實(shí)驗(yàn) 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)與顏色反應(yīng)

1、實(shí)驗(yàn) 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)與顏色反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆砧b定蛋白質(zhì)的原理和方法。熟悉蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)，進(jìn)一步熟悉蛋白質(zhì)的有關(guān)反應(yīng)。二、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)分子中某種或某些集團(tuán)可與顯色劑作用，產(chǎn)生顏色。不同的蛋白質(zhì)由于所含的氨基酸不完全相同，顏色反應(yīng)亦不完全相同。顏色反應(yīng)不是蛋白質(zhì)的專(zhuān)一反應(yīng)，一些非蛋白物質(zhì)也可產(chǎn)生同樣的顏色反應(yīng)，因此不能根據(jù)顏色反應(yīng)的結(jié)果來(lái)決定被測(cè)物是否為蛋白質(zhì)。另外，顏色反應(yīng)也可作為一些常用蛋白質(zhì)定量測(cè)定的依據(jù)。蛋白質(zhì)是親水性膠體，在溶液中的穩(wěn)定性與質(zhì)點(diǎn)大小、電荷、水化作用有關(guān)，但其穩(wěn)定性是有條件的，相對(duì)的。如果條件發(fā)生了變化，破壞了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中沉淀出來(lái)。三、實(shí)驗(yàn)儀器

2、1、吸管 2、滴管 3、試管 4、電爐 5、pH試紙 6、水浴鍋7、移液管 四、實(shí)驗(yàn)試劑1、卵清蛋白液：雞蛋清用蒸餾水稀釋10-20倍，3-4層紗布過(guò)濾，濾液放在冰箱里冷藏備用。2、 0.5%苯酚：1g苯酚加蒸餾水稀釋至200ml。3、Millons試劑：40g汞溶于60ml濃硝酸（水浴加溫助溶）溶解后，冷卻，加二倍體積的蒸餾水，混勻，取上清夜備用。此試劑可長(zhǎng)期保存。4、尿素晶體5、1%CuSO4：1g CuSO4晶體溶于蒸餾水，稀釋至100ml6、10%NaOH：10g NaOH溶于蒸餾水，稀釋至100ml7、濃硝酸8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀釋至100ml.9

3、、 冰醋酸10、濃硫酸11、飽和硫酸銨溶液：100ml蒸餾水中加硫酸銨至飽和。12、硫酸銨晶體：用研缽研成碎末。13、95%乙醇。14、醋酸鉛溶液：1g醋酸鉛溶于蒸餾水并稀釋至100ml15、氯化鈉晶體16、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸餾水中并稀釋至100ml17、飽和苦味酸溶液：100ml蒸餾水中加苦味酸至飽和。18、1%醋酸溶液。五、實(shí)驗(yàn)步驟蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)（一） 米倫（Millons）反應(yīng)1、苯酚實(shí)驗(yàn)：取0.5%苯酚溶液1ml于試管中，加Millons試劑0.5ml，電爐小心加熱觀(guān)察顏色變化。2、蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)：取2ml蛋白液，加Millons試劑0.5ml，出現(xiàn)白色的蛋白質(zhì)沉淀

4、，小心加熱，觀(guān)察現(xiàn)象。（二） 雙縮脲反應(yīng)1、取少量尿素晶體放在干燥的試管中，微火加熱熔化，至重新結(jié)晶時(shí)冷卻。然后加10%NaOH溶液1ml，搖勻，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混勻，觀(guān)察現(xiàn)象。 2、取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，搖勻，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混勻，觀(guān)察現(xiàn)象。（三） 黃色反應(yīng)取一支試管，加入1ml蛋白液及濃硝酸5滴。加熱，冷卻后注意顏色變化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，觀(guān)察顏色有什么變化。（四） 茚三酮反應(yīng)取蛋白液1ml于試管中，加4-8滴茚三酮溶液，加熱至沸，即有藍(lán)紫色出現(xiàn)。蛋白質(zhì)的沉淀（一）蛋白質(zhì)的鹽析作用1、試管中加蒸餾水3ml，加固體硫

5、酸銨至飽和。另一支試管加蛋白液2ml，再加入飽和硫酸銨溶液2ml，搖勻靜置觀(guān)察現(xiàn)象。 2、將上述混合液過(guò)濾。向?yàn)V液中逐漸加入少量固體硫酸銨，直至飽和為止，此時(shí)析出為清蛋白。再加入少量蒸餾水，觀(guān)察沉淀是否溶解。（二）有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)試管中加蛋白液1ml，加晶體氯化鈉少許，溶解后加95%乙醇3ml,搖勻，觀(guān)察現(xiàn)象。（三）重金屬鹽與某些有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)1、取試管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸鉛溶液，另一支管中滴加1%硫酸銅溶液，至有沉淀產(chǎn)生。2、取一支試管加蛋白液2ml，再加入10%三氯乙酸1ml，充分混勻，觀(guān)察結(jié)果。（四）生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)取一支試管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5

6、滴，再加飽和苦味酸數(shù)滴，觀(guān)察現(xiàn)象。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)（一） 米倫（Millons）反應(yīng)1、苯酚實(shí)驗(yàn)： 溶液即出現(xiàn)玫瑰紅色。2、蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)：出現(xiàn)白色的蛋白質(zhì)沉淀，小心加熱后凝固的蛋白質(zhì)出現(xiàn)紅色。（二） 雙縮脲反應(yīng)1、有紫色出現(xiàn)。2、溶液有藍(lán)紫色出現(xiàn)（三） 黃色反應(yīng)先有黃色沉淀生成，加入10%NaOH溶液1ml后顏色變?yōu)殚冱S色。（四） 茚三酮反應(yīng)有藍(lán)紫色出現(xiàn)。蛋白質(zhì)的沉淀（一）蛋白質(zhì)的鹽析作用1、有蛋白析出。2、有蛋白質(zhì)析出，加水后可復(fù)溶。（六）有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)取一試管加蛋白液1ml，加入晶體氯化鈉少許，待溶解后再加95%乙醇3ml,搖勻，觀(guān)察現(xiàn)象（七）重金屬鹽與某些有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)

7、取試管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸鉛溶液，另一支管中滴加1%硫酸銅溶液，至有沉淀產(chǎn)生。（八）生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)取一支試管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加飽和苦味酸和鞣酸數(shù)滴，觀(guān)察現(xiàn)象。七、 實(shí)驗(yàn)分析蛋白質(zhì)分子中某種或某些集團(tuán)可與顯色劑作用，產(chǎn)生顏色。不同的蛋白質(zhì)由于所含的氨基酸不完全相同，顏色反應(yīng)亦不完全相同。其中米倫試劑能與苯酚及某些二羥基苯衍生物起顏色反應(yīng)，而組成蛋白質(zhì)的氨基酸中酪氨酸含苯酚基團(tuán)，因此可用米倫試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)中酪氨酸的存在。尿素被加熱，形成雙縮脲，在堿性環(huán)境中，能與硫酸銅結(jié)合成紫色的化合物，此反應(yīng)稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵與縮脲結(jié)構(gòu)相似，也能

8、進(jìn)行此反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于濃硝酸可反應(yīng)并生成黃色物質(zhì)，此物質(zhì)在堿性環(huán)境下變?yōu)榻埸S色的硝基苯衍生物硝醌酸等。蛋白質(zhì)與茚三酮共熱，產(chǎn)生蘭紫色的還原茚三酮、茚三酮和氨的縮合物。此反應(yīng)為一切蛋白質(zhì)及a-氨基酸所共有。亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）與茚三酮反應(yīng)呈黃色，含有氨基的其他物質(zhì)亦呈此反應(yīng)蛋白質(zhì)是親水性膠體，在溶液中的穩(wěn)定性與質(zhì)點(diǎn)大小、電荷、水化作用有關(guān)，但其穩(wěn)定性是有條件的，相對(duì)的。如果條件發(fā)生了變化，破壞了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中沉淀出來(lái)。向蛋白質(zhì)中加入大量的中性鹽（硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等），使蛋白質(zhì)膠體顆粒脫水，破壞其水化層，同時(shí)它所帶有

9、的電荷亦被中性鹽上所帶的相反電荷的離子所中和。于是穩(wěn)定因素被破壞，蛋白質(zhì)聚集沉淀。鹽析作用一般不使蛋白質(zhì)變性。某些有機(jī)溶劑（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白質(zhì)脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用，致使蛋白質(zhì)顆粒容易凝聚而沉淀。重金屬離子（如Pb2+、Cu2+等）與蛋白質(zhì)的羧基等結(jié)合生成不溶性的金屬鹽類(lèi)而沉淀，同時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生變性。某些有機(jī)酸的酸根則與蛋白質(zhì)的自由氨基結(jié)合而沉淀。植物體內(nèi)具有顯著生理作用的含氮堿性化合物成為生物堿。能沉淀生物堿或與其產(chǎn)生顏色反應(yīng)的物質(zhì)稱(chēng)為生物堿試劑，如鞣酸等。當(dāng)溶液PH小于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷，容易與生物堿試劑的負(fù)離子發(fā)生反應(yīng)而沉淀。蛋白質(zhì)

10、變性（protein denaturation）是指蛋白質(zhì)在某些物理和化學(xué)因素作用下其特定的空間構(gòu)象被改變，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)的改變和生物活性的喪失。一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)有了改變或遭到破壞，都是變性的結(jié)果。能使蛋白質(zhì)變性的化學(xué)方法有加強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬鹽、尿素、乙醇、丙酮等；能使蛋白質(zhì)變性的物理方法有加熱(高溫)、紫外線(xiàn)及X射線(xiàn)照射、超聲波、劇烈振蕩或攪拌等。如果變性條件劇烈持久，蛋白質(zhì)的變性是不可逆的。如果變性條件不劇烈，這種變性作用是可逆的。這時(shí)，如果除去變性因素，在適當(dāng)條件下變性蛋白質(zhì)可恢復(fù)其天然構(gòu)象和生物活性，這種現(xiàn)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)復(fù)性（renaturation）。例如胃蛋白

11、酶加熱至8090時(shí)，失去溶解性，也無(wú)消化蛋白質(zhì)的能力，如將溫度再降低到37，則又可恢復(fù)溶解性和消化蛋白質(zhì)的能力。 蛋白質(zhì)變性的應(yīng)用價(jià)值醫(yī)學(xué)：臨床上的消毒和滅菌-使病原微生物變性 注射及外傷采用75%乙醇滅菌 手術(shù)器械及其它用品采用高溫高壓滅菌 手術(shù)室用紫外線(xiàn)滅菌 用熱凝法檢查尿蛋白 實(shí)驗(yàn)室： 防止蛋白質(zhì)變性：在生產(chǎn)和保存激素、酶、抗體血清等具有生物活性的蛋白質(zhì)（如酶、疫苗、免疫血清等）時(shí)，應(yīng)防止其變性失活，其中在低溫條件下生產(chǎn)與貯存以上蛋白質(zhì)就是這個(gè)道理。 實(shí)驗(yàn)室的滅菌：細(xì)胞培養(yǎng)室等亦用紫外線(xiàn)照射消毒滅菌。日常生活：熟食較生食易消化：因?yàn)榈鞍踪|(zhì)變性后，肽鏈構(gòu)象由卷曲變?yōu)樯煺梗闺慕”┞?，易被?/p>

12、白水解酶消化水解。其中鹽析法作為一種蛋白質(zhì)膠體簡(jiǎn)便的提取手段被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。鹽析法是在中藥水提液中,加入無(wú)機(jī)鹽至一定濃度,或達(dá)飽和狀態(tài),使某些成分在水中溶解度降低,從而與水溶性大的雜質(zhì)分離。 如向蛋白質(zhì)溶液中加入某些濃的無(wú)機(jī)鹽如(NH4)2SO4或Na2SO4溶液后，可以使蛋白質(zhì)凝聚而從溶液中析出，這種作用就叫做鹽析。這樣析出的蛋白質(zhì)仍可以溶解在水中，而不影響原來(lái)蛋白質(zhì)的性質(zhì)。因此，鹽析是一個(gè)可逆的過(guò)程。利用這個(gè)性質(zhì)，可以采用多次鹽析的方法來(lái)分離、提純蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度取決于蛋白質(zhì)分子表面離子周?chē)乃肿訑?shù)目，亦即主要是由蛋白質(zhì)分子外周親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽后，由于中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，致使蛋白質(zhì)分子周?chē)乃瘜訙p弱乃至消失。同時(shí)，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。由于各種蛋白質(zhì)在不同鹽濃度中的溶解度不同，不同