基于DNA G-四鏈體識(shí)別的抗腫瘤分子篩選及結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì) 研究進(jìn)展

1、2009年 第54卷 第10期: 1374 1386評(píng) 述中國(guó)科學(xué)雜志社SCIENCE IN CHINA PRESS 基于DNA G-四鏈體識(shí)別的抗腫瘤分子篩選及結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)研究進(jìn)展張秀鳳, 向俊鋒, 田明月, 唐亞林* 中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所, 分子動(dòng)態(tài)與穩(wěn)態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京100190; 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 北京100875 * 聯(lián)系人, E-mail: tangyl 2008-11-04收稿, 2009-01-11接受中國(guó)科學(xué)院分子科學(xué)中心創(chuàng)新項(xiàng)目資助(批準(zhǔn)號(hào): CMS-CX200801)摘要 以生物靶分子為基礎(chǔ)進(jìn)行抗腫瘤藥物先導(dǎo)化合物的篩選是抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)之一. DNA

2、G-四鏈體結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其與癌癥關(guān)系的揭示, 為目前抗腫瘤藥物研發(fā)提供了一個(gè)新的契機(jī). 能夠誘導(dǎo)DNA形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)或者與G-四鏈體特異性結(jié)合并使之穩(wěn)定的化合物有望抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng), 從而達(dá)到抗癌的作用. 以G-四鏈體為抗癌藥物作用靶點(diǎn)對(duì)化合物進(jìn)行篩選和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)是目前化學(xué)家和生物學(xué)家的關(guān)注點(diǎn). 本文旨在針對(duì)靶向G-體的抗腫瘤分子篩選、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)以及抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)三個(gè)方面的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述. 首先, 介紹兩種基于G-四鏈體對(duì)其配體結(jié)構(gòu)特異性識(shí)別而對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)篩選的研究方法:. 其次, G-: (1) 原位胺的質(zhì)子化; (2) 通過(guò)雜環(huán)芳香族化合物上的N-甲基化; (

3、3) 中心金屬離子的存在; (4) 不帶電荷的化合物. 最后, 對(duì)目前基于G-四鏈體為抗腫瘤作用靶點(diǎn)、已經(jīng)走向臨床實(shí)驗(yàn)的CX-3543, AS1411兩個(gè)抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)與作用機(jī)制進(jìn)行介紹.關(guān)鍵詞 G-四鏈體 抗腫瘤藥物 化合物篩選 結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)惡性腫瘤是危害人類健康和生命的重大疾病, 近幾十年, 抗腫瘤新藥研發(fā)已取得了顯著成功. 抗腫瘤藥物的研發(fā)中, 以生物靶分子為基礎(chǔ)進(jìn)行抗腫瘤藥物先導(dǎo)化合物的篩選是抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)之一1. . DNA G-四鏈體結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)及現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其生理功能的揭示, 為解決這一瓶頸問(wèn)題提供了一個(gè)新的契機(jī). 1962年, Gellert等人首次發(fā)現(xiàn)了G-四鏈體結(jié)

4、構(gòu), 直到20世紀(jì)90年代, 伴隨著端粒DNA結(jié)構(gòu)的研究及端粒酶活性與癌癥關(guān)系的發(fā)現(xiàn), 對(duì)DNA G-四鏈體結(jié)構(gòu)與功能的研究引起了人們極大的興趣. 所謂G-四鏈體結(jié)構(gòu), 是指富含鳥(niǎo)嘌呤(G)的DNA單鏈在一價(jià)陽(yáng)離子(如K+和Na+)的誘導(dǎo)下通過(guò)G堿基間Hoogste- en氫鍵形成G-四集體(如圖1所示), 并進(jìn)一步堆積形成四鏈體結(jié)構(gòu).大量的研究表明, DNA G-四鏈體的出現(xiàn)與許多重要的生理過(guò)程密切相關(guān). 在人體內(nèi)大約有37萬(wàn)可以形成DNA G-四鏈體的基因序列5, 它們位于雙鏈DNA的延伸區(qū)域6, , G-四鏈體的形成與其相關(guān)基因表達(dá)水平密切相關(guān), 而且具有不同功能的蛋白(例如: 核酸酶、

5、解旋酶、溶解酶)與G-四鏈體也存在著特殊的相互作用評(píng) 述. 尤為重要的是, G-四鏈體的形成選擇性地引發(fā)了與整個(gè)癌細(xì)胞密切相關(guān)的很多生理功能的紊亂. 特別是端粒末端DNA G-四鏈體的形成, 不僅阻止了端粒酶對(duì)端粒DNA的識(shí)別而抑制了端粒酶活性的表達(dá), 從而達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡的作用; 而且也阻礙了與端粒相關(guān)的蛋白質(zhì)對(duì)其靶分子的正常識(shí)別, 從而大大地增加了基因組的不穩(wěn)定性. 同時(shí), G-四鏈體對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的潛在調(diào)控作用也都得到了有力的證實(shí). 由于人類基因啟動(dòng)區(qū)(例如: 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤易感基因、胰島素、肌細(xì)胞特異性基因、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、缺氧誘導(dǎo)因子1、脆性X精神發(fā)育遲滯基因)以及致癌基因(例如

6、: c-myc, k-ras, bcl-2, c-kit, RET)都存在富含鳥(niǎo)嘌呤的序列, 且都能形成G-四鏈體結(jié)構(gòu), 因此, 能夠誘導(dǎo)DNA形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)或者與G-四鏈體特異性結(jié)合, 并使之穩(wěn)定的化合物有望抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng), 從而達(dá)到抗癌的作用. 四鏈體為抗癌藥物作用靶點(diǎn)對(duì)化合物進(jìn)行篩選和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)是目前化學(xué)家和生物學(xué)家密切關(guān)注的熱點(diǎn). 基于DNA G-四鏈體與惡性腫瘤的關(guān)系, 科學(xué)家們一致認(rèn)為: 誘導(dǎo)DNA G-四鏈體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的化合物能夠?yàn)榘l(fā)展新的抗腫瘤藥物開(kāi)辟一條行之有效的途徑. 化學(xué)家們已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了許多能夠使DNA G-四鏈體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的化合物, 大部分化合物結(jié)構(gòu)具有平面芳香大共軛

7、體系且?guī)д姾? 通常是與G-四鏈體的G-四集體平面通過(guò)-堆積和靜電作用兩種結(jié)合模式來(lái)穩(wěn)定G-. 這種-堆積的結(jié)合模式是區(qū)別于化合物與其他DNA的作用模式, 并用于識(shí)別DNA G-四鏈體的一種獨(dú)特方式, 已為學(xué)者研究得較為深入透徹11. 同時(shí), 帶正電荷的化合物與DNA G-四鏈體之間通過(guò)靜電相互作用也能夠起到穩(wěn)定G-四鏈體的作用. 然而, 由于DNA鏈的立體異構(gòu)、鏈的極性不同、糖苷扭轉(zhuǎn)角的變化、連接回路不同、不同陽(yáng)離子的配位作用等都會(huì)導(dǎo)致G-四鏈體結(jié)構(gòu)的不同, 因此DNA G-四鏈體結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出多態(tài)性(如圖1所示)12, 目前導(dǎo)致與4個(gè)溝槽相互作用的靜電電勢(shì)數(shù)據(jù)比較少, 這方面的工作遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有化

8、合物與雙鏈DNA的相互作用研究的透徹. 到目前為止, 對(duì)于能夠穩(wěn)定G-四鏈體的化合物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)主要遵循以上-堆積和靜電作用兩個(gè)準(zhǔn)則. 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明, 對(duì)端粒DNA G-四鏈體結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用的這些化合物的確對(duì)端粒酶具有不同程度的抑制能力, 能夠使腫瘤細(xì)胞的端粒隨分裂逐漸縮短從而引發(fā)凋亡, 因此有望被開(kāi)發(fā)成抗腫瘤藥物. 目前已經(jīng)有兩個(gè)以DNA G-四鏈體為靶點(diǎn)的藥物CX-3543和AS1411正在進(jìn)行二期臨床實(shí)驗(yàn)13,14. 下面就對(duì)近年來(lái)基于G-四鏈體為靶點(diǎn)進(jìn)行抗腫瘤化合物的篩選以及結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)進(jìn)行綜述.1 基于G-四鏈體的抗腫瘤化合物分子的 結(jié)構(gòu)篩選化合物與DNA G-四鏈體結(jié)合后, 其生物功

9、能主要通過(guò)一些生化和生物實(shí)驗(yàn)來(lái)確定. 而對(duì)二者相互作用體系進(jìn)行結(jié)構(gòu)方面的研究, 來(lái)探討小分子與DNA G-四鏈體結(jié)合的位點(diǎn)及形成復(fù)合物的穩(wěn)定性, 是針對(duì)DNA G-四鏈體的藥物設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ). 目前研究小分子化合物與DNA G-四鏈體相互作用的主要手段有: 吸收光譜、熒光光譜、圓二色譜、線二色譜、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、電噴霧質(zhì)譜、等溫滴定量熱電泳、甲基化印跡法, . 研究小分子配體和G-四鏈體DNA結(jié)合是否具有選擇性, 可以利用競(jìng)爭(zhēng)性透析、毛細(xì)管電泳等方法. 此外, 研究小分子配體與DNA之間的結(jié)合能力可以通過(guò)熒光共圖1A: G堿基間Hoogsteen氫鍵形成G-四集體; B: G-四鏈體多樣性

10、的示例, 人體端粒(B1, PBD:2HY9)和c-myc (B2, PDB:IXAV)序列形成的G-四鏈體的核磁共振得到的結(jié)構(gòu)圖13752009年5月 第54卷 第10期振能量轉(zhuǎn)移、表面等離子體共振、差熱分析儀、恒溫滴定微量熱儀、分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算等方法或儀器進(jìn)行. 以上常用的方法在古練權(quán)、黃志紓課題組15的綜述中有詳細(xì)的介紹. 在此主要介紹兩種基于G-四鏈體對(duì)其配體結(jié)構(gòu)特異性識(shí)別而對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)篩選的研究方法, 即基于核磁共振進(jìn)行抗腫瘤化合物篩選方法以及計(jì)算機(jī)虛擬篩選.1.1 基于核磁共振的抗腫瘤化合物結(jié)構(gòu)篩選核磁共振是研究G-四鏈體DNA的最重要的方法之一. 能夠通過(guò)確定分子的精細(xì)結(jié)構(gòu),

11、G-四鏈體與小分子相互作用的作用模式以及其穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)16,17. 形成G-四集體的鳥(niǎo)嘌呤堿基之間主要通過(guò)堿基上的氨基(NH2)和亞氨基(NH)分別與相鄰鳥(niǎo)嘌呤堿基上的氮、氧原子形成的氫鍵連接. , 10. 活潑氫的峰形與活潑氫之間的交換速度有著密切的關(guān)系. 交換速度很快出現(xiàn)尖銳的單峰; 交換速度很慢則會(huì)看到與鄰位氫的明顯偶合; 交換速度中等則出現(xiàn)平坦的寬峰, 有時(shí)甚至觀察不到峰的存在. 因此, G-.本課題組在近年來(lái)開(kāi)展G-四鏈體靶分子的識(shí)別及配體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)研究的基礎(chǔ)上, 發(fā)展了一種全新的基于G-四鏈體生物靶分子特異性識(shí)別和核磁共振梯度場(chǎng)擴(kuò)散序譜技術(shù)(DOSY), 對(duì)天然植物中抗腫瘤活性成分

12、快速篩選和結(jié)構(gòu)鑒定的方法, 并將這一方法成功地用于兩種天然植物中抗腫瘤分子的發(fā)現(xiàn). 擴(kuò)散序譜主要是基于不同尺寸的分子在溶液中具有不同擴(kuò)散系數(shù)的原理24. 根據(jù)Einstein-Stokes公式, 分子在溶液中的擴(kuò)散速率與分子的大小有關(guān), 分子越大, 擴(kuò)散越慢. 在提取物混合溶液中加入生物靶分子, 活性小分子與大分子相結(jié)合后擴(kuò)散變慢, 擴(kuò)散系數(shù)與生物大分子處于同一量級(jí). 在DOSY譜中, 活性小分子的對(duì)應(yīng)信號(hào)就應(yīng)與生物大分子的信號(hào)處于相同擴(kuò)散帶上, 由此找到活性小分子的特征譜峰, 再通過(guò)進(jìn)一步的2D NMR實(shí)驗(yàn)即可確定活性小分子的結(jié)構(gòu). 該方法是在植物提取物體系中引入生物靶分子G-四鏈體, 利用

13、G-四鏈體對(duì)其配體的結(jié)構(gòu)特異性識(shí)別作用而獲取核磁共振譜1376 學(xué)信息, 分析1H NMR和DOSY譜, 從而獲得被G-四鏈體識(shí)別的化合物的準(zhǔn)確結(jié)構(gòu). 此方法的優(yōu)勢(shì)在于把核磁譜學(xué)的結(jié)構(gòu)鑒定和篩選結(jié)合起來(lái), 讓天然植物提取物中活性成分的快速篩選和結(jié)構(gòu)鑒定成為可能, 這一方法的創(chuàng)新性在于把核磁共振中的DOSY技術(shù)用于基于G-四鏈體DNA特異性識(shí)別的抗腫瘤活性分子的篩選中. 1.2 計(jì)算機(jī)虛擬篩選采用計(jì)算機(jī)虛擬篩選對(duì)G-四鏈體的配體進(jìn)行篩選和結(jié)構(gòu)優(yōu)化已經(jīng)成為一個(gè)必不可少的方法. 文獻(xiàn)報(bào)道常用的兩種建立G-四鏈體和化合物之間的相互作用的模型是分子對(duì)接(molecular docking)和分子動(dòng)力學(xué)模

14、擬(molecular dynamics). 采用虛擬篩選能夠有效地對(duì)G-四鏈體配體進(jìn)行高通量篩選, 大大提高抗腫瘤候選藥物篩選的命中率, 此方法已經(jīng)成功應(yīng)用在抗腫瘤候選藥物篩選中. 而且也可以通過(guò)對(duì)G-四鏈體與化合物之間的相互作用方式, 例如氫鍵、靜電以及-堆積作用、溝槽鍵合作用以及l(fā)oop區(qū)的相互作用, 對(duì)其結(jié)合模式進(jìn)行預(yù)測(cè). 同時(shí), 還可以實(shí)現(xiàn)系列化合物與G-四鏈體之間的相互結(jié)合能力與其結(jié)構(gòu)之間的“構(gòu)效關(guān)系”的分析, 為G-四鏈體配體進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化, 以及合成具有高選擇性、高結(jié)合能力的G-四鏈體配體提供了非常有效的線索和依據(jù). 計(jì)算機(jī)虛擬篩選的快速和低成本是任何常規(guī)實(shí)驗(yàn)手段都無(wú)法比擬的

15、, 從理論上講, 只要建立模型適當(dāng), 它就能對(duì)實(shí)驗(yàn)有很好的指導(dǎo)意義和參考價(jià)值. 因此計(jì)算機(jī)虛擬篩選可以為靶向G-四鏈體藥物設(shè)計(jì)提供重要理論依據(jù), 成為抗腫瘤先導(dǎo)化合物篩選和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)中不可或缺的手段.2 以G-四鏈體為靶點(diǎn)的化合物結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)化學(xué)家們已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了許多能夠使DNA G-四鏈體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的化合物, 主要有包括: 蒽醌類衍生物30、苝類化合物(perylenes)31、端粒抑素和陽(yáng)離子卟啉類化合物、溴乙啡啶衍生物、吖啶衍生物、三嗪類化合物、脂肪氨基取代吲哚喹啉類化合物37、小檗堿類化合物38、二價(jià)鎳配合物39、二苯鄰二氮雜菲衍生物、3,3-二乙基-氧雜花菁(DODC)41、氟代喹諾吩口惡 嗪

16、42、鋅指蛋白43等. 這些化合物對(duì)G-四鏈體的穩(wěn)定作用在以往的綜述文章中有非常詳細(xì)的報(bào)道, 在此不做贅述. 前文提到對(duì)于能夠穩(wěn)定G-四鏈體化合物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)主要還是遵循以上-堆積和靜電作用兩個(gè)準(zhǔn)則, 導(dǎo)致與4個(gè)溝槽相互作用的靜電電勢(shì)數(shù)據(jù)比較少, 而對(duì)于化合物與G-四鏈體的之間靜電相互作用研究工作也比較少. Teulade-Fichou研究小組以一個(gè)獨(dú)特的視角來(lái)審視G-四鏈體配體的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì), 從化合物與G-四鏈體之間的靜電相互作用的角度提出設(shè)計(jì)G-四鏈體配體的新理念. 據(jù)報(bào)道, 能夠穩(wěn)定G-四鏈體的化合物按照它們帶正電的性質(zhì)可以分為4類: (1) 原位胺的質(zhì)子化; (2) 通過(guò)雜環(huán)芳香族化合物上

17、的N-甲基化; (3) 中心金屬離子的存在; (4) 不帶電荷的化合物. 2.1 原位質(zhì)子化的G-四鏈體配體設(shè)計(jì)靶向識(shí)別DNA G-四鏈體的化合物的關(guān)鍵問(wèn)題是在化合物具有較好的水溶性的同時(shí), 要考慮芳香環(huán)的大平面, 由于芳香環(huán)體系有利于化合物與G-四鏈體通過(guò)-堆積的方式結(jié)合在G-四集體平面上. 也就是說(shuō), 化合物必須要具備親水性和憎水性兩個(gè)基本特征. 在設(shè)計(jì)化合物時(shí), 一種常用的研究方法是芳香環(huán)周圍連接上容易質(zhì)子化的側(cè)鏈基團(tuán), 例如胺基是常用的一種易質(zhì)子化的基團(tuán), 這樣既保留了本身的大平面疏水中心, 又使得分子具有了水溶性. 下面就能夠原位質(zhì)子化識(shí)別G-四鏈體的化合物進(jìn)行介紹.近十年來(lái), Ne

18、idle和Hurley的研究小組發(fā)展了一系列能夠原位質(zhì)子化的識(shí)別G-四鏈體的化合物. 最早發(fā)現(xiàn)的雙氨基蒽醌類化合物30能夠穩(wěn)定G-四鏈體, 抑制端粒酶. 然而由于此類化合物對(duì)G-四鏈體的選擇性差, Neidle等人就提出從化合物的母核和原位質(zhì)子化側(cè)鏈兩個(gè)方面對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì), 中心母核由蒽醌發(fā)展到芴酮、吖啶酮、吖啶系列化合物. 其中, 成功設(shè)計(jì)的一類G-四鏈體的配體是 3, 6-雙取代的吖啶系列化合物, 例如BSU6039(如圖2所示)48, 從與G-四鏈體形成的配合物的晶體結(jié)構(gòu)可以看出, 正如分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)時(shí)期望的結(jié)果一樣, BSU6039G-四鏈體中的G-四集體平面上的鳥(niǎo)嘌呤通過(guò)-堆積的

19、方式以及兩個(gè)質(zhì)子化的側(cè)鏈與用雙重作用能夠非常好地穩(wěn)定G-四鏈體. 在此基礎(chǔ)上, 優(yōu)化設(shè)計(jì)了含有3個(gè)能夠質(zhì)子化側(cè)鏈的BRACO-19(如圖2所示), BRACO-19不僅能夠使得DNA G-四鏈體的熔點(diǎn)升高27, 提高了對(duì)G-四鏈體的結(jié)合能力(對(duì)G-四鏈體的選擇性是雙鏈DNA的31評(píng) 述倍), (TRAP)表示對(duì)端粒酶活性有很強(qiáng)的抑制作用(IC50-TRAP = 115 nmol/L), 進(jìn)一步的生物活性實(shí)驗(yàn)表明, BRACO-19對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有很強(qiáng)的抑制作用. 值得提出的一個(gè)問(wèn)題是: 文獻(xiàn)50 報(bào)道了用TRAP實(shí)驗(yàn)證明G-四鏈體配體對(duì)端粒酶活性抑制作用需要重新評(píng)價(jià), 通過(guò)細(xì)致分析G-四鏈體配

20、體對(duì)TRAP實(shí)驗(yàn)每個(gè)環(huán)節(jié)的影響, 并對(duì)比化合物與G-四鏈體作用機(jī)制的差異, 得出TRAP用于衡量G-四鏈體配體對(duì)端粒酶活性的抑制作用是不合適的結(jié)論. 然而, 在引用的大量文獻(xiàn)中, TRAP實(shí)驗(yàn)結(jié)果還是作為一個(gè)重要的評(píng)價(jià)參數(shù). 文獻(xiàn)已報(bào)道端粒長(zhǎng)度的穩(wěn)定是癌細(xì)胞可以無(wú)限制分裂而危害健康的根本原因. 然而, 端粒長(zhǎng)度的穩(wěn)定除了端粒酶途徑外尚有不需要端粒酶的ALT機(jī)制. 在抑制端粒酶后, 人們擔(dān)心癌細(xì)胞有可能選擇ALT機(jī)制而實(shí)現(xiàn)端粒長(zhǎng)度的維護(hù). 最近, Tang等51對(duì) DNA G-四鏈體抑制端粒酶的分子機(jī)制進(jìn)行了研究, 結(jié)果表明端粒G-四鏈體結(jié)構(gòu)傾向在端粒末端形成G-四鏈體的穩(wěn)定除了抑制端粒酶進(jìn)行的

21、端粒延伸外還將會(huì)抑制ALT機(jī)制所實(shí)現(xiàn)的端粒延伸, 從而消除了對(duì)選擇ALT的擔(dān)心. 這一發(fā)現(xiàn)給穩(wěn)定DNA G-四鏈體結(jié)構(gòu)的化合物帶來(lái)更大的優(yōu)越性. 在對(duì)BRACO-19藥理實(shí)驗(yàn)的研究過(guò)程中, 為了改善其細(xì)胞膜通透性, 又在9位氨基取代基上做了進(jìn)一步優(yōu)化, 合成了9位從苯胺到雙氟芐氨基取代的一系列BRACO-19家族化合物52. 由此可見(jiàn), 基于對(duì)化合物取代基和中心母環(huán)上N原子的質(zhì)子化能力的優(yōu)化設(shè)計(jì)理念, 對(duì)具有簡(jiǎn)單的吖啶母環(huán)結(jié)構(gòu)家族化合物, 就可以設(shè)計(jì)出對(duì)G-四鏈體具有非常好的識(shí)別能力的化合物.Hurley研究組最初認(rèn)為能夠穩(wěn)定G-四鏈體的化合物幾乎都有一個(gè)大的芳香環(huán)平面, 如果這個(gè)平面比與雙鏈

22、結(jié)合的化合物的平面大得多, 可能就提高了化合物對(duì)G-四鏈體的選擇性. 根據(jù)這一思路, 設(shè)計(jì)合成二萘嵌苯二酰亞胺類化合物PIPER(如圖2所示), 其結(jié)構(gòu)是由一個(gè)疏水大平面和兩個(gè)氨基側(cè)鏈組成, 此家族化合物具有一定的穩(wěn)定G-四鏈體的能力, 對(duì)端粒酶活性也有一定的抑制作用. 然而, 在對(duì)其聚集狀態(tài)與對(duì)G-四鏈體識(shí)別能力的相互關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn), 只有在堿性條件下, 才能識(shí)別G-四鏈體, 在中性條件下對(duì)G-四鏈體沒(méi)有識(shí)別能力. 不管是對(duì)其二萘嵌苯母核的多取代還是對(duì)稱性取代, 以期通過(guò)原位的質(zhì)子化增加其水溶性, 對(duì)其選擇性都沒(méi)有13772009年5月 第54卷 第10期很好的改進(jìn)作用. 該研究小組基于具

23、有抗菌活性的氧氮雜萘類物質(zhì), 又合成了一類能夠穩(wěn)定G-四鏈體的含氟喹諾酮類化合物QQ58(如圖2所示)55, 研究表明, QQ58與G-四鏈體主要是以通過(guò)與G-四集體平面堆積方式結(jié)合的, 而這一結(jié)合模式導(dǎo)致它具有很好的細(xì)胞活性. 有些能夠與雙鏈DNA相互作用的天然化合物也具有一定穩(wěn)定G-四鏈體的作用, 例如: 偏端霉素57、黃酮58、甾體類衍生物59柔紅霉素56、以及海洋生物堿都不同程度地表現(xiàn)出與G-四鏈體的相互作用.基于原位質(zhì)子化的G-四鏈體配體設(shè)計(jì)的另一方面的研究工作是Teulade-Fichou和Mergny研究小組發(fā)現(xiàn)了五元環(huán)的喹吖啶衍生物具有類似G-四集體平面的一個(gè)喹吖啶平面, 以期

24、能夠與G-四集體平面相互作用. 首先合成的是MMQ3(見(jiàn)圖2)61, 對(duì)G-四鏈體具有很好的穩(wěn)定作用, 使得G-四鏈體的熔點(diǎn)升高了20, 而且具有很強(qiáng)的端粒酶抑制作用(IC50-TRAP = 28 nmol/L). 相繼合成了MMQ3的類似物MMQ162. NMR結(jié)果表明,MMQ與分子間G-四鏈體不僅通過(guò)類似于3呤的喹吖啶與四集體之間的-堆積模式而尤為重要的是它的兩個(gè)質(zhì)子化側(cè)鏈能夠通過(guò)與溝槽的相互作用而識(shí)別G-四鏈體結(jié)構(gòu). 進(jìn)而又合成了二聚體大環(huán)喹吖啶衍生物BOQ1(見(jiàn)圖2)63, 不僅對(duì)G-四鏈體具有更好的穩(wěn)定作用(T1/2 = 28), 而且也提高了對(duì)G-四鏈體的選擇性, 具有很強(qiáng)的抑制端

25、粒酶活性(IC50-TRAP = 130 nmol/L). 值得一提的是, 其選擇性的提高是由于芳香環(huán)平面的擴(kuò)大, 這種大平面的立體效應(yīng)可以阻止與雙鏈DNA的結(jié)合, 因而提高了對(duì)G-四鏈體結(jié)合的選擇性.目前, 通過(guò)增加一些特殊結(jié)構(gòu)來(lái)提高化合物對(duì)圖2 一些能夠原位質(zhì)子化帶有胺基側(cè)鏈的陽(yáng)離子G-四鏈體配體的分子結(jié)構(gòu)示意圖1378G-四鏈體的特異性識(shí)別能力是G-四鏈體配體設(shè)計(jì)的一個(gè)新趨勢(shì). 這個(gè)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)思想不僅基于G-四鏈體的G-四集體平面與雙鏈DNA堿基平面之間的區(qū)別, 而且還考慮到了G-四鏈體與雙鏈DNA溝槽區(qū)和loop區(qū)的差異. 遵循這個(gè)設(shè)計(jì)原則, 第一個(gè)設(shè)計(jì)的化合物是把新霉素加在喹吖啶上得到

26、了NCQ(見(jiàn)圖2), 以期通過(guò)喹吖啶靶向G-四集體平面、新霉素基團(tuán)靶向作用于G-四鏈體的loop區(qū)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)G-四鏈體的特異性識(shí)別. 實(shí)驗(yàn)表明, NCQ只能穩(wěn)定帶有l(wèi)oop區(qū)的G-四鏈體, 不能結(jié)合不帶loop區(qū)的G-四鏈體. NCQ對(duì)G-四鏈體有很好的穩(wěn)定作用(T1/2 = 14), 具有很強(qiáng)的抑制端粒酶活性. 通過(guò)對(duì)G-四鏈體作用位點(diǎn)“雙管齊下”的設(shè)計(jì), 這樣就充分實(shí)現(xiàn)了提高對(duì)G-四鏈體的選擇性的理念. 延續(xù)這一思路, 研究人員又合成了一種新的三氧氮雜茂大環(huán)化合物(Trioxazole macrocycle, 見(jiàn)圖2), 由于3個(gè)胺基鏈可以形成一個(gè)大環(huán)的平面, 因此可以推斷它能夠與G-四鏈體

27、的溝槽和loop區(qū)結(jié)合. 非常有意義的是溝槽和loop區(qū)這些次要的作用位點(diǎn)增加了對(duì)某一種特殊G-四鏈體的選擇性識(shí)別能力. 而三氧氮雜茂大環(huán)化合物正好印證了這一點(diǎn), 它更加傾向于與c-kit序列形成的G-四鏈體的結(jié)合, 而不是端粒G-四鏈體.另外, 目前對(duì)于化合物與G-四鏈體的選擇性的研究也有了很大的突破. 這個(gè)發(fā)現(xiàn)為研究設(shè)計(jì)選擇性地識(shí)別某一特定G-四鏈體的配體開(kāi)辟了一條新的途徑. Balasubramanian研究組最新又發(fā)現(xiàn)了兩種能夠特異性識(shí)別不同G-四鏈體的化合物: 一種是異咯嗪類化合物(Trisubstitued isolloxazines, 見(jiàn)圖2)66, 此類化合物在對(duì)G-四鏈體的選

28、擇性、結(jié)合能力和穩(wěn)定作用方面都表現(xiàn)出非常好的作用, 不僅能夠特異性地與G-四鏈體結(jié)合, 而且還能夠識(shí)別不同幾何構(gòu)型的G-四鏈體. 另一種是雙芳基乙炔基酰胺類化合物(Bis-phenylethynyl amide derivatives, 見(jiàn)圖2)67, 這類化合物脫離了傳統(tǒng)G-四鏈體配體的大平面的設(shè)計(jì)理念, 它含有兩個(gè)炔鍵, 使其分子結(jié)構(gòu)能夠自由旋轉(zhuǎn)構(gòu)型. 這類化合物能夠?qū)-四鏈體有很好的特異性識(shí)別能力, 而且還有望能夠識(shí)別不同構(gòu)型的分子內(nèi)G-四鏈體, 它可以通過(guò)溝槽鍵接的結(jié)合方式特異性地識(shí)別c-kit形成的平行結(jié)構(gòu)G-四鏈體. 最近, 該研究組又成功發(fā)現(xiàn)了G-四鏈體的另一個(gè)作用位點(diǎn), 就是

29、中心陽(yáng)離子通道, 這樣又為配體調(diào)控的G-四鏈體的多樣性的研究開(kāi)啟了一扇窗. 然而, 由于缺乏直評(píng) 述接的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù), 目前對(duì)于化合物與G-四鏈體相互作用的特定部位, 是loops區(qū)、溝槽區(qū)還是陽(yáng)離子通道, 尚沒(méi)有詳盡的研究.2.2 芳香環(huán)N-甲基化的G-四鏈體配體除了上面講到的基于氨基側(cè)鏈原位質(zhì)子化的G-四鏈體的配體之外, 化合物對(duì)G-四鏈體的穩(wěn)定作用還有一種方式就是通過(guò)化合物結(jié)構(gòu)中N的甲基化, 例如雜環(huán)芳香化合物上的N的甲基化. 根據(jù)這一機(jī)理設(shè)計(jì)的化合物的優(yōu)點(diǎn)是不需要陽(yáng)離子的側(cè)鏈, 化合物本身就具有水溶性. 由于沒(méi)有側(cè)鏈的存在可以降低環(huán)芳周圍的電子云密度, 更有利于化合物與G-四鏈體進(jìn)行-堆積

30、作用.四陽(yáng)離子卟啉TMPyP469見(jiàn)圖3)就是芳香環(huán)N-甲基化的G-四鏈體配體的一個(gè)典型例子. TMPyP4對(duì)G-四鏈體有很好的穩(wěn)定作用(T1/2 = 17), 具有很強(qiáng)的抑制端粒酶活性的作用, 同時(shí)它能夠下調(diào)癌基因的表達(dá), 也能夠?qū)⒎雌叫械腉-四鏈體誘導(dǎo)形成平行結(jié)構(gòu)G-四鏈體. 非常有趣的是, 盡管TMPyP4對(duì)G-四鏈體的選擇性很不好, 但是科研工作者對(duì)它的研究熱情有增無(wú)減. 事實(shí)上, TMPyP4與G-四鏈體存在著多種結(jié)合模式, 包括能夠扦插到兩個(gè)G-四集體平面之中, 同時(shí)也能夠和外側(cè)G-四集體平面以-堆積的方式結(jié)合, 而最近X射線研究結(jié)果表明, 它是通過(guò)和TTA核苷外側(cè)以堆積的這種出人

31、意料的結(jié)合模式和G-四鏈體結(jié)合的, 竟然和G-四集體毫無(wú)直接作用. 在過(guò)去幾年中, 發(fā)展了很多和四陽(yáng)離子卟啉結(jié)構(gòu)類似的化合物, 其中TQMP, 3, 4-TMPyPz (見(jiàn)圖3)就是兩個(gè)四陽(yáng)離子大環(huán)化合物, 它們對(duì)G-四鏈體具有很高的選擇性. 最近, 周翔研究小組73在TQMP基礎(chǔ)上又報(bào)道了一類結(jié)構(gòu)新穎的陽(yáng)離子Corrole derivatives (見(jiàn)圖3), 能夠大大地提高G-四鏈體的熔點(diǎn), 其相互作用機(jī)制和生物活性實(shí)驗(yàn)正在研究之中.在卟啉類化合物的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了一種以卟啉環(huán)為核心的化合物Se2SAP(見(jiàn)圖3), 它與G-四鏈體的結(jié)合能力、選擇性以及對(duì)不同構(gòu)象G-四鏈體的調(diào)控能力等方面都有很

32、大的突破. 尤為重要的是它有望成為第一個(gè)能夠識(shí)別不同構(gòu)象G-四鏈體DNA的化合物. 然而, 該化合物的唯一弊病是其產(chǎn)量很低, 這影響了對(duì)其生物活性的進(jìn)一步開(kāi)發(fā). 除了陽(yáng)離子大環(huán)類卟啉衍生物之外, 一些小分子的化合物對(duì)G-四13792009年5月 第54卷 第10期圖3 一些芳香環(huán)N-甲基化的陽(yáng)離子G-四鏈體配體的分子結(jié)構(gòu)示意圖鏈體也表現(xiàn)了出人意料的穩(wěn)定作用, 例如N-甲基化的五元環(huán)吖啶化合物RHPS4(見(jiàn)圖3), 它能夠插入到G-四鏈體的兩個(gè)G-四集體的平面中, 使得G-四鏈體形成一個(gè)陽(yáng)離子的三明治結(jié)構(gòu), 這種少見(jiàn)的結(jié)合模式反映在其生物活性方面, 這個(gè)芳環(huán)結(jié)構(gòu)比較密集的化合物具有很強(qiáng)的端粒酶抑

33、制作用(IC50-TRAP = 330 nmol/L), 同時(shí)也能夠減少端粒的延伸, 可以和抗癌藥物紫杉醇產(chǎn)生協(xié)同作用Mergny研究組77其唯一機(jī)理, 具有特定結(jié)構(gòu)的化合物可以通過(guò)溝槽 鍵接的方式和G-四鏈體相互作用, 而這方面的工作 還有待于科研工作者進(jìn)一步探索. 2.3 金屬有機(jī)化合物作為G-四鏈體配體金屬有機(jī)化合物引起人們很大的興趣源于一 方面比較容易合成, 另一方面有望改變化合物與G- 四鏈體的結(jié)合性質(zhì). 根據(jù)這一設(shè)想, 科學(xué)家預(yù)測(cè), 中心離子可以位于G-四鏈體的陽(yáng)離子通道, 而與金屬離子絡(luò)合的化合物可以通過(guò)扦插的方式與G-四集體相互作用. 最早報(bào)道的是金屬卟啉類化合物, 如 Cu(

34、)-TMPyP4, Ni()-TMPyP4, Mn()-porphyrin (見(jiàn)圖4), 其與G-四鏈體結(jié)合的選擇性得到了一定的提 高8587. 隨之, 不斷改變中心離子, 又合成了salphen 類Ni()、Ru()、Fe()、Zn()金屬絡(luò)合物8891. 它 們與G-四鏈體的結(jié)合能力, 對(duì)G-四鏈體的穩(wěn)定作用 以及選擇性都得到了顯著提高. 周翔研究小組92,93報(bào)道了一系列新的陽(yáng)離子酞菁類染料金屬絡(luò)合物, 例如ZnPc(見(jiàn)圖4), 能夠很好地穩(wěn)定G-四鏈體, 對(duì)端 粒酶活性有很好的抑制作用, 是一類新的端粒酶抑 制劑. 還有一類結(jié)構(gòu)和合成方法都比較簡(jiǎn)便的化合 物三聯(lián)吡啶的金屬絡(luò)合物也提高了

35、對(duì)G-四鏈體的穩(wěn) 定作用和選擇性. 尤為重要的是, 這方面的研究 中, 金屬離子的幾何空間構(gòu)型是決定金屬有機(jī)化合 物的重要參數(shù).發(fā)展了一系列含有N-甲基的溴乙啶類衍生物, 能夠穩(wěn)定G-四鏈體, 對(duì)端粒酶也有 很強(qiáng)的抑制作用(IC50-TRAP = 47 nmol/L). 然而, 這 類化合物兩個(gè)致命的弱點(diǎn)就是它的毒性和誘導(dǎo)突變 體的性質(zhì), 為了克服這些缺點(diǎn), 設(shè)計(jì)合成了一系列結(jié) 構(gòu)新穎的以12459為例的三嗪類化合物78, 可以選 擇性地穩(wěn)定G-四鏈體, 對(duì)端粒酶也有很強(qiáng)的抑制作 用(IC50-TRAP = 130 nmol/L). 然而, 三嗪類化合物的 風(fēng)頭很快地被一類結(jié)構(gòu)相似的以雙喹啉為

36、母核的化 合物PDC79所掩蓋, 以PDC 307A和PDC 360A(見(jiàn) 圖3)為代表, 使得G-四鏈體的熔點(diǎn)升高20以上, 可以選擇性地與G-四鏈體結(jié)合, 誘導(dǎo)端粒酶活性受到抑制. 這類化合物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單, 合成方法比較容易, 而且對(duì)癌細(xì)胞具有抑制作用. 最近合成了鄰菲羅啉類化合物Phen-DC(見(jiàn)圖3), 相對(duì)于雙喹啉類化合物具有很高的選擇性.還有一些已知能夠作用于雙鏈DNA的化合物, 2.4 不帶電荷的大環(huán)G-四鏈體配體Shinya研究組95從微生物中分離得到的端粒抑 如雙苯咔唑類化合物、小檗堿和一些染料分 子83, 它們都對(duì)G-四鏈體有很強(qiáng)的穩(wěn)定作用, 這表 明化合物與G-四鏈體通過(guò)外部

37、扦插的結(jié)合方式不是素(Telomestatin)(見(jiàn)圖5)是一類用于識(shí)別G-四鏈體的不帶電荷的大環(huán)類化合物, 它不僅能夠選擇性地1380評(píng) 述圖4 一些金屬有機(jī)絡(luò)合物G-四鏈體配體的分子結(jié)構(gòu)示意圖圖5 大環(huán)G-四鏈體配體的分子結(jié)構(gòu)示意圖穩(wěn)定G-四鏈體, 而且在沒(méi)有金屬離子存在的條件下能夠誘導(dǎo)單鏈DNA形成G-四鏈體, 這在小分子化合物中屬于首次發(fā)現(xiàn). 端粒抑素對(duì)端粒酶活性具有很強(qiáng)的抑制作用, 對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用, 它的一大缺點(diǎn)在于分離難度很大, 最近文獻(xiàn)報(bào)道了端粒抑素的全合成, 但是大規(guī)模的合成依然存在著很大的困難. 最近報(bào)道了兩種端粒抑素的類似物 (HXDV和Bistrioxazo

38、le acetate, 見(jiàn)圖5), 其中HXDV能夠很好地選擇性穩(wěn)定G-四鏈體, 對(duì)雙鏈、三鏈DNA沒(méi)有作用, 但對(duì)癌細(xì)胞有很高的毒性. 最近的研究證明了HXDV與人體端粒G-四鏈體的作用模式, 最有意義的是, 端粒抑素的類似物HXDV的高度選擇性是由于中間凹形空間的參與.美國(guó)加利福尼亞州圣迭戈Cylene制藥公司的研究人員正在展開(kāi)對(duì)CX-3543的臨床實(shí)驗(yàn). 一開(kāi)始設(shè)想CX-3543通過(guò)與c-Myc G-四鏈體相互作用導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡, 研究發(fā)現(xiàn), 盡管CX-3543確實(shí)是以G-四鏈體為靶點(diǎn), 然而它以一種全新的作用機(jī)理發(fā)揮作用. 它破壞了G-四鏈體與在癌細(xì)胞核仁中形成的一種核仁素蛋白的復(fù)

39、合物, 這種破壞作用反過(guò)來(lái)干擾了癌細(xì)胞中核糖體RNA的生物合成, 從而導(dǎo)致了癌細(xì)胞的死亡. 該公司已經(jīng)成功完成了CX-3543的一期臨床實(shí)驗(yàn), 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 這個(gè)藥物對(duì)于人體是安全無(wú)毒的, 它很快就進(jìn)入了二期臨床實(shí)驗(yàn)階段.另一個(gè)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)與G-四鏈體相關(guān)的藥物是 一段26個(gè)富含G的DNA寡聚核苷酸AS1411, 它可 以形成G-四鏈體結(jié)構(gòu), 起到核酸適體(aptamer)的作 用. 它是由Miller等人在研究三螺旋結(jié)合寡聚核苷酸 過(guò)程中偶然發(fā)現(xiàn)的. 至今科學(xué)家還沒(méi)有完全揭示 AS1411的作用機(jī)制, 因此并不了解是否以G-四鏈體 的形成存在于癌細(xì)胞中. 非常巧合的是, AS1411的作

40、用機(jī)制與CX-3543有相似之處, 就是都與核仁素有 關(guān), AS1411結(jié)合在腫瘤細(xì)胞表面的核仁素上, 導(dǎo)致 了不吸收AS1411. 在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中, AS1411抑制 了腫瘤細(xì)胞的增殖以及腫瘤的生長(zhǎng). 由Neidle研究組3 以G-四鏈體為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)能夠穩(wěn)定G-四鏈體的化合物有望發(fā)展成為抗腫瘤的藥物, 例如: 蒽醌類衍生物、端粒抑素、卟啉類化合物以及喹啉類化合物, 由于這些化合物的毒性, 要想走向臨床, 還需要很長(zhǎng)的一段路. 目前以G-四 鏈體為作用靶點(diǎn)的CX-3543, AS1411兩個(gè)藥物 已經(jīng)走向臨床實(shí)驗(yàn). Hurley研究組以c-Myc G-四鏈 體為靶點(diǎn), 發(fā)現(xiàn)了抗癌先導(dǎo)化

41、合物CX-3543, 該化合物選擇性地作用于癌基因啟動(dòng)子c-Myc G-四鏈體, 發(fā)現(xiàn)的吖啶類化合物BRACO-19家族50,98, 靶向作用13812009年5月 第54卷 第10期于端粒G-四鏈體, 并且具有很高的抗癌活性, 目前已經(jīng)進(jìn)入臨床前的研究階段. 雖然對(duì)于已經(jīng)進(jìn)入臨床研究的兩個(gè)抗腫瘤藥物CX-3514和AS1411, 其抗癌機(jī)理與人們預(yù)期的有所差異, 但是以G-四鏈體作為抗腫瘤藥物研發(fā)的一個(gè)非常有潛力的藥物作用靶點(diǎn)是不容置疑的. Hurley和Neidle指出: “DNA G-四鏈體作為抗腫瘤藥物作用的新靶點(diǎn), 已經(jīng)由基礎(chǔ)研究迅速走向臨床實(shí)驗(yàn). 對(duì)G-四鏈體的已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究

42、, 然而在G-四鏈體的生物學(xué)意義方面尚有很多事情亟待探索, 尤其是它細(xì)胞中所起到的作用. 同時(shí), 也需要我們對(duì)G-四鏈體的結(jié)構(gòu)的多樣性進(jìn)行更加深入的研究, 這是基于G-四鏈體進(jìn)行抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)的真正意義所在99.”步被揭示; 隨著X射線單晶衍射技術(shù)和NMR技術(shù)在G-四鏈體領(lǐng)域的應(yīng)用, G-四鏈體的結(jié)構(gòu)也得到了越來(lái)越清晰的認(rèn)識(shí). G-四鏈體結(jié)構(gòu)的研究為靶向G-四鏈體的抗腫瘤藥物的篩選和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)提供了重要的信息, 以G-四鏈體為藥物靶點(diǎn)進(jìn)行抗腫瘤藥物的篩選將為尋找新的抗腫瘤藥物提供一個(gè)很好的契機(jī).然而, 目前G-四鏈體化合物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和合成還有待于進(jìn)一步解決的問(wèn)題是如何提高化合物對(duì)G-四鏈體的選擇

43、性, 不僅相對(duì)于雙鏈DNA的選擇性, 而且還要對(duì)不同結(jié)構(gòu)G-四鏈體具有選擇性. 另外, 在細(xì)胞水平上已經(jīng)證實(shí)了G-四鏈體配體能夠選擇性地作用于癌細(xì)胞并且誘導(dǎo)一些特異性的反應(yīng)四鏈體可以作為評(píng)價(jià)與端粒以及端粒蛋白相關(guān)藥理活性的一種途徑, 這些生物實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否與激活端粒相關(guān)的途徑有關(guān)還有待于進(jìn)一步被證實(shí). 科研工作者對(duì)G-四鏈體配體的研究越來(lái)越關(guān)注, 致力于尋找靶向G-四鏈體毒性較低的新型藥物.4 結(jié)論與展望回顧過(guò)去的20年, DNA G-四鏈體的研究取得了顯著的進(jìn)展, 由基礎(chǔ)研究迅速走向臨床實(shí)驗(yàn). 經(jīng)過(guò)科學(xué)家大量的研究工作, G-四鏈體的重大生物學(xué)意義逐參考文獻(xiàn)1 2 3 4 5 6 7 8 9

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