潘多拉美 膠原三肽補充劑對紫外線暴露無毛小鼠光老化和皮膚表皮屏障作用的影響

1、3Hee-Bong Pyun等人PrevNutr Food Sci第17卷，第245-253頁（2012年）http：/dx.doi.Org/10.3746/pnf.2045膠原三肽補充劑對紫外線暴露無毛小鼠光老化和皮膚表皮屏障作用的影響Hee-Bong Pyun1、Minji Kim1、Jieun Park2、Yasuo Sakai3、Noriaki Numata3、Jin-Yeong Shin4、Hyun-Jung Shin4、Do-Un Kim5和Jae-Kwan Hwang1,2t生物材料科學與工程系2延世大學生命科學與技術學院生物技術部，韓國首爾120-7493中央

2、研究所，Jellice有限公司，日本仙臺宮城984-0826，4愛茉莉太平洋研發(fā)中心，韓國京畿道446-7295友川有限公司食品研發(fā)中心，韓國京畿道462-120摘要作為一種功能性食品材料的膠原三肽（CTP）具備了某些生物效，其中包括改善皮膚干燥和愈合傷口和骨折。本研究的重點是CTP在無毛小鼠模型中的抗光老化作用。為了評價CTP對體內UVB誘導皮膚皺紋形成的影響，我們在14周內江無毛小鼠暴露于紫外線B之下并為其注入CTP。與未處理的UVB對照組相比，經(jīng)過CTP處理的小鼠的皺紋形成和皮膚增厚以及經(jīng)皮水分損失（TEWL）有了顯著降低。CTP治療組的皮膚水分和羥脯氨酸都有所增加。此外，CTP口服還能

3、防止UVB誘導的MMP-3和-13的活動以及MMP-2和-9的表達。CTP內部可增加皮膚彈性，減少彈性纖維結構異常。CTP治療組的紅斑亦有明顯下降?？偟膩砜催@些結果強烈表明CTP有作為防光老化劑的潛力。關鍵詞：膠原三肽（CTP）、光老化、基質金屬蛋白酶（MMPs）、經(jīng)表皮失水（TEWL）、皺紋形成引言遺傳學，紫外線（UV）輻射、機械應力，激素改變（1）等許多因素可以導致人類皮膚的老化。因此，皮膚老化過程可以分類為內在老化或光老化。光老化是指慢性暴露于紫外線輻射（特別是其UVB成分）引起的皮膚過早老化，這被看作是導致皮膚損傷（2）的主要原因。光老化的特征包括細顆粒和粗皺紋、皮膚干燥、粗糙、膚淺、

4、斑駁色素沉著、組織學改變和各種皮膚變化，包括皮膚屏障功能改變等（3）?；|金屬蛋白酶（MMP）是一個由24種鋅依賴性蛋白水解酶組成的家族。作為一種在結構上與基質降解酶相關的家族，MMP在各種破壞性過程中發(fā)揮了重要的作用，其中包括炎癥、腫瘤侵襲和皮膚老化等。鑒于蛋白酶參與皮膚光老化過程，規(guī)范其活動可以被作為預防和治療紫外線引起的皮膚損傷的策略（4,5）。一旦人或小鼠的皮膚暴露于UV輻射，MMP-1（間質膠原酶）的合成就會被誘導，此后會降低I型和III型膠原蛋白；MMP-3（溶基質素-1）降解基底膜IV型膠原，同時MMP-9（明膠酶）進一步降解由MMP-1產(chǎn)生的膠原片段。小鼠缺乏MMP-1基因，具

5、體功能由MMP-13（6）代替。由于其保濕和增強彈性的功效，膠原已被用作皮膚功能成分。最近的研究已經(jīng)表明，蛋白質水解獲得的肽，如膠原蛋白水解物等，還是有效的皮膚增濕和抗皺劑（7）。據(jù)此前報道，誤服膠原蛋白或膠原蛋白多肽具有有效的抗氧化劑對皮膚保護作用，同時對于骨關節(jié)炎和骨質疏松（8,9）也有益處。在這項研究中，我們評估了鯰魚皮膚獲得的CTP對于紫外線導致的皮膚損傷的影響，為了揭露肌膚保濕和抗皺效果以及作為潛在新功能的美容食品原料膳食成分的底層機制，我們使用了無毛小鼠模型進行研究（10,11）。作者通訊信息。電子郵件：jkhwangyonsei.ac.kr 電話：+82-2-2123-5881，

6、傳真：+82-2-362-7265材料和方法材料CTP需要通過低眼巨鯰（低眼巨鯰）皮膚派生膠原酶降解獲得，具體產(chǎn)品由Jellice有限公司提供（產(chǎn)品名為HACP-CF）。CTP包含15.0的三肽甘氨酸-Xaa-Yaa（Xaa和Yaa可以任意組合，但最常見的是脯氨酸、羥基脯氨酸和丙氨酸組合），這些物質可以作為生物活性化合物。動物實驗我們從DeahanBiolink有限公司（Eumsung，韓國）購買了五周齡的雌性無毛小鼠（SKH-1）并將其飼養(yǎng)在溫度為（23±2）、濕度為（55±10）和光照（白天12小時/夜晚12小時）受控條件下（延世實驗動物研究中心，YLARC，首爾，韓國

7、）。五只小鼠被分配給每個小組（共有四組）：1）正常組（對照）、2）UVB照射組（UVB對照）、3）紫外線照射和167毫克/公斤/天的CTP治療組（CTP-167）、4）紫外線照射和333毫克/公斤/天的CTP處理組（CTP-333）。在14周內，治療組中的小鼠每天接受口服CTP并每周三次暴露在UVB輻射下。UVB照射的起始劑量為第一周的75毫焦/平方厘米，此后每周按最小紅斑量增加1個劑量（MED）直至增加至3 MED并由此保持到實驗結束。14周后，小鼠將被殺死，屆時將對其腹腔注射zoletil（維克，卡羅，法國）和甲苯噻嗪（拜耳韓國公司，首爾，韓國）的混合麻醉劑。從背部皮膚獲得的樣品在液氮中快

8、速冷凍并儲存于-70環(huán)境下。用于組織學分析的皮膚活檢樣品被固定在10緩沖的福爾馬林以便用光學顯微鏡進行觀察。逆轉錄 - 聚合酶鏈反應（RT-PCR）使用PCR預混料和表1所示引物（BIONEER，大田，韓國）進行cDNA產(chǎn)物的PCR擴增（5微升）（ELPIS生物技術，大田，韓國）。在PCR擴增之前，產(chǎn)物在94下變性5分鐘。擴增由25個循環(huán)組成：在94下變性30秒，在56下退火1分鐘，在72延伸1分鐘，最終在72下再延伸5分鐘。PCR反應在Gene Amp 2700 PCR系統(tǒng)中執(zhí)行（Applied Biosystems，福斯特城，加利福尼亞州，美國）。PCR產(chǎn)物通過1.5瓊脂糖凝膠電泳分離，此

9、后通過6X Loading STAR可視化方案和紫外線照射完成可視化（達因生物，崇南，韓國）。免疫印跡分析用蛋白酶抑制劑混合物裂解勻漿皮膚切片中蛋白萃取劑（NP40，ELPIS生物技術）（Aldrich公司，圣路易斯，密蘇里州，美國）。蛋白質濃度通過Bradford蛋白測定法（12）測定。對于免疫印跡，應通過10十二烷基硫酸鈉 - 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對等量蛋白質（30微克）進行分離并用5脫脂乳在Tris緩沖Tween-20（TBST）鹽水中進行堵塞處理。此后用初級抗體進行膜檢測，對應的物質為MMP-3、MMP-13和微管蛋白（Cell Signaling公司，貝弗利，MA，

10、美國）。通過辣根過氧化物酶連接的第二抗體檢測結合的抗體（BETHYL Laboratories公司，蒙哥馬利，TX，USA）。用增強的化學發(fā)光（ECL）檢測系統(tǒng)進行蛋白檢測（安瑪西亞生物科學公司，Little Chalfont，英國），此后通過LuminoImager完成可視化（LAS3000生物成像分析系統(tǒng)，富士膠片，東京，日本）。明膠酶譜MMP-2和-9活性通過明膠酶譜評估。樣品用含有2SDS（無P-巰基乙醇并加載于無需事先加熱的凝膠上）的標準凝膠上樣緩沖液混合。在85 V下于含有SDS和1明膠的10聚丙烯酰胺凝膠中通過電泳分離樣品（2小時），使用的設備為Bio-Rad Mini PROT

11、EAN 3 細胞電泳設備（Bio-Rad公司實驗室，Hercules，CA，USA）。電泳后，用2.5的Triton X-100將凝膠清洗1小時并于37下在含有10mM氯化鈣和0.15 M氯化鈉的緩沖液（50mM的Tris-鹽酸pH為7.5中對其進行反應。24小時后使用Coomassie?亮藍R-250對凝膠進行染色（Fluka公司，布克斯，瑞士），然后用30甲醇和10乙酸脫色。在72 kDa和92 kDa中分別檢測到MMP-2和MMP-9（對應黑暗背景的清晰區(qū)域）。MMP-3正向5'-TAG CAG GTTATC CTA AAA GCA-3'反向5'-CCA GCT

12、ATTGCT CTT CAA T-3'小鼠MMP-13正向5'-CAT CCA TCCCGT GAC CTT AT-3'反向5'-GCA TGA CTCTCA CAA TGC GA-3'P-Actin正向5'-CCA GCC AGCCAC CAT CGC TC-3'反向5'-TGA CCT TGGCCA GGG GTG CA-3'表1。小鼠基因正向和反向的引物組的核苷酸序列宿主基因引物序列3Collagen Tripeptide and Photoaging皮膚皺紋形成的評估在14周CTP處理后用數(shù)碼相機拍攝麻醉無毛小鼠的

13、背部皮膚（尼康P80，尼康，東京，日本）。用Replica測量皮膚表面印象（Epi-gem，韓國首爾）并使用Visioline VL650（CK電子有限公司，德國科?。ζ溥M行分析。組織學分析殺死小鼠后，其皮膚樣品固定在10馬林中放置24小時并蘇木精和伊紅（HE）和馬松三色以及Verhoeff-van Gieson染色進行染色。使用采用雙CCD攝像機的Eclipse TE2000U倒置顯微鏡對染色切片進行分析（尼康）。紅斑評估基于緩解原則（12）使用Mexameter®18設備（CK電子有限公司）對皮膚紅斑的光度進行測量。皮膚含水量與經(jīng)皮水分損失的評估（TEWL）用Corneomet

14、er®825測定皮膚水分。作為表皮皮膚屏障功能標志物的TEWL則用Tewameter®TM300進行測量，該裝置被安裝在多探頭Adapter®MPA5設備上（CK電子有限公司）。羥脯氨酸檢測在1毫升的6N HCl中用玻璃珠對皮膚組織（600毫克）進行勻漿并在105下水解18小時（14）。用羥脯氨酸檢測試劑盒（QuickzymeBiosci¬ence，萊頓，荷蘭）測定羥脯氨酸含量。皮膚彈性的評估使用Cutometer®MPA580（CK電子有限公司）評估皮膚彈性。相關具體物理參數(shù)如下：直接膨脹（UE）、最終腹脹（UF）、立即回縮（UR）、延遲腹脹

15、（UV）、最終回縮（UA）。皮膚彈性與總彈性（UA/ UF）計算值代表恢復初始狀態(tài)的速度（15）。統(tǒng)計分析結果表示為平均值±標準偏差（SD）。各組間通過薛費測試和鄧肯檢驗進行比較（SPSS12.0，SPSS公司，芝加哥，伊利諾伊州，美國）。 # P <0.01，P<0.05，* P <0.01和* P <0.05被認為具有統(tǒng)計學顯著性。結果與討論CTP口服對UVB引起的皺紋形成的效果有報道證明無毛SKH-1小鼠是觀察人體皮膚在急性UV暴露下關鍵解剖和細胞反應的合適動物模型（16）。為了研究CTP體內抗光老化作用，無毛SKH-1小鼠被用于研究光老化的標志，例如皮

16、膚的厚度、皮膚水化、TEWL、蛋白酶、膠原和彈性纖維。在實驗期間，我們每周測量小鼠的體重，結果顯示各組（圖1）之間沒有差別。因此，UVB照射和CTP處理對體重沒有影響。重復UVB紫外線輻射會引起表皮發(fā)生相關變化，其中包括皺紋加深和粗糙化（17）。由此我們通過對皮膚復制品的攝影分析調查了CTP對UVB誘導的表皮變化的效果（圖2）。紫外線誘導導致UVB對照組的背部皮膚形成顯著的皺紋。然而，CTP口服給藥可以減少由UVB輻射（圖3）引起的皺紋形成。CTP可以抑制蛋白酶，例如膠原酶（MMP-3和-13）和明膠酶（MMP-2和-9）等。這些結果表明，CTP可以通過減少MMP表達減少細胞外基質膠原降解（E

17、CM）并由此降低體內皺紋形成。CTP口服對皮膚厚度的效果在殺死前通過測量卡尺測量無毛小鼠的皮膚厚度。組織病理學改變通過HE染色觀察。UVB輻射導致了皮褶厚度的顯著增加（1.1毫米）。圖1. 紫外線照射無毛小鼠的體重變化。14周內對小鼠施用CTP并一周三次將其暴露在UVB輻射下?？刂平M、車輛+非UVB照射；UVB控制組，車輛+ UVB照射；CTP-167，167毫克/千克/天的CTP+ UVB照射，CTP-333，333毫克/千克/天的CTP+ UVB照射。數(shù)據(jù)表示為每組5只小鼠的平均值±SD。圖2. 口服CTP對紫外線照射無毛小鼠皺紋形成的影響（照片和總外觀）。14周內每周三次將無毛

18、小鼠背部皮膚表面暴露于紫外線下。殺死前應拍攝無毛小鼠背部區(qū)域的照片。然而，與UVB對照組（圖4A）相比，CTP治療組（167或333毫克/公斤/天）的皮褶厚度分別減少了0.93毫米和0.84毫米。通過組織切片HE染色可完成UVB誘導表皮厚度的可視化。類似于皮褶厚度的結果，CTP處理組的皮膚厚度比UVB對照組（圖4B）更薄。兩者合計結果表明，CTP治療組的皮褶厚度有顯著下降。CTP口服給藥對皮膚屏障功能的影響UVB輻射引起的皮膚損傷，導致皮膚脫水并增加TEWL。皺紋形成的機制都與水含量降低、神經(jīng)酰胺和乙酰透明質酸相關（18）。如圖5A所示，與對照組相比，UVB對照組的皮膚水分要低51.7。然而，

19、與UVB對照組相比，CTP處理組的皮膚水含量（167或333毫克/公斤/天）分別增加了最多38.7和65.8。與未照射組相比，UVB對照組TEWL水平增長127.2，但（與UVB對照組（圖5B）比較）CTP處理組的TEWL水平（167或333毫克/公斤/天）分別降低了最多22.7和40.5。防止TEWL可維持皮膚水含量并由此影響皮膚的屏障功能。增強皮膚的屏障功能可改善皮膚皺紋（19,20）。因此，CTP通過降低TEWL和增加皮膚水分而對皮膚屏障功能的改善產(chǎn)生有益效果并由此減少了皮膚皺紋。CTP口服給藥對膠原纖維的影響5Collagen Tripeptide and Photoaging圖3.

20、CTP口服給藥對紫外線照射無毛小鼠（皺紋值）皺紋形成的影響。14周內將無毛小鼠背部皮膚表面暴露于紫外線下（每周三次）。通過皮膚復制品表面獲得皺紋值。數(shù)據(jù)表示為每組5只小鼠的平均值±SD。與非UVB照射的小鼠相比# P <0.01；與UVB照射小鼠相比P <0.01。249Collagen Tripeptide and Photoaging249Collagen Tripeptide and Photoaging249Collagen Tripeptide and Photoaging圖4. 口服CTP對紫外線照射無毛小鼠皮膚厚度的影響。（A）皮膚組織切片用HE染色。（B）

21、皮褶厚度在14周時對頸部和臀部中間位置用卡尺測量。數(shù)據(jù)表示為每組5只小鼠的平均值±SD。與非UVB照射的小鼠相比# P <0.01；與UVB照射組相比* P<0.01。249Collagen Tripeptide and Photoaging5Collagen Tripeptide and Photoaging圖5. 口服CTP對紫外線照射無毛小鼠皮膚屏障功能的影響。（A）皮膚水合和（B）TEWL作為皮膚屏障功能的標志物在動物處死前三天由Corneometer®和Tewameter®測量。數(shù)據(jù)表示為每組5只小鼠的平均值±SD。與非UVB照射的

22、小鼠相比# P <0.01；與UVB照射小鼠相比P <0.01。在皮膚老化過程中，真皮膠原蛋白（21）的減少導致膠原蛋白包子萊空間密度降低。此外在自然老化及光老化皮膚中都可以觀察到膠原纖維的降解。通過測定羥脯氨酸的含量可以估算出膠原的總量。羥脯氨酸是膠原蛋白特有氨基酸并被用作估計膠原含量的因子。用Masson三色染色法染色觀察背皮膚膠原纖維的變化并使用羥脯氨酸檢測試劑盒測定羥脯氨酸含量。如圖6所示，UVB照射導致膠原纖維減少，但通過CTP治療可以恢復。CTP口服給藥對UVB誘導MMP-3和-13活動的影響通過蛋白酶消化的真皮層膠原蛋白的降解會導致較深的皺紋。要了解CTP如何抑制UV

23、B引起的皺紋形成，需要用RT-PCR和蛋白質印跡分析確定MMP的表達。與UVB對照組（圖7A）相比較，CTP治療組的MMP-3和-13 mRNA表達（333毫克/千克/天）分別減少了最高44.7和42.9。此外，333毫克/公斤/天CTP治療組的UVB誘導MMP-3和-13蛋白的表達分別降低了48.5和36.8（圖7B）。UVB誘導MMP-3和-13涉及到I、III和IV型膠原的降解。UVB輻射增加了無毛小鼠皮膚中的MMP-3和-13表達，而CTP口服治療對這種效果有顯著的反制作用。因此，CTP通過抑制MMP的表達可抑制真皮層膠原蛋白分解并減少皺紋的形成。CTP口服給藥對UVB誘導MMP-2和

24、-9活動的影響5Hee-Bong Pyun等人圖6.CTP口服給藥對紫外線照射無毛小鼠膠原纖維的影響。（A）用Masson三色染色法對皮膚組織切片的膠原纖維進行染色。（B）UVB輻射14周后估算羥脯氨酸的數(shù)量。數(shù)據(jù)表示為每組5只小鼠的平均值±SD。與非UVB照射的小鼠相比# P <0.01；與UVB照射小鼠相比P <0.01。250Hee-Bong Pyun等人250Hee-Bong Pyun等人圖7. 紫外線照射無毛小鼠口服CTP對UVB誘導MMP-3和-13表達的影響。MMP-3和-13的mRNA水平（A）和蛋白水平（B）分別通過RT-PCR和免疫印跡分析來確定。數(shù)據(jù)

25、表示為每組5只小鼠的平均值±SD。與非UVB照射的小鼠相比# P <0.01；與UVB照射小鼠相比* P<0.01 。251Collagen Tripeptide and Photoaging>03251Collagen Tripeptide and Photoaging圖8. CTP口服給藥對紫外線照射無毛小鼠UVB誘導MMP-2和-9活性的影響。等量蛋白質裂解物中MMP-2和-9的活性需通過明膠酶譜法進行分析。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，分別對應各組中的五只小鼠。與非UVB照射的小鼠相比# P <0.01；與進行UVB照射的小鼠相比* P <

26、0.05，* P <0.01。UVB誘導的MMP-2和-9（明膠酶）活性在UVB誘導的皮膚損傷（包括皮膚增厚和皺紋形成（4）中可發(fā)揮重要的作用。為確定CTP是否能抑制UVB誘導MMP-2和-9活動，我們使用明膠酶譜法對無毛小鼠背部皮膚進行了評估。與UVB對照組（圖8）相比較，CTP治療組（167或333毫克/公斤/天）的MMP-2和-9活動分別減少了最多22.18和19.18。CTP口服給藥可顯著抑制UVB誘導的MMP-2和-9的活化。因此，通過抑制MMP-2和-9的活化，CTP可抑制真皮層膠原蛋白的分解并減少皺紋形成。CTP口服給藥對彈性纖維的影響體內研究表明UVB輻射會激活彈性蛋白啟

27、動子并由此增加光老化皮膚中彈性蛋白的產(chǎn)生和異常彈性纖維的積累（22）。此外，紫外線照射會導致皮膚彈性降低，減少皮膚的彈性纖維的線性度和膠原損耗，同時增加皺紋的形成（23）。為驗證CTP與彈力之間的關聯(lián)，我們通過Cutometer®測量皮膚彈性并使用Verhoeff-van Gieson染色法對彈性纖維進行染色。CTP的服用可增加皮膚彈性（圖9A）并減少異常彈性纖維形成（圖9B）。彈性蛋白和膠原蛋白結合可產(chǎn)生肌膚抗張強度和彈性（24）。因此通過抑制異常彈性纖維的產(chǎn)生和膠原降解（25）就可增強彈性。這些結果表明，CTP治療可以抑制異常彈性纖維的積累和膠原的降解，由此導致皮膚彈性增加。CT

28、P還能通過抑制蛋白酶產(chǎn)生防止膠原蛋白分解，從而增強與膠原蛋白和彈性蛋白合成相關的皮膚彈性。7Collagen Tripeptide and Photoaging7Collagen Tripeptide and Photoaging圖9. 口服CTP對紫外線照射無毛小鼠皮膚彈性的影響。（A）CTP對皮膚總彈性的影響（UA/ UF）由Cutometer?測量。（B）在真皮彈性纖維通過維爾赫夫氏染色法染色。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，分別對應各組中的五只小鼠。與非UVB照射的小鼠相比# P <0.01；與UVB照射小鼠相比* P<0.01。圖10. CTP口服給藥對紫外線照射無毛

29、小鼠紅斑形成的影響。紫外線照射14周后，通過Mexameter®確定紅斑。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，分別對應各組中的五只小鼠。與非UVB照射的小鼠相比# P <0.01；與UVB照射小鼠相比* P<0.01。CTP口服給藥對UVB引起的紅斑的影響紫外線照射引起的紅斑的臨床特征為網(wǎng)狀色素，組織學特征為彈性纖維（26）變性。通過UVB輻射可以導致小鼠背部皮膚形成皺紋紅斑，因而UVB誘導的紅斑是評估皺紋形成的合適因子（27）。與非UVB照射組相比，UVB對照組的紅斑形成增加了46.94。與UVB對照組（圖10）相比較，CTP治療組（167或333毫克/千克/天）紅斑分

30、別降低了最多13.32和21.55。因此，CTP口服給藥對UVB引起紅斑的影響可能會與抗皺效果相關聯(lián)。由于CTP可以抑制UVB誘導的MMP表達并防止皺紋的形成，口服CTP具有作為抗光老化劑的潛力。然而，CTP如何影響UVB誘發(fā)的皮膚老化的分子機制仍然有待研究。最后，本研究表明CTP可以抑制MMP-2、-3、-9和-13的表達并由此減少UVB誘導的皮膚厚度增加和皺紋的形成。這些發(fā)現(xiàn)證明CTP有可能減輕UVB誘發(fā)的皮膚老化。參考文獻1. Mukherjee S、 Date A、Patravale V、Korting HC、RoederA、Weindl G. 2006. 維甲酸對皮膚老化的治療：臨床

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