實(shí)驗(yàn)一幾種光學(xué)顯微鏡的使用

1、實(shí)驗(yàn)一 幾種光學(xué)顯微鏡的使用 -生物學(xué)基地 王婷婷實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鈳追N光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)、工作原理、主要用途和使用方法；掌握使用普通顯微鏡提高分辨力的方法。實(shí)驗(yàn)原理(一)基本原理(二)幾種光學(xué)顯微鏡 1普通光學(xué)顯微鏡 2暗視野顯微鏡 3相差顯微鏡 4熒光顯微鏡(三)如何提高分辨力 1數(shù)片孔徑(numerial aperture) 2分辨率(resolving power) 3放大率(magnification) 4焦點(diǎn)深度(depth of focus)一般實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用的光學(xué)顯微鏡都是由物鏡、目鏡、聚光器和光源組成，普通顯微鏡它們的放大原理及光路圖如下：O2O1B1A1ABA2F1F2B2基本原理

2、普通光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡也叫復(fù)式顯微鏡，是最常見，最簡(jiǎn)單的顯微鏡。它適于觀察一般固定的，有色的透明度較高的標(biāo)本。其最大分辨力一般為0.2微米，從構(gòu)造上可分光學(xué)、機(jī)械和電子三大系統(tǒng)。幾種光學(xué)顯微鏡暗視野顯微鏡 暗 視 野 顯 微 鏡 是 以 丁 達(dá) 爾 現(xiàn) 象 ( T y n d a l l phenomenon)(即光的微粒散射現(xiàn)象)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的，它使用了特殊的聚光器進(jìn)行斜射照明，因光源中心束不直入物鏡，所以視野黑暗，而被檢細(xì)胞器因斜射照明發(fā)生衍射和反射，所以發(fā)亮可見。暗視野顯微鏡可用增加光照方法增加物體與背景的反差，因而可觀察到0.2-0.004微米直徑的微小粒子，但它分不清被檢物的細(xì)微

3、構(gòu)造，它常用于觀察物體的存在與運(yùn)動(dòng)。暗視野顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的區(qū)別，主要在于聚光器的不同，致使照明方法有別。確切地說(shuō)，稱暗視野顯微鏡為暗視野照明更為貼切，它是照明光線僅照亮被檢樣品而不進(jìn)入物鏡，使視野背景暗黑，樣品明亮的照明方法。幾種光學(xué)顯微鏡相差顯微鏡 相差是指同一光線經(jīng)過(guò)折射率不同的介質(zhì)其相位發(fā)生變化并產(chǎn)生的差異。相位是指在某一時(shí)間上，光的波動(dòng)所達(dá)到的位置。一般由于被檢物體(如不染色的細(xì)胞)所能產(chǎn)生的相差的差別太小，我們的眼睛是很難分辨出這種差別的，只有在變相差為振幅差(明暗之差)之后，才能被分辨。相差顯微鏡是以光的干涉現(xiàn)象為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的。與普通光學(xué)顯微鏡比較，它在聚光器和物鏡上作了改動(dòng)

4、。用裝有環(huán)狀光欄的聚光器造成的空心光線柱，使直射光 (背景) 和衍射光 (樣品) 分開。同時(shí)在物鏡的后焦面上裝有相位板，使直射光和衍射光發(fā)生干涉，從而把我們?nèi)庋鄄荒芤姷南辔徊钭優(yōu)榭梢姷恼穹?，同時(shí)相位板上裝有吸收膜，吸收部分直射 (或衍射)光以增加反差，使人們能夠看清更加細(xì)微的結(jié)構(gòu)。所以相差顯微鏡一般用于觀察活細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)。幾種光學(xué)顯微鏡熒光顯微鏡 熒光是指某些物質(zhì)經(jīng)波長(zhǎng)較短的光線照射后，分子被激活吸收能量后呈激發(fā)態(tài)，其能量除部分轉(zhuǎn)化為熱量或用于光化學(xué)反應(yīng)外，相當(dāng)一部分則以波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光能形式輻射出來(lái)，這種波長(zhǎng)長(zhǎng)于激發(fā)光的可見光稱作熒光。熒光顯微鏡是以紫外線 (3650A) 或藍(lán)紫光 (420

5、0A) 照射某些物質(zhì)，可激發(fā)其產(chǎn)生熒光的原理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的，利用一個(gè)高發(fā)光效率的光源，經(jīng)過(guò)一個(gè)濾光系統(tǒng)得到紫外光(或藍(lán)紫外光)，直接照射標(biāo)本中的自然熒光物質(zhì)，使其產(chǎn)生自發(fā)熒光，再加以鏡檢?；蛞詿晒馊玖舷葘?duì)標(biāo)本進(jìn)行染色，然后使之在上述光源照射下產(chǎn)生次生熒光，再加以鏡檢。這種顯微鏡主要用于觀察熒光(或次生熒光)物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)分布情況，以及測(cè)定細(xì)胞器的生理活性。幾種光學(xué)顯微鏡數(shù)片孔徑 數(shù)片孔徑(N.A.)也叫鏡口率，是物鏡和被檢樣品之間的介質(zhì)的折射率(n)與物鏡所接受的光錐頂角(亦稱孔徑角)的一半(半孔徑角)正弦的乘積。其公式如下： N.A.=nsin 物鏡的數(shù)值孔徑愈大，顯微鏡的能力愈強(qiáng)，數(shù)值孔徑與分

6、辨率成正比，與焦點(diǎn)深度成反比。物鏡的數(shù)值孔徑的N.A.值刻在物鏡殼上，如400.65表示40倍的物鏡，數(shù)值孔徑為0.65。物鏡的數(shù)值孔徑隨前透鏡直徑的減少而增大。顯微鏡物鏡的前透鏡口徑愈小，數(shù)值孔徑愈大，放大倍數(shù)愈高，價(jià)格愈高。如何提高分辨力分辨率物鏡分辨率是指分辨被檢樣品細(xì)微結(jié)構(gòu)的能力。通常以能清晰地分辨兩個(gè)物體點(diǎn)的最短距離來(lái)表示。其公式如下： R=0.61/ N.A R：分辨率； ：照射光線波長(zhǎng)； N.A：物鏡數(shù)值孔徑 分辨率以分辨兩個(gè)點(diǎn)的最短距離表示，R值愈小，分辨能力愈大。物鏡的分辨率與照明光線的波長(zhǎng)成反比，與物鏡的數(shù)值孔徑成正比。 照明光線波長(zhǎng)愈短，物鏡的數(shù)值孔徑愈大，顯微鏡的分辨率

7、亦愈大。 物鏡的分辨力即顯微鏡的分辨率，目鏡與顯徽鏡的分辨率無(wú)關(guān)，它只把物像第二次放大，使眼睛便于觀察。目鏡只能將物鏡已經(jīng)分辨的影像進(jìn)行放大，無(wú)法觀察到未被物鏡分辨的細(xì)節(jié)。在光學(xué)成像過(guò)程中，目鏡不起初始造像作用，僅作放大而已。如何提高分辨力放大率顯微鏡最后形成的物體放大影像，對(duì)被檢物體的大小比例稱為放大率，即像高比物高。放大倍數(shù)以長(zhǎng)度計(jì)算，而不是以面積或體積計(jì)算。顯微鏡的總放大率(Mt)應(yīng)為： Mt = MobMeMph Mt：總放大率；Mob：物鏡放大率； Me：目鏡放大率；Mph：攝影透鏡放大率 一般鏡檢觀察時(shí)，攝影附加透鏡的放大倍率不計(jì)算在內(nèi)，因它未參于造像，顯微鏡辨別細(xì)微結(jié)構(gòu)的能力，不

8、取決于總放大率，而歸于物鏡的分辨率。顯微鏡的總放大率絕非愈高愈好，有其適量范圍：最低和最高界限。適宜的總放大率是所用物鏡數(shù)值孔徑的5001000倍。在此范圍稱作有效放大率。例如：使用400.65物鏡時(shí)，應(yīng)選配適宜的目鏡倍數(shù)范圍。 如何提高分辨力首先計(jì)算出有效放大倍率 0.655000.651000=325-650再用物鏡放大倍率除以有效放大率： 3254065040=8-16求得的數(shù)值是應(yīng)選配的目鏡放大倍率的范圍，即要選用8-16的目鏡?？傊?，總放大率超過(guò)物鏡數(shù)值孔徑的1000倍時(shí)，細(xì)微結(jié)構(gòu)分辨不清，為空的放大，低于500倍時(shí)由于放大率過(guò)低，肉眼難以分辨。如何提高分辨力焦點(diǎn)深度 當(dāng)顯微鏡對(duì)被檢

9、樣品的某一點(diǎn)或平面準(zhǔn)焦時(shí)，影像的清晰范圍，不局限于這一點(diǎn)或面，在某上下的一定距離或深度內(nèi)也是清晰的。這段清晰的距離或深度，就叫做焦點(diǎn)深度，簡(jiǎn)稱焦深，焦深長(zhǎng)表示清晰的上下范圍或深度大，焦深短，清晰的上下界限短。 顯微鏡的焦深可變，它與物鏡的數(shù)值孔徑和總放大率相關(guān)。焦深與物鏡的數(shù)值孔徑和總放大率成反比，收縮孔徑。影像的焦深加大，提高物鏡的數(shù)值孔徑，清晰深度變小，總放大率提高，焦深度小，總放大率降低，焦深加大。使用同一物鏡，配用倍率的目鏡，其焦深隨目鏡倍率加大而減少。 如何提高分辨力實(shí)驗(yàn)用品(一)材料：草履蟲，洋蔥內(nèi)表皮，紫鴨趾草等花粉，菠菜葉。(二)用品：普通光學(xué)顯微鏡，暗視野顯微鏡，相差顯微鏡，熒光顯微鏡，載玻片，蓋玻片，吸管，鑷子，剪刀等。實(shí)驗(yàn)方法l觀察草履蟲的外形、運(yùn)動(dòng)、纖毛、食物泡等。 取少許棉花纖維或擦鏡紙纖維，放