GZUIFR-H49-1菌株的產(chǎn)酶條件優(yōu)化外文翻譯

1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)論文外文翻譯一株新的嗜熱毀絲真菌GZUIFR-H49-1的產(chǎn)角蛋白酶的條件優(yōu)化 原文來源：J.D. Liang，Y.F. Han，J.W. Zhang et al .Optimal culture conditions for keratinase production by a novel thermophilic Myceliophthora thermophila strain GZUIFR-H49-1Journal of Applied Microbiology 110, 871880. 摘要目標(biāo)：為了研究培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件對(duì)一株新的嗜熱毀絲真菌GZUIFR-H4

2、9-1產(chǎn)角蛋白酶產(chǎn)量的影響。方法和結(jié)果：有產(chǎn)角蛋白酶活性的嗜熱菌株GZUIFR-H49-1通過形態(tài)學(xué)分析和ITS1-5.8S-ITS2rDNA 引物進(jìn)行分子分析，確定其為一株嗜熱毀絲真菌。通過單因素實(shí)驗(yàn)分析得出，在培養(yǎng)基的成分檢測(cè)中，淀粉，尿素，硫代硫酸鈉，氯化鈣分別是最有效的碳源，氮源，硫源和金屬離子。通過PlackettBurman設(shè)計(jì)得出尿素和pH值是對(duì)酶活有罪顯著性影響的兩個(gè)因素。產(chǎn)酶條件通過BoxBehnken 設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化后，最終使角蛋白酶活性從最初的800U/L提高到5100U/L,得到了6.4倍的提升。結(jié)論：本研究說明，最優(yōu)化設(shè)計(jì)能夠?yàn)榕囵B(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化提供實(shí)用且非常有力

3、的工具。嗜熱毀絲真菌GZUIFR-H49-1是一株有作為角蛋白酶產(chǎn)業(yè)化菌株的能力。本研究的意義和影響：本研究鑒定了一株有潛力用來得到角蛋白產(chǎn)物的嗜熱菌株GZUIFR-H49-1。產(chǎn)角蛋白酶條件的最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)和方法為新型真菌的開發(fā)和應(yīng)用提供了思路。前言干重中含有80-90%角蛋白的羽毛(Ghosh et al. 2008)是禽類生產(chǎn)工業(yè)中的一個(gè)主要廢物。世界各地每年都會(huì)產(chǎn)生幾百萬噸的禽類羽毛(Szabo et al.2000; De Azeredo et al. 2006)。這種富含角蛋白的廢物有很大的潛力作為動(dòng)物飼料中蛋白質(zhì)和氨基酸的來源。因?yàn)轱暳系鞍讈碓吹亩倘?，禽類羽毛廢物已經(jīng)被作為一種限制性

4、蛋白質(zhì)飼料來添加到飼料中去。然而，當(dāng)前的工廠中使用物理和化學(xué)方法獲得的羽毛粉對(duì)環(huán)境不友好，還會(huì)破壞氨基酸組成，動(dòng)物難消化，營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)與產(chǎn)品收益不穩(wěn)定(Sangali and Brandelli 2000; Mabrouk 2008)。幸運(yùn)的是，當(dāng)把來自微生物的角蛋白酶和有角蛋白酶活性的微生物用來降解時(shí)，這些問題就可以迎刃而解，從而把廢物變?yōu)楫a(chǎn)品(Riffel and Brandelli 2002; Cao et al. 2008)。角蛋白是最豐富的不溶性結(jié)構(gòu)纖維狀蛋白質(zhì)，也是頭發(fā)、 指甲、 角、 毛、 皮膚和羽毛的主要成分。它不能通過酸、 堿等化學(xué)試劑和常見的蛋白水解酶，如胰蛋白酶、 胃蛋白酶和

5、木瓜蛋白酶等輕松降解的，但很容易被蛋白酶所降解(Balaji et al. 2008; Mabrouk 2008)。角蛋白酶產(chǎn)物通常可以被角蛋白所誘導(dǎo)。在含有角質(zhì)的底物，如羽毛中，有角蛋白酶活性的微生物可以被誘導(dǎo)生成大量角蛋白酶。更有趣的是，角蛋白酶可以廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、 工業(yè)、 生物醫(yī)學(xué)、 生物能源和其他領(lǐng)域，例如，飼料、 家禽加工、 紡織品、 皮革、 美國(guó)進(jìn)口、 化妝品和生物轉(zhuǎn)化的處理等。這種酶可以用于羽毛轉(zhuǎn)化為增值性產(chǎn)品，包括動(dòng)物飼料、 肥料、 膠水、 薄膜和鋁箔等?？缮a(chǎn)角蛋白酶的微生物已發(fā)現(xiàn)幾種不同的微生物種類，包括真菌、 細(xì)菌和放線菌。據(jù)報(bào)道在真菌中，一大批高產(chǎn)蛋白酶菌株存在于皮膚寄

6、生性真菌和一些其他屬中。然而，嗜熱真菌的最低生長(zhǎng)溫度為20，最高為50，且鮮有報(bào)道其可以產(chǎn)生角蛋白酶。與嗜溫菌相比，嗜熱菌可能會(huì)有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槠浼铀俚姆磻?yīng)過程和生物量與酶的積累減少了工業(yè)活動(dòng)中污染的風(fēng)險(xiǎn)。從嗜熱菌株中得到的酶也往往比那些從嗜溫菌中得到的有更大的穩(wěn)定性。培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化對(duì)酶的生產(chǎn)起著至關(guān)重要的作用。角蛋白酶生產(chǎn)菌株受許多因素如溫度，pH值和培養(yǎng)基中的碳，氮源的性質(zhì)所影響。此外，這些因素在不同的物種中有不同的影響。所以，就必須優(yōu)化可以使角蛋白酶超量生產(chǎn)的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件。通過y因素設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析來優(yōu)化也是一種獲得最佳的工藝條件重要的途徑。在本報(bào)告中，我們確定和描述一株分離

7、到的新型的可快速生長(zhǎng)的有角蛋白酶活性的嗜熱真菌，然后通過優(yōu)化各種培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的響應(yīng)面方法來提高蛋白酶活性。1 材料和實(shí)驗(yàn)方法1.1樣品收集和菌株分離本實(shí)驗(yàn)中采用的嗜熱毀絲真菌GZUIFR-H49-1是從中國(guó)四川省綿陽市的辣椒根際土壤中收集和分離到的。先將土樣在三角瓶中加無菌水用力搖勻，再將土壤懸液涂布于由羽毛粉作為主要碳源和氮源的M培養(yǎng)基中，37中培養(yǎng)。挑取單菌落，涂于PDA斜面事關(guān)，4保存于貴州大學(xué)真菌資源所。1.2菌株鑒定1.2.1形態(tài)學(xué)鑒定 將菌株GZUIFR-H49-1接種在PDA上，35生長(zhǎng)2.5天后，通過菌落特征，菌絲結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)溫度來鑒定。1.2.2分子鑒定 Taq酶和dNTP

8、來自于上海三公公司。將菌株GZUIFR-H49-1在PDA平板上孵化后，取新鮮的菌絲用于DNA 的提取。提取的DNA咋-20冰箱保存。ITS區(qū)域包含5.8S rDNA，可以用引物ITS5和ITS4來擴(kuò)增。第一輪的變性溫度為94，5分鐘，擴(kuò)增過程需要35個(gè)循環(huán)，循環(huán)中變性溫度9440s，退火溫度為4940s，延伸溫度為7260s，最后一個(gè)延伸步驟需要7210分鐘。PCR產(chǎn)物通過UNIQ-10PCR產(chǎn)物純化柱進(jìn)行純化。菌株GZUIFR-H49-1的ITS5.8S-ITS4區(qū)域核酸序列同基因庫中相近來源的真菌的序列進(jìn)行對(duì)比分析后，對(duì)引物進(jìn)行修改。1.3羽毛處理： 雞的羽毛來自于養(yǎng)殖場(chǎng)的處理廢物。首先

9、，將羽毛在1%的清潔劑中浸泡12小時(shí)，再用蒸餾水洗滌10-20分鐘直至干凈。接著，在60攝氏度烘干后，最后粉碎后過一毫米孔徑的篩子。1.4培養(yǎng)基用于激活的基礎(chǔ)培養(yǎng)基含：羽毛粉20；NaCl, 0.5; KH2PO4, 1.0 and K2HPO4, 6.0 at pH 7.5. PDA培養(yǎng)基用于菌種的鑒定和培養(yǎng)。1.5產(chǎn)酶菌株接種于裝有50ml的液體培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，置于37攝氏度搖床中120轉(zhuǎn)每分鐘培養(yǎng)。粗酶液經(jīng)過濾紙過濾后在8000rpm離心5分鐘。1.6角蛋白酶活測(cè)定酶活測(cè)定方法借鑒Anbu等人的方法。稱取20mg的羽毛粉，加入9.5ml的0.1mol/l的Tris-HCL緩沖

10、液（pH為7.8），最后加入0.5ml的過濾后的酶液。反應(yīng)混合物在37°C孵化2 h。孵化后,含10毫升反應(yīng)混合物的50毫升三角瓶浸入冰水中10分鐘,剩下的羽毛粉被過濾掉。隨后, 通過微孔膜過濾濾液收集。 然后, 在280nm處測(cè)量清晰的混合物的吸光度。角蛋白酶的酶活單位表示為一個(gè)單位對(duì)應(yīng)與37°C反應(yīng) 1 h相比在280 nm的吸光度值的增加0.01。數(shù)據(jù)由三個(gè)平行的平均值決定。1.7確定最佳發(fā)酵時(shí)間菌株H49-1接種于BLM培養(yǎng)基中，在發(fā)酵的第4，5，6，7，8天的時(shí)候分別取樣測(cè)定酶活。1.8單因素實(shí)驗(yàn)幾種補(bǔ)償碳源(淀粉、麥芽糖、葡萄糖和甘油),氮源(NaNO3,NH4

11、NO3，NH4Cl和尿素)、硫源(Na2SO4 ，Na2SO3,Na2S2O3，bME)和二硫蘇糖醇(DTT)以及礦物鹽(MgSO4.7H2O、氯化鈣、CuSO4.5H2O ZnSO4，七水硫酸亞鐵)單獨(dú)添加(碳源20 g/l,氮源0.1%、硫源0.5mmol/l和金屬鹽0.01%)與BLM培養(yǎng)基中用于H49-1角蛋白酶生產(chǎn)。孵化六天后(培養(yǎng)液中孢子濃度約為1.2107每毫升,在37°C,120轉(zhuǎn)每分鐘)進(jìn)行角蛋白酶活的測(cè)定。BLM作為空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三個(gè)平行。試劑(包括淀粉)都是分析純級(jí),并在當(dāng)?shù)刭徺I試劑公司。1.9 Plackett-Burman設(shè)計(jì)Plackett-B

12、urman設(shè)計(jì)法是一種兩水平的實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)，它試圖用最少的試驗(yàn)次數(shù)達(dá)到使因素的主效果盡可能準(zhǔn)確的估計(jì)，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素，工進(jìn)一步研究。PB 法主要通過每個(gè)因子取兩水平進(jìn)行分析，通過比較各個(gè)因子兩水平的差異與整體的差異來確定因子的顯著性。對(duì)在此研究中,Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的意義是用來對(duì)Soliman等人角的蛋白酶生產(chǎn)的方法進(jìn)行一些修改。為了減小實(shí)驗(yàn)誤差的值,每組值進(jìn)行三個(gè)平行。sas軟件包9.1版本是用于Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。1.10 Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化改善角蛋白酶活。Box-Behnk

13、en設(shè)計(jì)有三個(gè)獨(dú)立變量,每個(gè)變量三個(gè)水平和中心的點(diǎn)的三個(gè)平行。Box-Behnken設(shè)計(jì)法，簡(jiǎn)稱BBD，是響應(yīng)面優(yōu)化法常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，適用于25個(gè)因素的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。每個(gè)因素取3個(gè)水平，以（1，0，1）編碼。根據(jù)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到帶交互項(xiàng)和平方項(xiàng)的二次方程，分析各個(gè)因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，最后在一定的水平范圍內(nèi)求出最佳值。用于測(cè)定角蛋白酶活的因素符合一個(gè)多項(xiàng)式模型：Yb0 þ b1X1þb2X2þb3X3þb12X1X2þb13X1X3 þb23 X2 X3 þb11 X12 þb

14、22 X2 þb33 X32 Y是預(yù)測(cè)響應(yīng)(角蛋白酶活動(dòng))的值,b0截距項(xiàng),b1、b2和b3線性系數(shù),b12,b13和b23是相關(guān)系數(shù),b11、b22 b33二次系數(shù)。整個(gè)組的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了一組三個(gè)平行來求平均響應(yīng)值。再根據(jù)BBD實(shí)驗(yàn)得到的擬合方程，可采用繪制出響應(yīng)面圖的方法獲取最優(yōu)值，也可采用方程求解的方法獲得最優(yōu)值。另外使用一些數(shù)據(jù)處理軟件來使結(jié)果更方便優(yōu)化。但響應(yīng)面分析的得到的是一個(gè)預(yù)測(cè)的結(jié)果，需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來加以驗(yàn)證。sas軟件包版本9.1被用于試驗(yàn)設(shè)計(jì)和回歸分析獲得的數(shù)據(jù)。結(jié)果1 菌株GZUIFR-H49-1的鑒定研究結(jié)果表明,菌株H49-1的表型特征如下。在PDA上快速增長(zhǎng),

15、在35°C中生長(zhǎng) 2.5天達(dá)到85毫米,蔓延在整個(gè)培養(yǎng)皿中。邊緣有毛緣,被叢卷毛或粉狀;顏色最初為白色,變成棕色,然后反向白色深棕色。菌絲光滑,0.9-1.8微米或?qū)?.6 -6.3微米;沒有球拍形菌絲。終端和橫向分生孢子無柄或?yàn)榭勺冮L(zhǎng)度的短的突起或側(cè)向分支,單獨(dú)或2-3成鏈，分枝,光滑或多疣,大多數(shù)橢圓形,4.5-8.1 2.3-6.5微米，與基底測(cè)量0.52微米,孢子形成豐富。沒有居間分生孢子和厚垣孢子。H49-1嗜熱,生長(zhǎng)最低20°C,最佳35 - 40°C和最大55°C。使用菌株H49-1的序列在基因庫中進(jìn)行查詢。密切匹配顯示最大為9098%的是

16、包括嗜熱毀絲菌屬和其他相關(guān)物種。這些物種的序列都是從基因庫中檢索并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。R通過DNA 的its1-5.8s-its2序列關(guān)系，來分析菌株H49 - 1和相關(guān)物種在系統(tǒng)發(fā)育樹上的關(guān)系 (圖2)。從系統(tǒng)發(fā)育樹看,它分為進(jìn)化枝A和支系B。支系B中主要包含的是屬毛殼菌屬的成員。菌株H49-1不屬于支系B,這說明此菌株是相對(duì)毛殼菌屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系遙遠(yuǎn)。A的進(jìn)化枝中主要成員屬于棒囊殼屬。菌株H49-1是屬于(92%)這個(gè)進(jìn)化枝。圖1 嗜熱毀絲真菌H49-1的孢子和菌絲a 可繁殖的菌絲和成熟的孢子；b 不同粗細(xì)的菌絲； c 孢子生成處菌絲腫脹; d 成熟的表面光滑或有疣的孢子； e 孢子連接處菌

17、絲較細(xì)2 最適發(fā)酵時(shí)間的確定在BLM培養(yǎng)基中, 菌株H49-1的角蛋白酶活性分別在4日,5日,6日,7日和8日時(shí)可以達(dá)到600±26.46,500±30.00,800±51.96,400±26.46和300±34.64 U / l)的水平。所以,發(fā)酵的最優(yōu)結(jié)束時(shí)間是6天。圖2 發(fā)酵時(shí)間與角蛋白酶活的關(guān)系圖。3 最優(yōu)碳,氮和硫源和金屬鹽離子通過增加不同的補(bǔ)償?shù)奶肌⒌土虻膩碓磁囵B(yǎng)菌株H49-1后測(cè)角蛋白酶活來優(yōu)化。淀粉為最佳碳源。在添加淀粉的BLM培養(yǎng)基中孵化后6天后，角蛋白酶活提高到1800 Ul。如圖4b c中顯示，尿素和硫代硫酸鈉，分別可以

18、最高水平的提高角蛋白酶活，與BLM的培養(yǎng)相比，分別可以增加200和600 Ul。但其他氮源和硫源在一定程度上抑制角蛋白酶活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)得知氯化鈣是最有效的金屬鹽,角蛋白酶活可增加1600 Ul。然而,CuSO4和MgSO4會(huì)抑制角蛋白酶活動(dòng)。圖3 培養(yǎng)基中添加不同來源的碳源（a），氮源(b),硫源(c)和金屬離子(d)對(duì)嗜熱毀絲真菌H49-1角蛋白酶活性的影響。4 篩選Plackett-Burman設(shè)計(jì)的重要因素通過使用Plackett-Burman統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)來評(píng)估對(duì)菌株H49-1最優(yōu)產(chǎn)角蛋白酶的影響因素?；趩我蛩貙?shí)驗(yàn)的結(jié)果和以前我們的實(shí)驗(yàn)室的工作結(jié)果，八個(gè)因素被選為實(shí)驗(yàn)變量(八個(gè)變量，兩個(gè)水平)

19、應(yīng)用于Plackett-Burman設(shè)計(jì)，如表1中列出。使用sas軟件包對(duì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后的角蛋白酶活顯示在表1。由條件的統(tǒng)計(jì)分析可看出,尿素(X2)和pH值(X6)是(P < 0.05) 在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中角蛋白酶的生產(chǎn)的重要因素。圖4 通過對(duì)八個(gè)因素兩個(gè)水平進(jìn)行PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)后對(duì)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的結(jié)果。5 使用Box-Behnken進(jìn)一步優(yōu)化設(shè)計(jì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,考慮到雞羽毛作為誘導(dǎo)物和碳源角蛋白酶生產(chǎn)、雞毛、pH值和尿素被選為三個(gè)獨(dú)立變量,調(diào)查他們的互動(dòng)和影響角蛋白酶的生產(chǎn)應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)矩陣和Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)

20、果顯示在表2?；貧w模型如下：Y 5266.667 - 25X1 - 162.5X2 - 212 .5X3 - 1058.333 X12 - 175X1 X2- 575 X1 X3 - 1783.333 X2 1633.333 X32 圖5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)和響應(yīng)值；三因素的多元現(xiàn)行回歸分析Y是預(yù)測(cè)的角蛋白酶活(U1);X1 =(gl)是雞毛的濃度;X2 =(g1)尿素的濃度和X3 =為初始pH值。結(jié)果由角蛋白酶活的值來衡量。計(jì)算回歸結(jié)果顯示中，模型的決定系數(shù)R2值為0.9940,這表明,角蛋白酶活性變化觀察到的99.40%可以歸因于雞毛的濃度,尿素,初始pH值,這些變量之間的交

21、互影響。確定調(diào)整系數(shù)Adj.-R2 = 0.9831也是足夠高說明高擬合模型的意義。X1為30.08%,并沒有顯著的概率。X1和X2以及和X3之間的交互,顯著性概率> 95%的概率。然而,沒有發(fā)現(xiàn)X2和X3之間的交互作用對(duì)角蛋白酶活回歸模型的顯著性影響。上述回歸模型的擬合響應(yīng)是繪制在圖5。在回歸模型中,當(dāng)雞毛,尿素和的濃度和初始pH值分別為為20.10 g1.0g/1和7.9,預(yù)測(cè)的最大角蛋白酶活可達(dá)到5277.38 U1。通過采用單因素實(shí)驗(yàn)，Plackett-Burman和Box-Behnken設(shè)計(jì)來優(yōu)化工藝參數(shù) ,我們可以獲得角蛋白酶活從800年5277.38 U1，約6.6倍的增加

22、。為了證明回歸模型的預(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確性,在最優(yōu)的羽毛粉20.10g/1、尿素0.9770 g/1,初始pH值7.933和另一種金屬離子(氯化鈉5g /1,K2HPO4 6g/1和KH2PO4 1 g/1)的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行三個(gè)平行,在最優(yōu)培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)中獲得的平均角蛋白酶活性是5100 U1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,潛在的最優(yōu)值的角蛋白酶活動(dòng)5277.38 U1基本符合實(shí)驗(yàn)值5100 U1。討論微生物角蛋白酶生產(chǎn)會(huì)受到培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分的影響,如溫度、pH值、碳和氮的來源,盡管這些因素對(duì)不同的物種有不同影響。因此,選擇和優(yōu)化培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分對(duì)于利用微生物生產(chǎn)角蛋白酶是非常重要的。通過研究碳源對(duì)嗜熱毀絲真菌H

23、49-1在角蛋白酶生產(chǎn)的影響表明,這些補(bǔ)償?shù)奶荚茨軌虼龠M(jìn)角蛋白酶生產(chǎn)。淀粉是角蛋白酶生產(chǎn)最有效的補(bǔ)償?shù)奶荚?。然?這些影響是不適用于所有微生物。例如,培養(yǎng)基中補(bǔ)充糖(木糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇) 對(duì)生產(chǎn)角蛋白酶有負(fù)面影響的的真菌如短帚霉。類似的結(jié)果在地衣芽孢桿菌的研究中也有報(bào)道。這些結(jié)果表明,碳源對(duì)角蛋白酶生產(chǎn)的影響與所檢測(cè)真菌物種密切相關(guān)。與一些單糖或雙糖相比，淀粉可以更有效地促進(jìn)角蛋白酶生產(chǎn)。例如,淀粉是一個(gè)可以有效增加角蛋白酶活的底物。大多數(shù)氮的來源,比如、酪蛋白、大豆,明膠,丙氨酸,NH4NO3和NH4Cl, 在生產(chǎn)時(shí)添加到培養(yǎng)基中可以抑制角蛋白酶的活性。但是，在我們的實(shí)驗(yàn)中尿素是積極的氮源,這表