生物體液_快速萃取

1、生物體液中小分子組分快速樣品前處理新技術(shù)關(guān)亞風(fēng)關(guān)亞風(fēng)中科院大連化學(xué)物理研究所中科院大連化學(xué)物理研究所2015.12.28 工作匯報(bào)：工作匯報(bào)：匯報(bào)內(nèi)容一、原位活體前處理新技術(shù)一、原位活體前處理新技術(shù)二、植物激素分析新技術(shù)二、植物激素分析新技術(shù)1-1 1-1 動(dòng)物活體原位萃取動(dòng)物活體原位萃取1-2 1-2 植物活體原位萃取植物活體原位萃取 2-1 2-1 赤霉素赤霉素2-2 2-2 油菜素內(nèi)脂油菜素內(nèi)脂原位活體前處理方法原位活體前處理方法原位活體前處理方法p 對(duì)原位前處理方法的要求對(duì)原位前處理方法的要求原位活體前處理方法方法成熟方法成熟目標(biāo)物分布廣目標(biāo)物分布廣膜吸附疏水目標(biāo)物膜吸附疏水目標(biāo)物僅有

2、分子量選擇性僅有分子量選擇性具有豐富的化學(xué)選擇性具有豐富的化學(xué)選擇性結(jié)構(gòu)簡單操作方便結(jié)構(gòu)簡單操作方便不夠成熟不夠成熟材料容量和方法靈敏度不夠材料容量和方法靈敏度不夠原位固相微萃取的萃取材料至關(guān)重要！且有待改進(jìn)！Anal. Chem. 2013, 85, 38283831原位活體前處理方法p對(duì)原位萃取材料的要求對(duì)原位萃取材料的要求原位活體前處理方法難點(diǎn)p對(duì)原位萃取材料的要求對(duì)原位萃取材料的要求萃取速度取決于動(dòng)力學(xué)過程萃取速度取決于動(dòng)力學(xué)過程傳質(zhì)速率！傳質(zhì)速率！u 生物體液的粘度較高，分子運(yùn)動(dòng)速度相對(duì)很慢生物體液的粘度較高，分子運(yùn)動(dòng)速度相對(duì)很慢u 成分極其復(fù)雜，分子量從幾十到幾十萬成分極其復(fù)雜，分

3、子量從幾十到幾十萬u 萃取材料表面易被蛋白、細(xì)胞粘合而失效萃取材料表面易被蛋白、細(xì)胞粘合而失效u 萃取材料表面積要足夠大才可能有足夠的萃取吸附容量萃取材料表面積要足夠大才可能有足夠的萃取吸附容量 我們的基本思路是：制做亞微米級(jí)復(fù)合纖維，壓制成我們的基本思路是：制做亞微米級(jí)復(fù)合纖維，壓制成纖維氈，具有通透的空間和巨大的比表面積纖維氈，具有通透的空間和巨大的比表面積萃取面萃取面積積p靜電紡絲材料原理靜電紡絲材料原理靜電紡絲材料裝置結(jié)構(gòu)裝置結(jié)構(gòu)錐端電荷分布錐端電荷分布非穩(wěn)態(tài)成絲過程非穩(wěn)態(tài)成絲過程/wiki/Electrospinning靜電紡絲材料的形貌膜

4、形貌調(diào)控膜形貌調(diào)控絲排列調(diào)控絲排列調(diào)控Adv. Healthcare Mater. 2012, 1, 1025靜電紡絲材料的應(yīng)用可降解組織工程支架可降解組織工程支架Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 9543 9546納米催化劑載體納米催化劑載體靜電紡絲材料有靜電紡絲材料有作為原位萃取材作為原位萃取材料的潛力！料的潛力！萃取相表面積大，萃取容量大；表面積大，萃取容量大；灌孔利于傳質(zhì)；灌孔利于傳質(zhì)；材料整體性高，利于原位引入。材料整體性高，利于原位引入。靜電紡絲材料萃取相萃取相體積小，空間分辨率高萃取相體積小，空間分辨率高纖維針的形式引入原位容易纖維針的形式引入原位容

5、易二維萃取結(jié)構(gòu)使傳質(zhì)速率二維萃取結(jié)構(gòu)使傳質(zhì)速率二維萃取結(jié)構(gòu)萃取容量有限二維萃取結(jié)構(gòu)萃取容量有限核殼結(jié)構(gòu)的電紡絲材料核層核層殼層殼層l聚（聚（N-N-異丙基）丙烯酰胺異丙基）丙烯酰胺強(qiáng)的親水性強(qiáng)的親水性生物兼容性生物兼容性抗蛋白和細(xì)胞吸附能力抗蛋白和細(xì)胞吸附能力l聚苯乙烯聚苯乙烯強(qiáng)的吸附能力強(qiáng)的吸附能力水中穩(wěn)定性高水中穩(wěn)定性高易于電紡易于電紡p 材料結(jié)構(gòu)材料結(jié)構(gòu)Q. Wu, D.P. Wu , Y.F. Guan, Anal. Chem. 2013, 85, 59245932核殼結(jié)構(gòu)的電紡絲材料SEMSEM：200nm200nm左右的纖維左右的纖維100 nm12.7nm12.7nmTEMTEM

6、：明顯的殼層：明顯的殼層CACA：強(qiáng)的親水性：強(qiáng)的親水性p 材料表征材料表征XPSXPS：表面：表面PNIPAAmPNIPAAm的含量為的含量為80%80%核殼結(jié)構(gòu)的電紡絲材料CellsCellsSmall molecules (free drugs)ProteinsProteinsp 抗污染能力抗污染能力l親水層，排阻大分子！lPS萃取小分子藥物！核殼結(jié)構(gòu)的電紡絲材料核殼電紡絲核殼電紡絲純純PSPS電紡絲電紡絲C18C18硅膠填料硅膠填料p 抗蛋白能力抗蛋白能力HSAHSA的峰的峰高分子區(qū)無峰！高分子區(qū)無峰！核殼結(jié)構(gòu)的電紡絲材料p 抗細(xì)胞能力抗細(xì)胞能力浸泡全血后的核殼結(jié)構(gòu)電紡絲浸泡全血后的核

7、殼結(jié)構(gòu)電紡絲浸泡全血后的純浸泡全血后的純PSPS電紡絲電紡絲核殼結(jié)構(gòu)的電紡絲材料p 共萃物對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)的干擾共萃物對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)的干擾相對(duì)相對(duì) 響應(yīng)響應(yīng)100%100%左右，基本無基質(zhì)產(chǎn)生的左右，基本無基質(zhì)產(chǎn)生的電離抑制或增強(qiáng)電離抑制或增強(qiáng)Q. Wu, D.P. Wu , Y.F. Guan, Anal. Chem. 2013, 85, 59245932游離藥直接萃取應(yīng)用p 游離藥測(cè)定工作曲線游離藥測(cè)定工作曲線隨血漿的加入，蛋白結(jié)合使游離藥含量下降，工作曲線斜率下降Q. Wu, D.P. Wu , Y.F. Guan, Anal. Chem. 2013, 85, 59245932游離藥直接萃取應(yīng)用p

8、 l a s m a proteinbinding %plasma15% plasmaliterature valueaberberine90.6%81.1%88%amitriptyline86.8%76.9%80%desipramine90.7%51.5%82%propranolol66.3%34.2%63-74.9%Intermediate 188.6%54.3%Intermediate 2-83.1%Intermediate 329.8%18.5%Intermediate 479.5%0.53%p 藥物與血漿蛋白的結(jié)合率測(cè)定藥物與血漿蛋白的結(jié)合率測(cè)定Q. Wu, D.P. Wu , Y.

9、F. Guan, Anal. Chem. 2013, 85, 59245932p 快的平衡速度快的平衡速度l親水殼層親水殼層使得每根纖維都完全與樣品接觸使得每根纖維都完全與樣品接觸具有最大的傳質(zhì)面積具有最大的傳質(zhì)面積A Al納米纖維和納米殼層納米纖維和納米殼層 使得纖維上的擴(kuò)散層厚度大大減小使得纖維上的擴(kuò)散層厚度大大減小 具有大的傳質(zhì)系數(shù)具有大的傳質(zhì)系數(shù) ateenn1) 1(asSVKVVAaD游離藥的時(shí)間分辨萃取Q. Wu, D.P. Wu , Y.F. Guan, Anal. Chem. 2013, 85, 59245932p 快的平衡速度快的平衡速度純純PSPS纖維的萃取纖維的萃取平衡

10、時(shí)間平衡時(shí)間2min2minPS/PNIPAAmPS/PNIPAAm核殼纖維的萃取核殼纖維的萃取游離藥的時(shí)間分辨萃取游離藥的時(shí)間分辨萃取樣品濃度樣品濃度C C0 0在活體內(nèi)不在活體內(nèi)不斷的發(fā)生變化斷的發(fā)生變化速率方程校正為：速率方程校正為：平衡萃取時(shí)萃取量公式校正為平衡萃取時(shí)萃取量公式校正為：KVabbtKVCnss)/(0第二項(xiàng)小于第一項(xiàng)的第二項(xiàng)小于第一項(xiàng)的5%5%才可測(cè)得原時(shí)間點(diǎn)的濃度才可測(cè)得原時(shí)間點(diǎn)的濃度萃取時(shí)間越小，可測(cè)準(zhǔn)的濃度變化速度萃取時(shí)間越小，可測(cè)準(zhǔn)的濃度變化速度越大，時(shí)間分辨率也越高！越大，時(shí)間分辨率也越高！萃取方法萃取方法2min2min以內(nèi)的平以內(nèi)的平衡萃取時(shí)間，有利于時(shí)衡

11、萃取時(shí)間，有利于時(shí)間分辨的萃取，檢測(cè)活間分辨的萃取，檢測(cè)活體濃度的變化體濃度的變化)(0KSAnbtCDAtn游離藥的時(shí)間分辨萃取測(cè)定p BSA-BSA-藥物的結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定藥物的結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定隨著隨著BSABSA與藥物的結(jié)合，與藥物的結(jié)合，游離藥含量不斷下降游離藥含量不斷下降直到平衡直到平衡! !根據(jù)方法的時(shí)間分辨率根據(jù)方法的時(shí)間分辨率 （2min2min）和萃取動(dòng)力學(xué)參數(shù)，）和萃取動(dòng)力學(xué)參數(shù)，可測(cè)準(zhǔn)的動(dòng)態(tài)變化體系的變可測(cè)準(zhǔn)的動(dòng)態(tài)變化體系的變化速度應(yīng)小于化速度應(yīng)小于0.04C0.04C0 0C00.04C0/min活體原位萃取應(yīng)用p 兔子血液中藥物代謝動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定兔子血液中藥

12、物代謝動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定Q. Wu, D.P. Wu , Y.F. Guan, Anal. Chem. 2013, acceptedp 埋管手術(shù)實(shí)物圖埋管手術(shù)實(shí)物圖導(dǎo)管導(dǎo)管活體原位萃取應(yīng)用p 實(shí)際色譜圖實(shí)際色譜圖活體原位萃取應(yīng)用p 測(cè)定曲線測(cè)定曲線活體原位萃取應(yīng)用Q. Wu, D.P. Wu , Y.F. Guan, Anal. Chem. 2013, accepted適宜活體條件，抗基質(zhì)干擾適宜活體條件，抗基質(zhì)干擾適合活體適合活體 pH 4-5條件條件抗植物活體抗植物活體 高鹽干擾高鹽干擾抗植物活體高濃度抗植物活體高濃度無機(jī)酸干擾無機(jī)酸干擾萃取容量：萃取容量：0.1-10 g/棒棒結(jié)合常數(shù)：結(jié)

13、合常數(shù)：107-108 mL/mol活體捕獲不穩(wěn)定激素分子活體捕獲不穩(wěn)定激素分子對(duì)比活體和傳統(tǒng)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對(duì)比活體和傳統(tǒng)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）茉莉酸、生長素結(jié)果略低；）茉莉酸、生長素結(jié)果略低；（2）羥基肉桂酸活體測(cè)定濃度略較高）羥基肉桂酸活體測(cè)定濃度略較高（3）赤霉素）赤霉素 GA 7只能在活體中測(cè)到只能在活體中測(cè)到。空間分辨率：空間分辨率：3-8 mm3檢出限：檢出限：60 pg/g 動(dòng)物原位萃取小結(jié)生物兼容、親水、穩(wěn)定的核殼結(jié)構(gòu)電紡絲膜直接、快速、高分辨萃取分析游離藥微流器件固定萃取膜，血液自由流通活體、快速監(jiān)測(cè)藥代動(dòng)力?；铙w植物激素的原位萃取活體植物激素的原位萃取植物激素簡介植物激素植物

14、激素Phytohormones 植物體內(nèi)合成的對(duì)植物生長發(fā)育有顯著作用微量有機(jī)化合物赤霉素 GAs生長素 auxin細(xì)胞分裂素 Cytokinins脫落酸 abscisic acid乙烯 ethyne油菜素內(nèi)酯 BRs含量低，ng/gpg/g內(nèi)源物質(zhì)，共存基質(zhì)復(fù)雜不穩(wěn)定，對(duì)溫度等條件敏感定義分類分類特點(diǎn)特點(diǎn)目標(biāo)植物激素的化學(xué)特性-COOH 酸性-赤霉環(huán) 疏水性-OH 親水性-Cis diol 硼酸親合-AB ring 疏水性 1.赤霉素赤霉素2.油菜素甾醇油菜素甾醇傳統(tǒng)前處理方法提取提取除雜除雜純化純化檢測(cè)檢測(cè)80%甲醇-水溶液 4低溫過夜提取 多級(jí)SPE除雜，多級(jí)液液萃取除雜反相HPLC分離

15、收集餾分將餾分衍生；進(jìn)樣于GC-MS，SIM模式檢測(cè)由由Hedden (1989)、Foster (1994)、Lee (1998)發(fā)展一套通用方法發(fā)展一套通用方法缺陷明顯： l 流程多，時(shí)間長，而分析物不穩(wěn)定；l 選擇性低，基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重 ，需同位素定量；l 檢測(cè)限太差，痕量植物激素分析結(jié)果很差。研究內(nèi)容油菜素甾醇水滲透加速液液液微萃?。↙LLME with osmosis）載體介質(zhì)的電摩萃?。╟arrier mediated EME）基質(zhì)固相分散(matrix solid-phase dispersion, MSPD)在線二維固相萃取-在線衍生前處理方法（ 2DSPE-OCD ）后續(xù)分離檢測(cè)

16、：后續(xù)分離檢測(cè)：HPLC-MS/MSRCOOHRCOO-高離子強(qiáng)度低離子強(qiáng)度水滲透赤霉素萃取中空纖維膜/有機(jī)溶液擴(kuò)散邊界酸性堿性赤霉素LLLME-萃取原理萃取原理擴(kuò)散邊界赤霉素濃度分布蛋白質(zhì)，核酸，蛋白質(zhì)，核酸，堿性分子堿性分子堿性分子堿性分子無機(jī)酸無機(jī)酸中性分子中性分子脂溶性色素脂溶性色素接受相樣品相LLLME with osmosisFor HPLC-MS/MS injectionLLLME-前處理裝置前處理裝置赤霉素LLLME-萃取曲線萃取曲線赤霉素加快萃取速率，加快萃取速率，縮短萃取時(shí)間縮短萃取時(shí)間突破平衡極限，突破平衡極限，提高萃取收率提高萃取收率萃取量與時(shí)間關(guān)系圖萃取量與時(shí)間關(guān)系圖

17、萃取液濃度與時(shí)間關(guān)系圖萃取液濃度與時(shí)間關(guān)系圖LLLME-優(yōu)勢(shì)優(yōu)勢(shì)赤霉素1雙向富集，富集濃縮倍數(shù)高雙向富集，富集濃縮倍數(shù)高2純化和富集一步完成純化和富集一步完成3裝置操作簡單裝置操作簡單LLLME-方法評(píng)估方法評(píng)估赤霉素赤霉素赤霉素GA1、GA3、GA4、GA8、GA19、GA7、GA9、GA20檢測(cè)限檢測(cè)限 (pg/mL)2.8-80線性范圍線性范圍 (ng/mL）0.1-10線性（線性（R2）0.99富集倍數(shù)富集倍數(shù) （0.1ng/mL）除除GA8 （20），大于），大于115絕對(duì)回收率（絕對(duì)回收率（%）除除GA8 （2），大于），大于11.5相對(duì)回收率相對(duì)回收率53-166%RSD (%,

18、 n=3, 0.5 ng/mL)除除GA20（24），小于），小于10%LLLME-水稻檢測(cè)水稻檢測(cè)赤霉素樣品量：樣品量：0.2 g (DW)檢出量：檢出量：1-5 ng/g (DW)，加標(biāo)回收率，加標(biāo)回收率62-166%仍有一定基質(zhì)干擾，前處理選擇性仍有待提高仍有一定基質(zhì)干擾，前處理選擇性仍有待提高!RCOO-中空纖維膜/有機(jī)溶液蛋白質(zhì)，核酸，蛋白質(zhì)，核酸，堿性分子堿性分子堿性分子堿性分子無機(jī)酸無機(jī)酸中性分子中性分子脂溶性色素脂溶性色素RNHRNH2 2RNHRNH3 3+ +接受相樣品相H+RCOO-H+赤霉素轉(zhuǎn)運(yùn)+-電場方向EME-萃取原理萃取原理赤霉素加快萃取速度，提高選擇性加快萃取速

19、度，提高選擇性For HPLC-MS/MS injectionagitator電壓電壓+-EME-前處理裝置前處理裝置赤霉素EME-方法優(yōu)勢(shì)方法優(yōu)勢(shì)赤霉素1選擇性載體傳質(zhì)，選擇性萃取選擇性載體傳質(zhì)，選擇性萃取2電場加速，萃取速度快（電場加速，萃取速度快（5-10 min）3裝置操作簡單裝置操作簡單EME-方法評(píng)估方法評(píng)估赤霉素赤霉素赤霉素赤霉素富集倍數(shù)富集倍數(shù) （5 ng/mL5 ng/mL）回收率回收率（% %）RSDRSD (%, n=3, 0.5 ng/mL) (%, n=3, 0.5 ng/mL)GA1GA192.692.634.834.81818GA3GA387.587.532.83

20、2.82828GA4GA437.337.314142.12.1GA834.91321GA1912.554.5GA735.713.48.0GAGA20933516EME-水稻樣測(cè)定水稻樣測(cè)定赤霉素基質(zhì)干擾減少，定性、定量更準(zhǔn)確基質(zhì)干擾減少，定性、定量更準(zhǔn)確赤霉素 MSPD-前處理流程前處理流程一步完成浸提、純化、洗脫！一步完成浸提、純化、洗脫！研缽研缽植物樣品植物樣品和和C1880%甲醇甲醇 7小時(shí)，小時(shí)，4 4 混合混合研磨研磨裝柱裝柱浸提浸提收集收集MSPD-條件優(yōu)化條件優(yōu)化 u樣品樣品/填料：填料：1:1，1:2，1:3，1:4和1:5的比例；u純化材料：純化材料：C8

21、，C18，F(xiàn)lorisil，Silica；u洗脫液：洗脫液：20%，50%，80%(v/v)冷甲醇-水溶液，純甲醇；u浸提時(shí)間：浸提時(shí)間：1 h，3 h，5 h，7 h，9 h，24 h。赤霉素最佳條件：最佳條件：樣品樣品/填料填料1:4，C18純化材料，純化材料，80 %(v/v)冷甲醇冷甲醇-水溶液提取，水溶液提取，7 h浸提。浸提。MSPD-水稻測(cè)定水稻測(cè)定赤霉素赤霉素赤霉素赤霉素Sample 1Sample 2Sample 3Sample 4Sample 5GA1GA31.42 1.80 1.21 1.84 1.76 GA41.58 2.14 1.58 GA72.09 2.96 2.5

22、0 GA8GA9GA195.88 9.70 9.14 10.86 9.90 GA20濃度單位：1 ng/g 測(cè)定結(jié)果與前兩種方法相似，但檢測(cè)限不足。測(cè)定結(jié)果與前兩種方法相似，但檢測(cè)限不足。硼酸吸附劑C18反相吸附劑衍生增敏衍生增敏+疏水保留疏水保留+硼酸親合硼酸親合油菜素甾醇油菜素甾醇 2DSPE-OCD -設(shè)計(jì)思路設(shè)計(jì)思路非鄰二羥基的非鄰二羥基的所有其他提取物所有其他提取物強(qiáng)保留，洗脫譜帶很寬強(qiáng)保留，洗脫譜帶很寬其他高極性的其他高極性的鄰二羥基分子鄰二羥基分子疏水保留，譜帶壓縮疏水保留，譜帶壓縮純凈的、衍生增純凈的、衍生增敏的敏的BRs2DSPE-OCD -工作原理工作原理油菜素甾醇油菜素甾醇乙腈不溶的乙腈不溶的鄰二羥基分子鄰二羥基