酶聯(lián)免疫吸附實驗 ELISA --操作規(guī)則(新手適用)

1、酶聯(lián)免疫吸附實驗 ELISA 操作規(guī)則（新手適用）一、實驗目的酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay 簡稱ELISA)是在免疫酶技術(immunoenzymatic techniques)的基礎上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術，ELISA過程包括抗原(抗體)吸附在固相載體上稱為包被，加待測抗體(抗原)，再加相應酶標記抗體(抗原)，生成抗原(抗體)-待測抗體(抗原)-酶標記抗體的復合物，再與該酶的底物反應生成有色產物。借助分光光度計的光吸收計算抗體(抗原)的量。待測抗體(抗原)的定量與有色產生成正比。二、實驗原理用于免疫酶技術的酶有很多，如過氧化物

2、酶，堿性磷酸酯酶，半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰膽堿酯酶，6磷酸葡萄糖脫氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根過氧化物酶，堿性磷酸酯酶等，其中尤以辣根過氧化物酶為多。由于酶摧化的是氧化還原反應，在呈色后須立刻測定，否則空氣中的氧化作用使顏色加深，無法準確地定量。 辣根過氧化物酶（HRP）是一種糖蛋白，每個分子含有一個氯化血紅素(protonhemin)區(qū)作輔基。酶的濃度和純度常以輔基的含量表示。氯化血紅素輔基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的濃度和純度計算式是（已知HRP的A(1cm 403nm 1%)25，式中1指HRP百分濃度為100ml含酶蛋

3、白1g，即10mg/ml，所以，酶濃度以 mg/ml 計算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP純度(RZ)=A403nm/A275nm純度RZ（einheit Zahl）值越大說明酶內所含雜質越少。高純度HRP的RZ值在3.0左右，最高可達3.4。用于ELISA檢測的HRP的RZ值要求在3.0以上。 （二）酶與底物酶結合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結的產物。是ELISA成敗的關鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應，還具有酶促反應，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物。免疫技術常用的酶及其底物酶底物顯色反應測定波長辣根過氧化物酶鄰苯二胺橘紅色49

4、2*四甲替聯(lián)苯胺黃色460*氨基水楊酸棕色449鄰聯(lián)苯甲胺蘭色4252，2-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽藍綠色642堿性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸鹽(PNP)黃色400萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽紅色500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖黃色405，420葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭深藍色-半乳糖苷酶甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)熒光360，450硝基酚半乳糖苷(ONPG)黃色420* 終止劑為2mol/L H2SO4* 終止劑為2 mol/L檸檬酸， 不同的底物有不同的終止劑?？纱呋铝蟹磻?HRP+H2O2復合物 復合物+AH2過氧化物酶+H2O+A AH2 為無色底物，

5、供氫體； A 為有色產物。（三）ELISA常用的四種方法1直接法測定抗原 將抗原吸附在載體表面；加酶標抗體，形成抗原抗體復合物；加底物。底物的降解量抗原量。 2間接法測定抗體將抗原吸附于固相載體表面；加抗體， 形成抗原-抗體復合物；加酶標抗體；加底物。 測定底物的降解量抗體量。3雙抗體夾心法測定抗原將抗原免疫第一種動物獲得的抗體吸附于固相表面;加抗原，形成抗原-抗體復合物; 加抗原免疫第二種動物獲得的抗體，形成抗體抗原抗體復合物;加酶標抗抗體(第二種動物抗體的抗體); 加底物。底物的降解量抗原量。4. 競爭法測定抗原將抗體吸附在固相載體表面;(1) 加入酶標抗原；(2)，(3)加入酶標抗原和待

6、測抗原；加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差未知抗原量。 三、儀器和材料1. 聚苯乙烯微量細胞培養(yǎng)板(平板， 40， 96孔)。2. 酶聯(lián)免疫檢測儀3. 辣根過氧化物酶羊抗兔IgG， 工作稀釋度1:1000。4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸緩沖液，4，保存，Na2CO3 0.15克， NaHCO3 0.293克，蒸餾水稀釋至100 ml。5. 稀釋液：0.01mol/LpH7.4 PBS-Tween-20， ，保存. NaCl 8g， KH2PO4 0.2g， Na2HPO4.12H2O 2.9g， Tween20，0.5ml. 蒸餾水加至1000ml。6. 洗滌液：同稀釋液

7、7. 封閉液：0.5%雞卵清蛋白，pH7.4 PBS。8. 鄰苯二胺溶液(底物)：臨用前配制 0.1M 檸檬酸(2.1g/100ml)， 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O(7.163g/100ml)6.4ml， 蒸餾水12.5ml， 鄰苯二胺10mg， 溶解后， 臨用前加30%H2O2 40 微升。9. 終止液：2mol/LH2SO4。 四、操作步驟1.包被抗原：用包被液將抗原作適當稀釋， 一般為110微克/孔，每孔加200微升，37溫育1小時后，4冰箱放置1618小時。2.洗滌：倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜放三分鐘，反復三次，最后將反應板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡。3

8、.加封閉液200微升，37放置一小時。4.洗滌同2。5.加被檢血清：用稀釋液將被檢血清作幾種稀釋，每孔200微升。同時作稀釋液對照。37放置2小時。6.洗滌同2。7.加辣根過氧化物酶羊抗兔IgG， 每孔200微升， 放置37 1小時。8.洗滌同2。9.加底物：鄰苯二胺溶液加200ml，室溫暗處10-15分鐘。10.加終止液：每孔50微升。11.觀察結果：用酶聯(lián)免疫檢測儀記錄490nm讀數(shù)。流式細胞術 FCM 介紹及簡易操作步驟新手適用一、流式細胞術概述 流式細胞術(Flow Cytometry， FCM)是七十年代發(fā)展起來的高科學技術，它集計算機技術、激光技術、流體力學、細胞化學、細胞免疫學于

9、一體，同時具有分析和分選細胞功能。它不僅可測量細胞大小、內部顆粒的性狀，還可檢測細胞表面和細胞漿抗原、細胞內DNA、RNA含量等，可對群體細胞在單細胞水平上進行分析，在短時間內檢測分析大量細胞，并收集、儲存和處理數(shù)據(jù)，進行多參數(shù)定量分析；能夠分類收集(分選)某一亞群細胞，分選純度95%。在血液學、免疫學、腫瘤學、藥物學、分子生物學等學科廣泛應用。國內使用的流式細胞儀主要由美國的兩個廠家生產:Becton-Dickinson公司(簡稱B-D公司)和BECKMAN-COULTER公司。流式細胞儀主要有兩型:臨床型（又稱小型機、臺式機）和綜合型（又稱大型機、分析型）。B-D公司最新產品為FACS V

10、antage和FACS Calibur。BECKMAN-COULTER公司最新產品為EPICSALTRA和EPICSXL/XL-MCL。EPICSXL/XL-MCL和FACSCalibur是臨床型;EPICSALTRA和FACSVantage是綜合型，除具備檢測分析功能外，還具有細胞分選功能，多用于科學研究。二、流式細胞儀主要技術指標 1.流式細胞儀的分析速度：一般流式細胞儀每秒檢測10005000個細胞，大型機可達每秒上萬個細胞。2.流式細胞儀的熒光檢測靈敏度：一般能測出單個細胞上600個熒光分子，兩個細胞間的熒光差5%即可區(qū)分。3.前向角散射（FSC）光檢測靈敏度：前向角散射（FSC）反映

11、被測細胞的大小，一般流式細胞儀能夠測量到0.2m.5m。4.流式細胞儀的分辨率：通常用變異系數(shù)CV值來表示，一般流式細胞儀能夠達到2.0%，這也是測量標本前用熒光微球調整儀器時要求必須達到的。5.流式細胞儀的分選速度：一般流式細胞儀分選速度1000個/秒，分選細胞純度可達99%以上。三、流式細胞儀主要構造和工作原理-流動室及液流驅動系統(tǒng) 流式細胞儀主要由以下五部分構成:流動室及液流驅動系統(tǒng)激光光源及光束形成系統(tǒng)光學系統(tǒng)信號檢測與存儲、顯示、分析系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng)。流動室（FlowCell或FlowChamber）是流式細胞儀的核心部件，流動室由石英玻璃制成，單細胞懸液在細胞流動室里被鞘流液包繞通

12、過流動室內的一定孔徑的孔，檢測區(qū)在該孔的中心，細胞在此與激光垂直相交，在鞘流液約束下細胞成單行排列依次通過激光檢測區(qū)。流動室里的鞘液流是一種穩(wěn)定流動，控制鞘液流的裝置是在流體力學理論的指導下由一系列壓力系統(tǒng)、壓力感受器組成，只要調整好鞘液壓力和標本管壓力，鞘液流包繞樣品流并使樣品流保持在液流的軸線方向，能夠保證每個細胞通過激光照射區(qū)的時間相等，從而使激光激發(fā)的熒光信息準確無誤。見圖12.1流動室示意圖。流動室孔徑有60m、100m、150m、250m等多種，供研究者選擇。小型儀器一般固定裝置了一定孔徑的流動室。圖12.1流動室示意圖(采自CoulterTrainingGuide)四、流式細胞儀

13、主要構造和工作原理-激光光源及光束形成系統(tǒng) 流式細胞儀可配備一根或多根激光管，常用的激光管是氬離子氣體激光管，它的發(fā)射光波長488m，此外可配備氦氖離子氣體激光管（波長633m）和/或紫外激光管。流式細胞儀的主要測定信號熒光是由激發(fā)光激發(fā)的，熒光信號的強弱與激發(fā)光的強度和照射時間相關，激光是一種相干光源，它能提供單波長、高強度、高穩(wěn)定性的光照，正是能達到這一要求的理想的激發(fā)光光源。在激光光源和流動室之間有兩個圓柱形透鏡，將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束(22m66m)，在這種橢圓形激光光斑內激光能量成正態(tài)分布，使通過激光檢測區(qū)的細胞受照強度一致。五、流式細

14、胞儀主要構造和工作原理-光學系統(tǒng) 流式細胞儀的光學系統(tǒng)由若干組透鏡、小孔、濾光片組成，大致可分為流動室前和流動室后兩組。流動室前的光學系統(tǒng)由透鏡和小孔組成，透鏡和小孔（一般為2片透鏡、1個小孔）的主要作用是將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束，使激光能量成正態(tài)分布，使通過激光檢測區(qū)的細胞受照強度一致，最大限度的減少雜散光的干擾；流動室后的光學系統(tǒng)主要由多組濾光片組成，濾光片的主要作用是將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管。濾光片主要有三類：長通濾片（LP）-只允許特定波長以上的光線通過，短通濾片(SP)-只允許特定波長以下的光線通過，帶通濾片(BP)-只允

15、許特定波長的光線通過，不同組合的濾片可以將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管(PMT)，如接收綠色熒光(FITC)的PMT前面配置的濾光片是LP550和BP525，接收色橙紅色熒光(PE)的PMT前面配置的濾光片是LP600和BP575，接收紅色熒光(CY5)的PMT前面配置的濾光片是LP650和BP675。見圖12.2光學系統(tǒng)和信號檢測系統(tǒng)示意圖。六、流式細胞儀主要構造和工作原理信號檢測系統(tǒng) 當測定標本在鞘流液約束下細胞成單行排列依次通過激光檢測區(qū)時產生散射光和熒光信號，散射光分為前向角散射（ForwardScatter，F(xiàn)S）和側向角散射或900散射（SideScatter，SS），散

16、射光是細胞的物理參數(shù)與細胞樣本的制備（如染色）無關;熒光信號也有兩種，一種是細胞自發(fā)熒光它一般很微弱，一種是細胞樣本經標有特異熒光素的單克隆抗體染色后經激光激發(fā)發(fā)出的熒光，它是我們要測定的熒光，熒光信號較強，這兩種熒光信號的同時存在是我們測定時需要設定陰性對照的理由，以便從測出的熒光信號中減去細胞自發(fā)熒光和抗體非特異結合產生的熒光。前向角散射（FS）反映被測細胞的大小，它由正對著流動室的光電二極管裝置接收并轉變?yōu)殡娦盘?；側向角散射?00散射（SS）反映被測細胞的細胞膜、細胞質、核膜的折射率和細胞內顆粒的性狀，它由一個光電倍增管(PMT)接收并轉變?yōu)殡娦盘枺@些電信號存儲在流式細胞儀的計算機硬

17、盤或軟盤內。流式細胞儀測定常用的熒光染料有多種，他們分子結構不同，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜也各異，選擇熒光染料時必須依據(jù)流式細胞儀所配備的激光光源的發(fā)射光波長(如氬離子氣體激光管，它的發(fā)射光波488m，氦氖離子氣體激光管發(fā)射光波長633m)。488m激光光源常用的熒光染料有FITC（異硫氰酸熒光素）、PE（藻紅蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP(葉綠素蛋白)、ECD(藻紅蛋白-得克薩斯紅)等。他們的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別是：激發(fā)光波長（m）發(fā)射光峰值（m）FITC488525（綠）PE488575（橙紅）PI488630（橙紅）ECD488610（紅）CY5488675（深紅）P

18、reCP488675（深紅）各種熒光信號由各自的光電倍增管(PMT)接收并轉變?yōu)殡娦盘柡蟠鎯υ诹魇郊毎麅x的計算機硬盤或軟盤內.見圖12.2光學系統(tǒng)和信號檢測系統(tǒng)示意圖。七、流式細胞儀信號存儲、顯示、分析系統(tǒng) (一) 信號存儲存儲在流式細胞儀的計算機硬盤或軟盤內的數(shù)據(jù)一般是以Listmode(列表排隊)方式存入的，采用Listmode方式有兩大優(yōu)點:節(jié)約內存和磁盤空間易于加工處理分析。（二）信號顯示和分析由于Listmode方式數(shù)據(jù)缺乏直觀性，數(shù)據(jù)的顯示和分析一般采用一維直方圖(圖12.3)、二維點陣圖(圖12.4，12.5)、等高線圖(圖12.8)和密度圖(圖12.7)。1單參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析

19、細胞的每一個單參數(shù)測量數(shù)據(jù)用直方圖來顯示，圖中橫坐標表示散射光或熒光信號相對強度值，其單位是道數(shù)，可以是線性的，也可以是對數(shù)的；縱坐標表示細胞數(shù)。見圖12.3一維直方圖，圖中橫坐標是FITC熒光信號相對強度值（對數(shù)），縱坐標表示細胞數(shù);圖中已根據(jù)陰性對照設定適當?shù)摹伴T”（直線門），儀器的計算機就會給出測定值（包括陽性細胞%和平均熒光強度）。2.雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析細胞的雙參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細胞數(shù)量的關系用一維直方圖、二維點陣圖、等高線圖和密度圖顯示和分析。如圖12.4二維點陣圖，是正常人外周血白細胞的前向散射光（FS）和側向散射光（SS）組成的點陣圖，橫坐標和縱坐標均是線性的，圖中淋巴細胞、單核細

20、胞、粒細胞很明顯地分為3群，可以很容易地圈“門”（Bitmap，無定型門），分析各亞群細胞的數(shù)據(jù);圖12.6假三維地形圖(X軸:SSC，Y軸:FSCZ軸:細胞數(shù))更清楚地表明這一點。圖12.5二維點陣圖是細胞的兩種熒光（FITC和RD1）雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示，橫坐標和縱坐標均是對數(shù)的，橫坐標代表FITC，縱坐標代表PE，圖中已設定適當?shù)摹伴T”（十字門），十字門的D1、D2、D3、D4門分別代表PE單陽性細胞、PE和FITC雙陽性細胞、陰性細胞、FITC單陽性細胞。儀器的計算機就會給出兩種熒光測定值（包括陰性細胞%、兩種熒光各自的陽性細胞%、兩種熒光的雙陽性細胞%、各群細胞的平均熒光強度）。圖12.7

21、和圖12.8分別是測定細胞的兩種熒光雙參數(shù)數(shù)據(jù)的密度圖和等高線圖，橫坐標和縱坐標分別代表一種熒光參數(shù)，同理只要設定十字門就可得到兩種熒光的各種測定值，密度圖和等高線圖較點陣圖更直觀。3三參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析細胞的三參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細胞數(shù)量的關系每兩個數(shù)據(jù)組成一對（三參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細胞數(shù)量每兩個數(shù)據(jù)可組成6對數(shù)據(jù)）用一維直方圖、二維點陣圖、等高線圖和密度圖顯示和分析。三個熒光數(shù)據(jù)關系用分光圖（prism）表示，分光圖可直接給出8個數(shù)據(jù)（如用ABC代表3種熒光，可有A+B+C+、A+B+C-、A+B-C-、A-B+C+、A-B+C-、A-B-C+、A+B-C+、A-B-C-）。見圖12.9prism，

22、圖12.9為人外周血淋巴細胞亞群測定結果的分光圖，圖中給出CD3、CD4、CD8組合的各種結果，如T輔助細胞（CD3+CD4+CD8-）為42.0%，如T抑制細胞（CD3+CD4+CD8-）為17.4%。圖12.5兩種熒光的二維點陣圖(采自CoulterOperatersGuide)圖12.7.雙參數(shù)數(shù)據(jù)的密度圖(采自CoulterOperatersGuide) 圖12.6假三維地形圖和二維點陣圖(采自CoulterOperatersGuide)圖12.8雙參數(shù)數(shù)據(jù)的等高線圖(采自CoulterOperatersGuide)圖12.9分光圖（prism）八、流式細胞儀主要構造和工作原理-細胞分

23、選系統(tǒng) 如在細胞流動室上裝有超聲壓電晶體，通電后超聲壓電晶體發(fā)生高頻震動，可帶動細胞流動室高頻震動，使細胞流動室噴咀流出的液流束斷成一連串均勻的液滴，每秒鐘形成液滴上萬個。每個液滴中包含著一個樣品細胞，液滴中的細胞在形成液滴前已被測量，如符合預定要求則可被充電，在通過偏轉板的高壓靜電場時向左或向右偏轉被收集在指定容器中，不含細胞液滴或細胞不符合預定要求液滴不被充電亦不發(fā)生偏轉進入中間廢液收集器中，從而實現(xiàn)了分選。分選的詳細原理和操作請有興趣者參考有關文獻。九、流式細胞儀的簡易樣品制備和操作步驟活細胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細胞表面相應抗原結合，再用熒光標記的第

24、二抗體結合，根據(jù)所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應抗原的密度和分布。(一)操作步驟 特別簡單制備活性高的細胞懸液(培養(yǎng)細胞系、外周血單個核細胞、胸腺細胞、脾細胞等均可用于本法)用10FCSRPMI1640調整細胞濃度為51010ml取40l細胞懸液加入預先有特異性McAb(550l)的小玻璃管或塑料離心管，再加50l 120(用DPBS稀釋)滅活正常兔血清4 30min用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右1000rpm5min棄上清，加入50l工作濃度的羊抗鼠(或兔抗鼠)熒光標記物，充分振搖4 30min用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml左右1000rpm5min加適量固定液(如為FCM

25、制備標本，一般加入1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，視細胞濃度加入100500l固定液)FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察(標本在試管中可保存57天)(二)試劑和器材1.各種特異性單克隆抗體。2.熒光標記的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗體，滅活正常兔血清。3.10 FCS RPMI1640， DPBS、洗滌液、固定液(見附錄)。4.玻璃管、塑料管、離心機、熒光顯微鏡等。(三)注意事項有二種標記方式：直接免疫熒光標記法，直接加入連接有熒光素的抗體進行免疫標記反應(如做雙標或多標染色，可把幾種標記有不同熒光素的抗體同時加入)。本方法操作簡便，結果準確，易于分析，適用于同一細胞群多參數(shù)同時測定。雖然直

26、標抗體試劑成本較高，但減少了間接標記法中較強的非特異熒光的干擾，因此更適用于臨床標本的檢測。間接免疫熒光標記法，先加入特異的第一抗體，待反應完全后洗去未結合抗體，再加入熒光標記的第二抗體。本方法費用較低，二抗應用廣泛，多用于科研標本的檢測。但由于二抗一般為多克隆抗體，特異性較差，非特異性熒光背景較強，易影響實驗結果。所以標本制備時應加入陰性或陽性對照。另外，由于間標法步驟較多，增加了細胞的丟失，不適用測定細胞數(shù)較少的標本。1.整個操作在4下進行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN，上述實驗條件是防止一抗結合細胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。2.洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗

27、相結合，出現(xiàn)假陰性。3.最小化非特異性結合的方法a熒光標記的抗體的濃度應該合適，如果濃度過高，背景會因為非特異性的相互作用的增加而增加。b細胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。c在使用第一抗體之前，將樣品與過量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脫脂干奶酪，或來自于同一寄主的正常血清來作為標記的第二抗體。這個步驟通過阻斷第一抗體和細胞表面或胞內結構的非特異性的交互作用來降低背景。加適量正常兔血清也可封閉某些細胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性d在使用第一抗體之后，將樣品與5%至10%的來自于同一寄主的正常血清和作為標記的第二抗體一起培育。這個步驟會減少不必要的第二抗體與第一

28、抗體、細胞表面或胞內結構之間的交互作用。通過用來自于同樣的樣品的血清稀釋標記過的抗體可以略過此步驟。此步驟適用于很多方面，但有時候它也會導致已標記的第二抗體和正常血清中的免疫球蛋白的免疫復合體的形成。這種復合體會優(yōu)先與一些細胞結構進行結合，或者它們最終會導致期望得到的抗體活性的丟失。e使用F(ab)2片段會使背景決定于第一或第二抗體與FC受體的全分子結合。大多數(shù)的第二抗體的F(ab)2片段容易利用。而第一抗體的F(ab)2片段一般是不能利用或很難制作。因此，在NaN3存在的條件下，將新鮮組織或細胞與正常血清一起培育應選擇優(yōu)先加入第一抗體。在此情況下，即使在隨后的步驟中用完所有的抗體分子，F(xiàn)C受

29、體決定的背景影響已不再重要。f其它：已標記的抗體和其他一些內在的免疫球蛋白或加入實驗系統(tǒng)中的其它物質的交叉反應也可能會有背景影響。為了降低背景，在多重標記過程中，所有的已標記的抗體應被吸附，避免其他種類蛋白的交叉反應。附:1. DPBS (10， 貯存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸餾水加至1000mlNaHPO 11.5g 臨用時用蒸餾水110稀釋KHPO 2g2.洗滌液DPBS900mlFCS 50ml (終濃度5)4NaN50ml (終濃度0.2)固定液DPBS1000ml葡萄糖20g (終濃度2)甲醛10mlNaN0.2g (終濃度0.02)免疫熒光（IF）細胞化學染色方法一、標本

30、制作 可制作涂片、印片、細胞單層培養(yǎng)物、組織切片，經適當固定或不固定，作免疫熒光染色用。二、熒光抗體染色方法（一）直接法1染色 切片經固定后，滴加經稀釋至染色效價如1：8或1：16的熒光抗體（如兔抗人-球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等），在室溫或37染色30min，切片置入能保持潮濕的染色盒內，防止干燥。2洗片傾去存留的熒光抗體，將切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗兩次，攪拌，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結晶。3用50%緩沖（0.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.09.5）甘油封固、鏡檢4對照染色正常免熒光血清染色，如上法處理切片，結果應為陰性。染色抑制試驗（一

31、步法）：將熒光抗體和未標記的抗體球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法處理切片。結果應為陰性。為證明此種染色抑制不是由于熒光抗體被稀釋所致，可用鹽水代替未標記抗血清，染色結果應為陽性。此法結果較二步法穩(wěn)定。類屬抗原染色試驗，前面已作敘述。直接法比較簡單，適合做細菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質抗原如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應的抗原，特異性高而敏感性較低。（二）間接法（1）切片固定后用毛細滴管吸取經適當稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，37作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液體

32、。（2）再滴加間接熒光抗體（如兔抗人-球蛋白熒光抗體等），同上步驟，染色30min，37，緩沖鹽水洗兩次10min，攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。對照染色：抗體對照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法進行染色，結果應為陰性?？乖瓕φ眨杭搭悓倏乖旧?，亦應為陰性。陽性對照。間接法中上述方法稱雙層法（Double Layer Method）。另一種稱夾心法，即用未標記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應抗體結合，再用該抗原之熒光抗體重疊結合其上，而間接地顯示出組織和細胞中抗體的存在，方法步驟如下：切片或涂片固定后，置于染色濕盒內。滴加未標記的特異性抗原作用切片于37，30min。緩沖鹽水洗2

33、次，每次5min，吹干。滴加特異性熒光抗體再用切片于37，30min。如水洗。緩沖甘油封固，鏡檢。間接法只需制備一種熒光抗體可以檢出多種抗原，敏感性較高，操作方法較易掌握，而且能解決一些不易制備動物免疫血清的病原體（如麻疹）等的研究和檢查，所以已被廣泛應用于自身抗體和感染病人血清的試驗。（三）補體法1材料（1）免疫血清60滅活20min，用Kolmers 鹽水作2倍稀釋成1：2，1：4，1：8。補體用1：10稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補體熒光抗體等，按下述的補體法染色。免疫血清補體結合的效價，如為1：32則免疫血清應作1：8稀釋。（2）補體用新鮮豚鼠血清一般作1：10稀釋或按補體結合反應試管法所測

34、定的結果，按2單位的比例，用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖鹽水中，溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。（3）抗補體熒光抗體：在免疫血清效價為1：4，補體為2單位的條件下，用補體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價，然后按染色效價1：4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。2方法步驟（1）涂片或切片固定。（2）吸取經適當稀釋之免疫血清及補體之等量混合液（此時免疫血清及補體又都稀釋一倍）滴于切片上，37作用30min，置于保持一定濕度的染色盒內。（3）用緩沖鹽水洗2次，攪拌，每次5min，吸干標本周圍水液。（4）滴加經過適當稀釋

35、之抗補體熒光抗體30min，37，水洗同（3）。（5）蒸餾水洗1min，緩沖甘油封固。3對照染色（1）抗原對照。（2）抗血清對照：用正常兔血清代替免疫血清。（3）滅活補體對照：將補體經5630min處理后，按補體同樣比例稀釋，與免疫血清等量混合后，進行補體法染色。本法之熒光抗體不受免疫血清的動物種屬的限制，因而一種熒光抗體可作更廣泛的應用，敏感性亦較間接法高，效價低的免疫血清亦可應用，節(jié)省免疫血清，尤其是對檢查形態(tài)小的如立克氏體、病毒顆粒等或濃度較低的抗原物質時甚為理想。（四）膜抗原熒光抗體染色法本法應用直接法或間接法的原理和步驟，可對活細胞在試管內進行染色，常用于T和B細胞、細胞培養(yǎng)物、瘤細

36、胞抗原和受體等的檢查和研究，陽性熒光主要在細胞膜上。FACS（流式細胞術）即采用此法原理。（五）雙重染色法在同一標本上有兩個抗原需要同時顯示（如A抗原和B抗原），A抗原的抗體用FITC標記，B抗原的抗體用羅達明標記，可采用以下染色方法：1一步法雙染色 先將兩種標記抗體按適當比例混合（A+B），按直接法進行染色。2二步法雙染色 先用RB200標記的B抗體染色，不必洗去，再用FITC標記的A抗體染色，按間接法進行。結果：A抗原陽性熒光呈現(xiàn)綠色，B抗原陽性呈現(xiàn)桔紅色熒光。（六）熒光抗體再染色法若切片或其他標本經某種熒光抗體染色后，未獲得陽性結果，而又疑有另外的病原體存在時，可用相應的熒光抗體再染色。

37、有時存檔蠟塊不能再用以切片，也可用存檔的HE染色標本，褪去蓋片和顏色，再作免疫熒光或其它免疫細胞化學的染色。三、熒光抗原染色法某些抗原可以用熒光素標記，制成熒光抗原，標記熒光素的方法與制備熒光抗體方法相同。用熒光抗原可以直接檢查細胞或組織內的相應抗體，特異性較好，敏感性較差。染色方法同熒光抗體染色的直接法。由于多數(shù)抗原難以提純或量少不昂貴，一般很少采用此法。免疫組化操作規(guī)程石蠟切片(新手適用)（一）、儀器設備1）18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫(yī)用微波爐；2）水浴鍋（二）、試劑 1）PBS緩沖液（pH7.27.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3m

38、mol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。2）0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH6.0，1000ml）：檸檬酸三鈉3g，檸檬酸0.4g。3）0.5mol/L EDTA緩沖液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA2H2O，用10 mmol/L NaOH調至pH8.0，加水至1000ml。4）1mol/L的TBS緩沖液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調至pH8.0，加水至1000ml。5）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8)配制。b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。6）3%甲醇- H2O

39、2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。7）封裱劑：a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.09.5）等量混合； b、油和TBS(或PBS)配制。 8）TBS/PBS pH9.09.5，適用于熒光顯微鏡標本；pH7.07.4適合于光學顯微鏡標本。（三）、操作流程 1、脫蠟和水化 脫蠟前，應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60恒溫箱中烘烤20分鐘。 1）組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘；2）無水乙醇中浸泡5分鐘；3）95%乙醇中浸泡5分鐘； 4）70%乙醇中浸泡5分鐘； 2、抗原修復 用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。1）抗原熱修復（1）高壓熱修復

40、在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后，去除熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。（2）煮沸熱修復 電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至95左右，放入組織芯片加熱1015分鐘。（3）微波熱修復 在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔510分鐘，反復1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2

41、，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，Topoismerase等。 2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱至37，切片也預熱至37，消化時間約為530分鐘；胃蛋白酶消化37時間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，

42、LCA，LN等?？乖迯妥⒁馐马棧?）載玻片的處理：抗原修復過程中，由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗的正常進行，可選用PES、Poly-L-Lysine等試劑，對已清洗的載玻片進行處理。具體方法如下：1.1 APES：現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留2030秒鐘，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結合的APES，置通風櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時應注意組織要一步到位，并盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結果。1.2 Poly-L-Lysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分

43、鐘，60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃制品。2）常用酶消化：2.1 胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%0.1%，消化時間為37、1040分鐘，主要用于細胞內抗原的顯示。2.2 胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時間為37、30180分鐘，主要用于細胞間質抗原的顯示，如：Laminin（層粘蛋白），Collagen IV（IV型膠原）等。2.3 皂素（Saponin）：一般使用濃度為210g/ml的saponin溶液，消化時間為室溫孵育30分鐘。m3）抗原熱修復：可根據(jù)實驗室的具體條件，選用微波爐抗原修復、高壓鍋抗原修復或水浴高溫抗原修復?？乖瓱嵝迯涂?/p>

44、選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實驗證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果最好。請選用我公司提供的ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩沖液（粉劑）配制，取該粉劑一包溶于1000ml的蒸餾水中，混勻，其pH值在6.00.1，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請自行調整。3.1石蠟切片微波爐抗原修復操作方法：切片脫蠟至水后，3H2O2處理10分鐘，蒸餾水洗2分鐘3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在9298之間并持續(xù)1015分鐘（注意：無論是使用醫(yī)用或家用微波爐，請根據(jù)具體機型酌情設置條件，務必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求

45、）。取出容器，室溫冷卻1020分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復原有的空間構型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。3.2石蠟切片高壓抗原修復操作方法：切片脫蠟至水。將1500ml3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當壓力鍋開始慢慢噴氣時（約加熱56分鐘后），計時12分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘3，下接免疫組化染色步驟。3.3石蠟切片電爐煮沸抗原修復操作方法：切片脫蠟至水后，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容

46、器中，并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達9298起開始計時1520分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻2030分鐘，蒸餾水沖洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。3、免疫組織化學染色 SP法SABC法1）脫蠟、水化；2）PBS洗23次各5分鐘；3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；4）PBS洗23次各5分鐘； 5）抗原修復；6）PBS洗23次各5分鐘；7）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。8）滴加抗50l，室溫靜置1小時或者4過夜或者371小時。9）4過夜后需在37復溫45分鐘。10）PBS洗3次各5分鐘；11）滴加

47、抗4050l，室溫靜置，或371小時；12）II抗中可加入0.05%的tween-20。13）PBS洗3次各5分鐘；14）DAB顯色510分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；15）PBS或自來水沖洗10分鐘；16）蘇木精復染2分鐘，鹽酸酒精分化；17）自來水沖洗1015分鐘；18）脫水、透明、封片、鏡檢。1)脫蠟、水化。2)PBS洗兩次各5分鐘。3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉510分鐘，蒸餾水洗3次。4)抗原修復。5)PBS洗5分鐘。6)滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。7)滴加抗，室溫1小時或者4過夜或者371小時（4過夜后在37復溫45分鐘）。8)PBS洗

48、三次每次2分鐘。9)滴加生物素化二抗，203720分鐘。10)PBC洗3次每次2分鐘。11)滴加試劑SABC，203720分鐘。12)PBS洗4次每次5分鐘。13)DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。14)蒸餾水洗。蘇木素復染2分鐘、鹽酸酒精分化。 15)脫水、透明、封片、鏡檢。免疫組化中抗原修復技術的應用及注意事項福爾馬林固定時，組織中的許多氨基酸殘基在分子內或分子間形成了醛鍵，使得不少抗原決定簇被封閉。同時，由于甲醛的聚合作用，使蛋白質分子間相互交聯(lián)形成大分子網(wǎng)絡，也導致了抗原決定簇被掩蓋，這就使得相當部分的抗原不能與抗體很好是進行反應。因此，抗原修復也是影

49、響免疫組化染色結果的基本因素?？乖迯?Antigen retrieval ，AR)技術，建立在Fraenkel-conrat等人1一系列生物化學研究，經1991年shi等人2發(fā)展?？乖迯褪侵甘?、冰凍、火棉膠、塑料切片免疫組織化學（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性劑、微波緩沖液和金屬鹽等，使被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢復過程。抗原修復能最大程度地恢復在制片等過程中損失的抗原性，使原來認為不能在石蠟切片上進行IHC的許多抗體獲得了良好的染色結果，成為一種有效的補救措施。本文的目的是概述AR-HIC的發(fā)展、應用和標準化。一、AR技術加熱AR技術微波加熱方法

50、. 在傳統(tǒng)標準方法，經脫蠟、脫水和用3%H2O2阻斷內源性過氧(化)物酶，石蠟切片經蒸餾水沖洗，放置在塑料Coplin缸中。加入AR液，如蒸餾水、緩沖液、金屬鹽液、尿素等，蓋上并置家用微波爐加熱5或10分鐘（注意防止切片干躁）。有時在加熱5分鐘后，間隔1分鐘，再加熱5分鐘（在第一個5分鐘后檢測液體高度）。加熱后，從微波爐取出塑料Coplin缸，冷卻15分鐘。片子經蒸餾水沖洗二次后在PBS液中浸5分鐘，才進行IHC染色。為了保持一致的加熱條件，必須設定靠近微波爐中心相同的位置及同一編號的Coplin缸 ，按照不同的抗體設定不同的加熱時間，盡可能的建立標準的加熱條件。微波（MW）加熱過程如下：在專

51、用盒內放入200ml檸檬酸緩沖液（PH6.00.1），并蓋上帶有小孔的蓋子，微波加熱至沸騰；將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架中，放入已沸騰緩沖液中，有作者提供做免疫組化時采用微波爐中等功率800W3，微波爐選用解凍檔的國產家用微波爐(根據(jù)目前的研究，建議用醫(yī)用微波爐)，中檔繼續(xù)處理10-20分鐘；取出微波塑料缸冷卻至室溫，從緩沖液中取出玻片，片子經蒸餾水沖洗二次，之后用PBS（PH7.2-7.4）沖洗兩次，每次3分鐘。盡管有少數(shù)作者4認為經高溫后冷卻這一步省略。在我們觀點，15分鐘的冷卻必須的幾點理由：1、如這一步省略，對于有些抗體而言，會降低AR-IHC染色強度。2、突然從高溫到低

52、溫可導致組織片掉片。3、可能引起形態(tài)學的變化。 單純加熱方法. 將切片放入盛有檸檬酸緩沖液的容器中，置電爐（600W）上加熱至沸騰，并持續(xù)10min 。Shi等人2用單純加熱方法與微波加熱方法比較IHC染色強度，顯示兩種方法導致相同的染色強度。高壓加熱方法. Shin等人5發(fā)展了含水高壓鍋煮沸方法，來增強福爾馬林固定的腦組織tau蛋白免疫反應性。將切片連同檸檬酸緩沖液放入高壓鍋內，加熱至產生噴氣，并持續(xù)2min，壓力鍋離開熱源，加熱長短的控制很重要，從組織切片放入緩沖液到高壓鍋到壓力鍋離開熱源總時間在5-8分鐘，時間過長可能會使染色背景加深?，F(xiàn)試劑公司提供的大多數(shù)抗體都建議使用高壓鍋煮沸方法，

53、這幾年的實踐表明，采取此方法可避免假陽、陰性，使IHC染色效果更佳。非加熱AR技術非加熱AR技術包括酶消化、酸水解等方法。目前，主要是酶消化，酶消化是以化學的方法來打斷醛鍵，修復抗原。胰蛋白酶消化法.取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入100ml0.05或0.1PH7.8的無水氯化鈣水溶液中，溶解即可；或由邁新提供的0.125%的液體胰酶。將切片放入濕盒內37oC溫箱中消化18-20分鐘。 胃蛋白酶消化法 . 用0.1mol/L HCL配制成0.4的胃蛋白酶；鏈霉蛋白酶消化法 . 將鏈霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL中，濃度為o.1，消化時間20min。抗原修復的方法選擇

54、，關系到組織抗原能否暴露充分，這對免疫組化染色效果有很大影響。因此應當根據(jù)不同的抗原特點，采用不同的修復方法。對某些細胞內抗原（如Fas、Bax、F等）和細胞間質抗原（如Laminin、CoIV等）則需要用酶消化法處理切片。常用的消化酶為胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般說來，胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱，主要用于細胞內抗原的消化，胃蛋白酶主要用于細胞間抗原的消化。工作中要認真參照抗體說明書指示進行消化酶的選擇，這樣針對性更強，標記效果更理想。 總之，以高壓加熱方法、微波加熱方法較為穩(wěn)定， 高壓加熱方法效果優(yōu)于微波加熱方法和單純加熱方法。溶液的濃度對修復效果無任何影響，而PH值則影響較大。緩沖液以檸檬酸

55、緩沖液和Tris-HCL較常用。前人的研究表明，溫度高修復時間短6。解放軍第251醫(yī)院根據(jù)臨床病理診斷、鑒別診斷和研究的實際需要，在抗原修復方法規(guī)范研究和應用的基礎上，創(chuàng)用了胰蛋白酶尿素聯(lián)合消化技術、鹽酸水解暴露抗原技術和MW表面活性劑Triton X100（MWTX）修復抗原技術 7 。抗原暴露或抗原修復方法較多，其中發(fā)MW枸櫞酸緩沖液使用較多，效果最好。MW修復抗原的方法是石蠟切片脫蠟、水洗后放入修復液中，用250W的輸出功率2X5min，待冷卻至室溫按常規(guī)處理。目前AR過程已成功應用在BioTek全自動免疫組化染色儀中。二、AR應注意的問題加熱持續(xù)時間和強度是重要的影響因素之一，AR液的PH值、濃度、化學成分也是重要的影響因素之一。使用低PH值AR液必須使用陰性對照片，以防止定位不準9。Shi等人10強調修復緩沖液的PH值對某些抗原的修復十分重要，實驗中我們也發(fā)現(xiàn)要獲得滿意結果必須選擇抗原修復液的最適PH值。在常規(guī)石蠟切片做AR-IHC，采用不同濃度的Alcl3液做AR液，發(fā)現(xiàn)4%的Alcl3取得最理想的染色11。在修復的抗原中，金屬鹽可影響蛋白的結構。鄭輝等人12使用0.01mmol/LPBS、0.01mol/L檸檬酸緩沖液、0.1mol/L Tris-HCL緩沖液及1mmol/L EDTA-Na2，于微波修復抗原，發(fā)現(xiàn)其陽性強度逐漸增強。高溫抗原