培養(yǎng)基，清混勻，將混合體加入到含有細(xì)胞的孔中。6、 27度培養(yǎng)5小時(shí)7、 棄去DNA/脂肪混合體，向細(xì)胞中加入2ml全培養(yǎng)基（例如SF900SFM含有抗生素）8、 27度潮濕條件撫育72小時(shí)或者指導(dǎo)你開(kāi)始能夠看到病毒感染的現(xiàn)象。提取P1病毒株。分離P1病毒株介紹：帶有芽孢的病毒應(yīng)該在轉(zhuǎn)染以后釋放入培養(yǎng)基72小時(shí)。但是，如果你的轉(zhuǎn)染效率不好，細(xì)胞可能在轉(zhuǎn)染后的4-5天也沒(méi)有被病毒感染的跡象。轉(zhuǎn)染過(guò)后的72小時(shí)，你需要親自檢查細(xì)胞是否有感染信號(hào)（下表）一旦細(xì)胞出現(xiàn)感染，使用下列步驟從培養(yǎng)基中收獲細(xì)胞。感染細(xì)

36、胞的特性：使用倒差顯微鏡在250-400X觀察感染細(xì)胞時(shí)，可以看到病毒感染的細(xì)胞具有以下特點(diǎn)：感染記號(hào)顯性描述早期（第一個(gè)24小時(shí)）細(xì)胞直徑增加可以看到直徑增大了25-50% 細(xì)胞核增大細(xì)胞核可能充滿細(xì)胞晚期（24-72小時(shí)）細(xì)胞停止增長(zhǎng)與單個(gè)細(xì)胞相比，細(xì)胞不再增大出現(xiàn)顆粒體病毒芽孢信號(hào)，出現(xiàn)小泡分離細(xì)胞從平板或曲頸瓶脫離很晚期（大于72小時(shí)）細(xì)胞消亡細(xì)胞出現(xiàn)消亡，單層細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)消亡制備P1病毒株：1、一旦從第8步得到轉(zhuǎn)染細(xì)胞，上述的晚期轉(zhuǎn)染現(xiàn)象出現(xiàn)，就可以從每個(gè)孔中收集含有病毒的細(xì)胞，并轉(zhuǎn)入滅過(guò)菌的15ml帶蓋管子。500Xg離心5分鐘除去細(xì)胞和大的碎片 2、將上清轉(zhuǎn)到新的15ml離心管。

37、這就是P1病毒株。4度避光儲(chǔ)存。儲(chǔ)存信息見(jiàn)下頁(yè) 注意：如果你希望濃縮的病毒株，你可以在離心后，使用0.2um低蛋白吸附的濾器完成。病毒株的儲(chǔ)存：按下列條件儲(chǔ)存：1、 避光，4度2、 如果培養(yǎng)基不含血清，加入FBS至終濃度為2%，血清可以作為蛋白酶底物。3、 對(duì)于長(zhǎng)期保存，重新擴(kuò)增后保存整株病毒于-80度4、 不要在4度時(shí)儲(chǔ)存經(jīng)常使用的病毒。重復(fù)凍融會(huì)降低病毒的滴度。下一步：得到你的純化P1桿狀病毒株之后，你可以：1、 擴(kuò)增毒株（下節(jié)詳細(xì)介紹）這個(gè)過(guò)程推薦得到最高滴度的毒株，而且在你的試驗(yàn)中優(yōu)化結(jié)果2、 決定你的毒株的滴定度（見(jiàn)病毒斑點(diǎn)試驗(yàn)）3、 如果你希望，純化你的病毒結(jié)構(gòu)4、 使用P1病毒株

38、感染Sf9進(jìn)行表達(dá)預(yù)試驗(yàn)。注意：如果你想做一個(gè)小規(guī)模的或者是預(yù)試驗(yàn)，你可以直接使用P1毒株感染Sf9進(jìn)行表達(dá)試驗(yàn)。由于毒株數(shù)量小，表達(dá)條件可能不能再生（如果滴度未知，MOI是不可知的）擴(kuò)增你的病毒株介紹：P1毒株是小規(guī)模，低滴度的毒株，你需要使用這株去感染細(xì)胞，從而產(chǎn)生高滴度的P2株。轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞得到的首株的滴度一般為1X106到1X107pfu/ml。用以下步驟擴(kuò)增得到的P2株滴度為1X107到1X108pfu/ml。本章提供P2株的制備和指導(dǎo)所需材料：SF9或Sf21；P1病毒株；合適的培養(yǎng)用具；組織培養(yǎng)試劑；27度潮濕培養(yǎng)箱重要的：擴(kuò)增P1病毒株，需要感染Sf9或者Sf21 ，使用懸浮

39、或單層培養(yǎng)。根據(jù)你的需要，你可以任何規(guī)模的擴(kuò)增，但是你因你使用的P1菌株的量受到限制。一般擴(kuò)增P1在10ml懸浮培養(yǎng)基中培養(yǎng)2X106細(xì)胞/ml或在6孔板培養(yǎng)2X106細(xì)胞/ml。計(jì)算感染所需的Sf9細(xì)胞，隨后Expand細(xì)胞。使用前確定你的細(xì)胞健康并且繁殖力大于97%多樣性感染（MOI）：為了擴(kuò)增毒株，在多樣性感染細(xì)胞的范圍是0.05-0.1。MOI就像每個(gè)細(xì)胞的病毒數(shù)量一樣需要定義。使用下列公式計(jì)算獲得特定的MOI需要多少病毒株：注意：如果你沒(méi)有滴定你的P1毒株，你需要假定滴度范圍是1X106至107pfu/ml例如：需要感染10ml細(xì)胞，2X106細(xì)胞/ml，使用MOI =0.1我們假定

40、P1 毒株的滴度是5X106pfu/ml。擴(kuò)增步驟：依照下列步驟在6孔板擴(kuò)增P1毒株1、 感染當(dāng)天，準(zhǔn)備Sf9和Sf21細(xì)胞上清和細(xì)胞板，2X106細(xì)胞/孔。接觸培養(yǎng)細(xì)胞室溫1小時(shí)2、 1小時(shí)后倒差顯微鏡檢查細(xì)胞的吸附情況3、 每孔加入合適數(shù)量的P1毒株4、 27度潮濕培養(yǎng)箱撫育細(xì)胞48小時(shí)5、 感染后48小時(shí)，從每個(gè)孔收集2ml含有病毒的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)到15ml的管子。500Xg離心5分鐘棄去細(xì)胞和碎片。注意：可以在感染晚期收獲病毒（72小時(shí)）。每個(gè)桿狀病毒的結(jié)構(gòu)決定了優(yōu)化收獲時(shí)間。過(guò)度培養(yǎng)將會(huì)由于細(xì)胞的調(diào)亡使生殖能力衰減6、 將上清轉(zhuǎn)到15ml管子。這是P2毒株。4度避光保存。長(zhǎng)期保存需要整株

41、在-80度7、 檢測(cè)你的P2毒株的滴度梯度擴(kuò)增步驟：一旦你有了高滴度的P2桿狀病毒毒株，你可以梯度增加擴(kuò)增病毒至任何體積。為了產(chǎn)生高滴度的P3，梯度擴(kuò)增的細(xì)胞量和病毒體積要適當(dāng)，遵照本章指導(dǎo)從冰凍的主毒株獲得高滴度毒株：如果你儲(chǔ)存你的毒株在-80度，我們推薦使用此株產(chǎn)生另外的高滴度毒株進(jìn)行表達(dá)試驗(yàn)。當(dāng)病毒在-80度保存時(shí)，滴度會(huì)降低。下面為指導(dǎo)和擴(kuò)增過(guò)程病毒斑點(diǎn)試驗(yàn)（Performing a Viral Plaque Assy）:介紹：我們推薦使用斑點(diǎn)試驗(yàn)進(jìn)行：決定你毒株的滴度；斑點(diǎn)純化病毒（可選）試驗(yàn)框架：決定病毒的滴度，你需要1、 在6孔板的Sf9細(xì)胞2、 準(zhǔn)備10-flod連續(xù)稀釋的病毒

42、株3、 將不同稀釋的桿狀病毒加入到Sf9 和感染細(xì)胞中1小時(shí)4、 棄去病毒覆蓋細(xì)胞層使用Plaquing培養(yǎng)基5、 撫育7-10天計(jì)算每個(gè)稀釋物中的斑點(diǎn)病毒滴度影響因素：影響滴度的因素很多：1、 目的基因的大小。滴度一般會(huì)隨著目的基因的增大而減小2、 轉(zhuǎn)染效率。為了高的轉(zhuǎn)染效率，我們推薦使用Cellfectin試劑轉(zhuǎn)染Sf9。準(zhǔn)備DNA/脂質(zhì)體混合物在非補(bǔ)充Grace昆蟲培養(yǎng)基3、 桿狀病毒株的年齡。長(zhǎng)期保存在4度或者-80度病毒的滴度都會(huì)減弱。如果你的病毒株已經(jīng)保存了6個(gè)月-1年我們推薦在使用前滴度或者重新滴度病毒4、 凍融次數(shù)。如果你儲(chǔ)存在-80度，每次凍融都會(huì)降低病毒10%的滴度5、 錯(cuò)

43、誤的儲(chǔ)存方式。為了經(jīng)常使用，病毒株應(yīng)該整株的保存在4度避光條件所需材料：實(shí)驗(yàn)前所需材料：1、 你的澄清的桿狀病毒株（使用前存在4度）2、 適當(dāng)培養(yǎng)基中的Sf9或Sf21（每個(gè)被滴度的桿狀病毒株為30ml對(duì)數(shù)期細(xì)胞，5X105細(xì)胞/ml）3、 SF900SFM或其它合適的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基4、 Sf900培養(yǎng)基（1.3X）（100ml；或其它何時(shí)的培養(yǎng)基）5、 4%瓊脂糖凝膠6、 滅菌的細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別的蒸餾水7、 100ml滅菌的玻璃瓶8、 6孔子之培養(yǎng)板（每個(gè)毒株2個(gè)板用來(lái)滴定）9、 無(wú)菌臺(tái) 10、40度和70度水域 11、微波爐（可選） 12、27度潮濕培養(yǎng)箱注意：如果你在血清補(bǔ)充培養(yǎng)基培養(yǎng)Sf9

44、 （完全TNM-FN）。你需要有以下試劑1、 Grace昆蟲培養(yǎng)基，補(bǔ)充過(guò)的2、 Grace昆蟲培養(yǎng)基（2X）3、 胎牛血清（FBS），高質(zhì)量的熱滅火的準(zhǔn)備斑點(diǎn)培養(yǎng)基（Plaquing Medium）：斑點(diǎn)培養(yǎng)基由培養(yǎng)基和瓊脂糖混合組成，對(duì)于斑點(diǎn)試驗(yàn)用來(lái)固定昆蟲細(xì)胞。在開(kāi)始下列步驟前立即準(zhǔn)備斑點(diǎn)培養(yǎng)基。如果你培養(yǎng)Sf9在SF900SFM中，那準(zhǔn)備Sf900斑點(diǎn)培養(yǎng)基。如果你培養(yǎng)是在TNM-FH，準(zhǔn)備Grace斑點(diǎn)培養(yǎng)基。注意其它培養(yǎng)基也可以使用1、 在微波爐或者70度水域20-30分鐘溶化4%的瓊脂糖凝膠，溶化之后，下列物質(zhì)放入40度水域*空的，滅菌的100ml瓶子*Sf-900培養(yǎng)基（1.3

45、X）或者Grace昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基（2X） 2、4%的瓊脂糖凝膠液化后，將膠，培養(yǎng)基和空瓶子轉(zhuǎn)到超凈臺(tái) 3、用下列方法快速制備斑點(diǎn)培養(yǎng)基： Sf900 斑點(diǎn)培養(yǎng)基：混合30ml的Sf-900培養(yǎng)基（1.3X）和10ml的4%的瓊脂糖凝膠在100ml瓶子里，輕搖。 Graces斑點(diǎn)培養(yǎng)基：20ml熱滅活的FBS加入到100ml Grace昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基（2X）的瓶子。將25ml含有血清的Grace昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基（2X）和12.5ml細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別的滅菌蒸餾水以及12.5ml溶化的瓊脂糖膠混合在100ml空瓶子，輕輕混勻4、 使用之前將斑點(diǎn)培養(yǎng)基的瓶子放回40度水域斑點(diǎn)試驗(yàn)的過(guò)程：使用以下步驟在6孔板

46、完成斑點(diǎn)試驗(yàn)以決定擬的桿狀病毒株的滴度。如果你有了桿狀病毒表達(dá)對(duì)照，我們推薦你對(duì)這個(gè)也作滴度。記得在試驗(yàn)中做一個(gè)陰性對(duì)照（無(wú)病毒） 注意：下列過(guò)程提供的量適合滴度一個(gè)病毒株（每個(gè)病毒株2個(gè)6孔板）。如果你想滴度更多，相應(yīng)的增加試劑量1、 轉(zhuǎn)染當(dāng)天，收獲Sf9 ，在Sf900 SMF中制備30ml細(xì)胞上清，5X105細(xì)胞/ml。（或其它完全培養(yǎng)基）。如果你有陰性對(duì)照，你需要另外的一個(gè)板子2、 是細(xì)胞在板底定居，蓋蓋室溫?fù)嵊?小時(shí)3、 1小時(shí)培養(yǎng)之后，相差顯微鏡觀察細(xì)胞。Sf9應(yīng)該是已經(jīng)吸附而且50%已經(jīng)融合。4、 準(zhǔn)備8個(gè)梯度稀釋（10-1到10-8）的純化病毒株，在Sf900 SMF或者未補(bǔ)充

47、的Grace培養(yǎng)基，無(wú)FBS。為了做這些，你需要在12ml管子順序稀釋0.5ml的病毒株或前面稀釋過(guò)的4.5ml培養(yǎng)基。需要完成8個(gè)管子。5、 將裝有Sf9的6孔板和稀釋過(guò)病毒的管子轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái)。標(biāo)記上板子，需要2體積（一個(gè)樣品一個(gè)復(fù)制品）按如下方法：10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8。6、 從孔中除去培養(yǎng)基，立即用1ml適合的稀釋的病毒代替。7、 室溫?fù)嵊?小時(shí)8、 撫育1小時(shí)后，從40度水域中除去細(xì)胞和培養(yǎng)基瓶。9、 從最高的稀釋到最低的稀釋（10-8至10-3）順序，從孔中除去含有病毒的培養(yǎng)基，使用2ml斑點(diǎn)培養(yǎng)基代替。盡快操作避免細(xì)胞單層干燥10、 移動(dòng)板子之前

48、使用瓊脂糖培養(yǎng)基覆蓋10-20分鐘11、 27度潮濕培養(yǎng)箱撫育7-10天之道斑點(diǎn)可見(jiàn)并可以計(jì)數(shù)。如果你想著色斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，見(jiàn)下面，計(jì)算滴度，見(jiàn)前面注意：為了改進(jìn)斑點(diǎn)的可見(jiàn)度，用中性紅染色平板。其它平板染料比如水晶藍(lán)不推薦，因?yàn)樗麄儼挠袡C(jī)溶劑能殺死宿主細(xì)胞。你可以使用下列之一：1、準(zhǔn)備瓊脂糖溶液包含有中性紅，將溶液覆蓋感染后的板子子上4天。感染后7-10天計(jì)算板子數(shù)量。2、準(zhǔn)備中性紅溶液加入到計(jì)數(shù)前1-2小時(shí)的平板（感染后7-10天）。重要的：如果你想斑點(diǎn)純化你的病毒，不要染色斑點(diǎn)使用中性紅，它可以誘導(dǎo)重組病毒的突變所需材料：開(kāi)始試驗(yàn)前你需要有下列物質(zhì)： 1、中性紅 2、細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別的蒸餾水 3

49、、Sf900 SMF或其它培養(yǎng)基（如果制備瓊脂糖溶液） 4、4%瓊脂糖凝膠（如果準(zhǔn)備瓊脂糖溶液） 5、40水域（如果制備瓊脂糖溶液）中性紅染色過(guò)程：準(zhǔn)備瓊脂糖覆蓋的中性紅（第4天使用）1、 在 Sf900 SMF（或其它全培養(yǎng)基）中制備1mg/ml的中性紅。過(guò)濾除菌。2、 40度水域中50ml的管子混合下列試劑：1mg/ml的中性紅（1.5ml）；Sf900 SMF（16.5ml）3、 微波爐溶化4%的瓊脂糖凝膠，40度水域5分鐘4、 將含有中性紅溶液的50ml管子和凝膠轉(zhuǎn)到超凈臺(tái)。加入6ml瓊脂糖凝膠到中性紅溶液5、 每個(gè)孔用1ml中性紅覆蓋。瓊脂糖凝膠凝固后，將平板放回27度潮濕培養(yǎng)箱知道

50、斑點(diǎn)可以計(jì)數(shù)。紅色單層中將會(huì)出現(xiàn)清楚地斑點(diǎn)準(zhǔn)備中性紅染色（第7-10天計(jì)數(shù)前使用）1、 準(zhǔn)備1mg/ml的中性紅加入到細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別的蒸餾水2、 每個(gè)孔加入0.5ml中性紅溶液，室溫?fù)嵊?-2小時(shí)3、 用濾紙或吸耳球輕輕除去過(guò)量的燃料，計(jì)算斑點(diǎn)。在紅的背景下，透明膠上的斑點(diǎn)會(huì)清楚可見(jiàn)計(jì)算滴度：是用下列公式計(jì)算你的毒株的滴度。注意優(yōu)化范圍是6孔板上每個(gè)孔計(jì)算3-20個(gè)斑 滴度（pfu/ml）=斑的數(shù)量X稀釋因子X(jué)（1/接種體積ml/孔）例如：我們?cè)诿靠缀?0-6病毒稀釋的孔中加入了1ml接種體積，得到了20個(gè)斑。使用公式得到滴度：滴度=20（斑）X106X（1/1ml/孔）=2X107pfu/m

51、l你將會(huì)看到：當(dāng)?shù)味葪U狀病毒株時(shí)，一般得到的滴度范圍為：P1為1X106-1X107 pfu/ml；P2為1X107-1X108 pfu/ml。注意：如果你的P1毒株滴度小于為1X106pfu/ml或P2小于1X107 pfu/ml，推薦生產(chǎn)新的毒株。斑點(diǎn)純化：你可以通過(guò)斑點(diǎn)純化從單個(gè)的病毒克隆得到毒株。使用下列步驟 所需材料：Well-Space的病毒斑點(diǎn)的平板（來(lái)自斑點(diǎn)試驗(yàn)）；活性大于95%的對(duì)數(shù)期的Sf9或Sf21；滅菌的巴斯德吸管和曲徑瓶 過(guò)程：1、培養(yǎng)Sf9或者Sf21參照斑點(diǎn)試驗(yàn)的1-3步2、 使用巴斯德管和曲徑瓶，小心的選擇一個(gè)清澈斑點(diǎn)，將瓊脂糖蓋子（含有病毒）轉(zhuǎn)到1.5ml離心

52、管，其中包含有500ul全培養(yǎng)基。使用漩渦震蕩混合均勻3、 每個(gè)孔加入100ul瓊脂糖蓋子溶液4、 27度潮濕培養(yǎng)箱撫育72小時(shí)5、 從每個(gè)孔收集含有毒株的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)到15ml滅菌管。500Xg離心5分鐘除去細(xì)胞和殘片6、 將上清轉(zhuǎn)到新鮮的15ml管子。這個(gè)是斑點(diǎn)純化的毒株7、 以后過(guò)程為擴(kuò)增桿狀病毒株表達(dá)重組蛋白介紹：一旦你有了合適滴度的pFastBac 桿狀病毒株，你可以感染昆蟲細(xì)胞進(jìn)行重組蛋白試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照：如果你有高滴度的pFastBac 桿狀病毒對(duì)照結(jié)構(gòu)，你可能希望做一個(gè)你的試驗(yàn)對(duì)照。一旦你的對(duì)照病毒感染了你的細(xì)胞，基因編碼的Gus和/或CAT將會(huì)限制表達(dá)，以便進(jìn)行簡(jiǎn)單的試驗(yàn)。表達(dá)指導(dǎo)

53、：下面提供了一個(gè)使用重組病毒感染昆蟲細(xì)胞表達(dá)目的蛋白的指導(dǎo) *細(xì)胞系：取決于你的需要和目的基因，你可以使用任何昆蟲細(xì)胞包括Sf9和Sf21或MimicTMSf9進(jìn)行表達(dá)。細(xì)胞可以進(jìn)行懸浮和貼壁培養(yǎng)。注意：你如果表達(dá)分泌蛋白，需要使用High Five細(xì)胞改進(jìn)表達(dá) *培養(yǎng)條件：一般在無(wú)血清條件下使用Sf900 SMF或表達(dá)FiveSFM培養(yǎng)細(xì)胞。依據(jù)你的需要和目的蛋白，注意可能在感染后期需要添加0.1%-0.5%的FBS或BSA以便保護(hù)重組蛋白不被水解。Protien-Based蛋白酶抑制劑一般比人工合成的蛋白酶抑制劑便宜而且高效 *感染條件：推薦在細(xì)胞處于中對(duì)數(shù)期時(shí)（密度為細(xì)胞l）感染細(xì)胞。確

54、定在感染時(shí)培養(yǎng)不受營(yíng)養(yǎng)或環(huán)境限制 *MOI：理想的MOI因細(xì)胞系間，相關(guān)感染動(dòng)力學(xué)毒株或使用的克隆不同而不同。對(duì)于蛋白表達(dá)試驗(yàn)，應(yīng)該為每個(gè)毒株，介質(zhì)，反映和細(xì)胞系建立一個(gè)劑量反映，來(lái)證明感染參量的最優(yōu)。最為試驗(yàn)的起始，感染細(xì)胞使用的MOI為1-5 *時(shí)間進(jìn)程：推薦實(shí)施一個(gè)時(shí)間進(jìn)程決定表達(dá)蛋白的表達(dá)動(dòng)力學(xué)，因?yàn)樵S多蛋白可能會(huì)在培養(yǎng)之中被細(xì)胞蛋白酶降解。注意：分泌蛋白的最大表達(dá)一般在感染30-72小時(shí)看到，非分泌表達(dá)蛋白48-96小時(shí)。最優(yōu)的表達(dá)：大量因素影響著最優(yōu)表達(dá)，包括細(xì)胞系，MOI，你的目的，基因種類等。你可以使用下列優(yōu)化的條件表達(dá)你的重組蛋白 *細(xì)胞系：一定量MOI的感染的Sf9，Sf21，HighFive或MimicTMSf9。重組蛋白表達(dá)的試驗(yàn)在不同的感染后時(shí)間（24，48，72，96小時(shí)）。選擇細(xì)胞系提供重組蛋白的最好表達(dá)條件 *MOI：不同的MOIs的感染的細(xì)胞量和蛋白試驗(yàn)。使用重組蛋白的最優(yōu)水平提供的MOI *時(shí)間進(jìn)程：固定的MOI感染的細(xì)胞和試驗(yàn)在感染后不同時(shí)間表達(dá)重組蛋白（24，48，96）選擇最優(yōu)條件分析重組蛋白表達(dá)：是用下列過(guò)程分析你的重組蛋白。下列過(guò)程使用與24孔形式的感染后24-96小時(shí)收獲的細(xì)胞進(jìn)行分析。其它程序也可以參考 1、24孔板接種Sf96X105/孔.細(xì)胞接觸至少30分鐘 2、棄去培養(yǎng)基用新鮮的培養(yǎng)基清洗一次。換上300ul新鮮培養(yǎng)基