發(fā)酵豆粕品質(zhì)檢測方法適用性

1、農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 發(fā)酵豆粕價(jià)值發(fā)酵豆粕價(jià)值發(fā)酵豆粕：優(yōu)質(zhì)的尤其適用于幼小動(dòng)物的蛋白質(zhì)飼料。加工過程：以豆粕為原料，通過多菌種發(fā)酵轉(zhuǎn)化而來。價(jià)值實(shí)現(xiàn)：抗?fàn)I養(yǎng)因子消除 蛋白質(zhì)“預(yù)消化” 微生物代謝產(chǎn)物 微生物菌體益生作用品質(zhì)檢測:除常規(guī)營養(yǎng)等檢測外，圍繞上述作用開展針對性檢測。品質(zhì)檢測結(jié)果與動(dòng)物飼喂結(jié)果一致性要求。 發(fā)酵豆粕作為一種優(yōu)質(zhì)的飼料蛋白質(zhì)，養(yǎng)發(fā)酵豆粕作為一種優(yōu)質(zhì)的飼料蛋白質(zhì)，養(yǎng)殖效果得到了廣泛的認(rèn)可和大量應(yīng)用。殖效果得到了廣泛的認(rèn)可和大量應(yīng)用。 發(fā)酵豆粕品質(zhì)鑒別及分析方法初步建立，發(fā)酵豆粕品質(zhì)鑒別及分析方法初步建立，仍不完善，方法適用性和結(jié)果準(zhǔn)確分析仍

2、仍不完善，方法適用性和結(jié)果準(zhǔn)確分析仍需要進(jìn)一步明確。需要進(jìn)一步明確。目目 錄錄 1、原料組成分析、原料組成分析 2、大豆抗原的分解、大豆抗原的分解 3、大豆低聚糖檢測、大豆低聚糖檢測 4、大豆多肽分析、大豆多肽分析 5、其他檢測指標(biāo)、其他檢測指標(biāo)1 1、發(fā)酵豆粕的原料構(gòu)成分析、發(fā)酵豆粕的原料構(gòu)成分析 受成本和利益的驅(qū)使，少數(shù)廠家在發(fā)酵豆受成本和利益的驅(qū)使，少數(shù)廠家在發(fā)酵豆粕生產(chǎn)中添加低值低成本的其它原料，嚴(yán)粕生產(chǎn)中添加低值低成本的其它原料，嚴(yán)重下降了發(fā)酵豆粕的品質(zhì)。重下降了發(fā)酵豆粕的品質(zhì)。 通過對通過對大豆異黃酮和氨基酸大豆異黃酮和氨基酸的含量分析，的含量分析，能夠判斷發(fā)酵豆粕中是否添加有非豆

3、粕成能夠判斷發(fā)酵豆粕中是否添加有非豆粕成分和粗略添加比例。分和粗略添加比例。1.11.1豆粕發(fā)酵過程中影響大豆異黃酮的因素豆粕發(fā)酵過程中影響大豆異黃酮的因素 物理因素影響（加工工藝的影響）物理因素影響（加工工藝的影響） 粉碎、干燥等工藝過程的影響。粉碎也是粉碎、干燥等工藝過程的影響。粉碎也是因?yàn)闇囟榷鹱饔?。因?yàn)闇囟榷鹱饔谩?化學(xué)因素影響（化學(xué)因素影響（pH的影響）的影響） 工藝中不添加化學(xué)物質(zhì)，主要是工藝中不添加化學(xué)物質(zhì)，主要是pH的影響。的影響。 生物因素影響（發(fā)酵菌株的影響）生物因素影響（發(fā)酵菌株的影響） 微生物及其酶的作用微生物及其酶的作用1.1.11.1.1加工工藝（溫度）對發(fā)酵豆

4、粕大豆異黃加工工藝（溫度）對發(fā)酵豆粕大豆異黃酮的影響酮的影響 110熱處理對大豆異黃酮的影響熱處理對大豆異黃酮的影響 0h 1h 3h 5h 7h 9h 12h 14h 16h0.97 0.95 0.96 0.98 0.95 0.99 0.97 1.03 1.00 加熱處理不會(huì)破壞大豆異黃酮。加熱處理不會(huì)破壞大豆異黃酮。1.1.2 1.1.2 微生物發(fā)酵菌株對發(fā)酵豆粕大豆異黃微生物發(fā)酵菌株對發(fā)酵豆粕大豆異黃酮的影響酮的影響 菌株對大豆異黃酮的影響菌株對大豆異黃酮的影響 CK 枯草枯草 地衣地衣 短小短小 乳桿菌乳桿菌 1 乳酸菌乳酸菌2 乳酸菌乳酸菌30.97 1.15 1.08 1.083

5、0.99 0.98 0.94100% 98 102 97 98 98 101 酵母菌酵母菌1 酵母菌酵母菌2 混菌發(fā)酵混菌發(fā)酵 黑曲霉黑曲霉 根霉根霉 毛霉毛霉1.00 0.99 1.13 1.23 1.03 1.05 99 98 100 97 99 97 微生物發(fā)酵菌株不會(huì)破壞大豆異黃酮微生物發(fā)酵菌株不會(huì)破壞大豆異黃酮1.1.3 pH1.1.3 pH的影響的影響發(fā)酵豆粕的酸度不會(huì)破壞大豆異黃酮。發(fā)酵豆粕的酸度不會(huì)破壞大豆異黃酮。CK3.54.04.55.05.56.00.97 0.94 0.98 0.95 0.99 0.97 0.99不同不同pH對大豆異黃酮的影響對大豆異黃酮的影響 異黃酮檢

6、測結(jié)結(jié)果：異黃酮檢測結(jié)結(jié)果：樣品中存在非豆粕成分樣品中存在非豆粕成分氨基酸的對比氨基酸的對比 豆粕發(fā)酵后，微生物的生物量在豆粕發(fā)酵后，微生物的生物量在100-200億每克，億每克，100克產(chǎn)品中微生物菌體蛋白質(zhì)含克產(chǎn)品中微生物菌體蛋白質(zhì)含量為量為0.5-1克，發(fā)酵后不會(huì)顯著改變原有氨克，發(fā)酵后不會(huì)顯著改變原有氨基酸的組成，發(fā)酵產(chǎn)品氨基酸對豆粕氨基基酸的組成，發(fā)酵產(chǎn)品氨基酸對豆粕氨基酸的增加值與粗蛋白的增加值相當(dāng)，變異酸的增加值與粗蛋白的增加值相當(dāng)，變異幅度在幅度在10%左右，可以根據(jù)這一規(guī)律判斷左右，可以根據(jù)這一規(guī)律判斷發(fā)酵豆粕的原料組成。發(fā)酵豆粕的原料組成。氨基酸含量分析：氨基酸含量分析：

7、氨基酸含量通過日立氨基酸含量通過日立835-50835-50氨基酸自動(dòng)檢測儀來氨基酸自動(dòng)檢測儀來測定。測定。 氨基酸種類氨基酸種類 發(fā)酵前豆粕（）發(fā)酵前豆粕（） 發(fā)酵后豆粕（）比值發(fā)酵后豆粕（）比值 蘇氨酸蘇氨酸(Thr) 1.945 (Thr) 1.945 2.237 1.152.237 1.15 絲氨酸絲氨酸(Ser)(Ser) 2.153 2.153 2.808 1.302.808 1.30 谷氨酸谷氨酸(Glu) 7.231 (Glu) 7.231 9.534 1.329.534 1.32 甘氨酸甘氨酸(Gly) 2.287 (Gly) 2.287 2.702 1.182.702 1.

8、18 丙氨酸丙氨酸(Ala) 2.350 (Ala) 2.350 2.693 1.152.693 1.15 纈氨酸纈氨酸(Val ) 2.522 (Val ) 2.522 3.144 1.203.144 1.20 蛋氨酸蛋氨酸(Met) 0.568 (Met) 0.568 0.670 1.180.670 1.18 異亮氨酸異亮氨酸(Ile) 2.356 (Ile) 2.356 2.543 1.082.543 1.08續(xù)表：續(xù)表：氨基酸種類氨基酸種類 發(fā)酵前豆粕（）發(fā)酵前豆粕（） 發(fā)酵后豆粕（）發(fā)酵后豆粕（） 比值比值亮氨酸亮氨酸(Leu) 4.098 (Leu) 4.098 4.459 1.0

9、9 4.459 1.09 苯丙氨酸苯丙氨酸(Phe) 2.310 (Phe) 2.310 2.799 1.202.799 1.20賴氨酸賴氨酸(Lys) 2.910 (Lys) 2.910 3.978 1.363.978 1.36總氨基酸含量總氨基酸含量 44.770 44.770 55.115 1.2355.115 1.23粗蛋白粗蛋白 46 56 1.2246 56 1.22 發(fā)酵后粗蛋白由發(fā)酵后粗蛋白由46%46%提高到提高到56%56%，增加，增加22%22%，各單個(gè)氨，各單個(gè)氨基酸含量較發(fā)酵前都有相應(yīng)增加；總氨基酸較發(fā)酵前提基酸含量較發(fā)酵前都有相應(yīng)增加；總氨基酸較發(fā)酵前提高了高了23

10、23。 2 2、大豆抗原的分解、大豆抗原的分解原理：利用原理：利用7S與與11S蛋白抗原的蛋白抗原的SDS-PAGE電電泳圖譜直接展示。根據(jù)電泳圖譜的顏色及大小泳圖譜直接展示。根據(jù)電泳圖譜的顏色及大小定性判斷抗原的分解程度。定性判斷抗原的分解程度。 SDS-PAGE電泳展示的是溶解的蛋白質(zhì)，電泳展示的是溶解的蛋白質(zhì)，因此影響蛋白質(zhì)溶解的工藝過程，如高溫干燥因此影響蛋白質(zhì)溶解的工藝過程，如高溫干燥工藝，發(fā)酵添加物，人工酸化以及使用陳化豆工藝，發(fā)酵添加物，人工酸化以及使用陳化豆粕都將影響蛋白質(zhì)溶解率，使電泳圖變淺變小，粕都將影響蛋白質(zhì)溶解率，使電泳圖變淺變小，出現(xiàn)分解好的假性結(jié)果。出現(xiàn)分解好的假性

11、結(jié)果。 目前這一方法存在較大局限性，不易作為品質(zhì)分目前這一方法存在較大局限性，不易作為品質(zhì)分析指標(biāo)析指標(biāo)。7S7S與與11S 11S 球蛋白的球蛋白的SDS-PAGESDS-PAGE電泳電泳 從圖中可以看出：從圖中可以看出：CK中存在中存在7S球蛋白的三個(gè)亞基球蛋白的三個(gè)亞基與與11S球蛋白兩個(gè)亞基。球蛋白兩個(gè)亞基。Ck Ck 為發(fā)酵前豆粕中為發(fā)酵前豆粕中提取的球蛋白。提取的球蛋白。M為低分子蛋白質(zhì)標(biāo)為低分子蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，分子量為準(zhǔn)，分子量為14.4KD97.4KD。2.12.1發(fā)酵豆粕酸溶性蛋白（小肽）及其在堿性條件下發(fā)酵豆粕酸溶性蛋白（小肽）及其在堿性條件下的變化的變化將樣品在堿性下（pH8

12、.8）提蛋白，離心所得上清。 原豆粕編號(hào)（Y） 在pH調(diào)至6.85，發(fā)酵豆粕編號(hào)（7）pH調(diào)至6.05時(shí)開始出現(xiàn)明顯沉淀 。 原豆粕編號(hào)（Y） 和發(fā)酵豆粕編號(hào)（7）pH調(diào)至4.5時(shí)酸溶性蛋白（小肽）沉淀狀況 。 2.22.2陳化豆粕與大豆分離蛋白的陳化豆粕與大豆分離蛋白的SDS-PAGESDS-PAGE電泳結(jié)果電泳結(jié)果 樣品濃度 mg/ml 2010年豆粕(A) 1.83 2012年豆粕(B) 2.38 大豆分離蛋白(C) 2.66隨著豆粕存放時(shí)間延長，堿溶性蛋白質(zhì)下降， A B C隨著存放時(shí)間的延長，肽鏈的空間結(jié)構(gòu)有緊縮的趨勢2.22.2添加金屬鹽的影響添加金屬鹽的影響低低 較低較低 中中

13、高高 CKA鹽2.22.2添加金屬鹽的影響添加金屬鹽的影響B(tài)鹽和C鹽注：1、2、3和4分別為B鹽的低、較低、中、高劑量，5、6、7、8分別為C鹽的低、較低、中、高劑量。2.32.3加熱處理豆粕的加熱處理豆粕的SDS-PAGESDS-PAGE電泳結(jié)果電泳結(jié)果0h0h、1h1h、3h3h、5h5h、9h9h、15h15h為原豆粕經(jīng)為原豆粕經(jīng)115115處理時(shí)間處理時(shí)間2.4 酸處理豆粕的酸處理豆粕的SDS-PAGE電泳結(jié)果電泳結(jié)果方法：方法：HCl配成配成0%、1%、2%、3%、4%、5%濃度，按濃度，按50%的的量添加到原豆粕中，量添加到原豆粕中，35烘干。烘干。0%、1%、2%、3%、4%、5

14、%為加緩沖液提取，但不調(diào)為加緩沖液提取，但不調(diào)p H0%、1%、2%、3%、4%、5%為加緩沖液提取，調(diào)為加緩沖液提取，調(diào)p H8.8 不同發(fā)酵豆粕樣品堿性可溶性蛋白濃度不同發(fā)酵豆粕樣品堿性可溶性蛋白濃度 樣品編號(hào)蛋白濃度 （mg/ml） CK 2.42 A 2.42 C 1.85 Y2 2.23 S1 1.75 2 3.85 7 3.66 理論上堿溶性蛋白濃度在25mg/ml,實(shí)際上在1.753.85mg/ml之間，提取蛋白質(zhì)僅占蛋白質(zhì)7%15%。不同發(fā)酵豆粕絕對上樣量相同電泳圖不同發(fā)酵豆粕絕對上樣量相同電泳圖濃縮膠濃度5%，分離膠濃度15% 7 2 S1 Y2 C A CK 結(jié)合上面分析結(jié)

15、果，不同產(chǎn)品雖然電泳結(jié)果存在較大差異，但它不能真正說明誰優(yōu)誰劣。 綜合來看，影響蛋白質(zhì)肽鏈空間結(jié)構(gòu)（或松散或緊密），電荷多少的條件，如存放時(shí)間、干燥溫度、干燥時(shí)間、鹽種類、鹽濃度等都影響電泳結(jié)果，且經(jīng)多重加工后，堿溶性提取蛋白質(zhì)不到全部蛋白質(zhì)的20%。因此，電泳膠的結(jié)果不能科學(xué)客觀反映蛋白質(zhì)降解狀況。因此，因此，SDS-PAGESDS-PAGE電泳結(jié)果在直觀認(rèn)識(shí)大豆蛋白質(zhì)特電泳結(jié)果在直觀認(rèn)識(shí)大豆蛋白質(zhì)特點(diǎn)、組成時(shí)是有意義的，在當(dāng)前技術(shù)條件下，不能點(diǎn)、組成時(shí)是有意義的，在當(dāng)前技術(shù)條件下，不能作為發(fā)酵豆粕質(zhì)量的判別依據(jù)。作為發(fā)酵豆粕質(zhì)量的判別依據(jù)。3 3、大豆低聚糖檢測、大豆低聚糖檢測 在豆粕中低

16、聚糖主要為在豆粕中低聚糖主要為水蘇糖、棉籽糖和蔗糖水蘇糖、棉籽糖和蔗糖。它們在干基含量分別為它們在干基含量分別為4 4、2 2、5 5。 棉籽糖棉籽糖是半乳糖以是半乳糖以（1 1，6 6）糖苷鍵與葡萄糖）糖苷鍵與葡萄糖基連接?；B接。 水蘇糖水蘇糖是半乳糖以是半乳糖以（1 1，6 6）糖苷鍵與棉籽糖）糖苷鍵與棉籽糖中半乳糖基連接。中半乳糖基連接。 液相色譜可以進(jìn)行準(zhǔn)確定量，一般不具備檢測液相色譜可以進(jìn)行準(zhǔn)確定量，一般不具備檢測條件；薄層層析簡單，直觀，企業(yè)可進(jìn)行分析。條件；薄層層析簡單，直觀，企業(yè)可進(jìn)行分析。 3.1 大豆低聚糖大豆低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品棉籽糖與水蘇糖的液相色譜圖標(biāo)準(zhǔn)品棉籽糖與水蘇糖的液

17、相色譜圖保留時(shí)間：棉籽糖保留時(shí)間：棉籽糖 7.462min 水蘇糖水蘇糖 12.002 min發(fā)酵前原豆粕中棉籽糖與水蘇糖的液發(fā)酵前原豆粕中棉籽糖與水蘇糖的液相色譜圖相色譜圖保留時(shí)間：棉籽糖保留時(shí)間：棉籽糖 7.447min 水蘇糖水蘇糖 11.917 min峰高：水蘇糖峰高：水蘇糖 2.10cm水水蘇蘇糖糖棉棉籽籽糖糖3.23.2薄層層析薄層層析 4.4.大豆多肽大豆多肽大豆多肽定義：大豆多肽定義： 以大豆，豆粕或大豆蛋白為主要原料，以大豆，豆粕或大豆蛋白為主要原料，用酶解法或微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的，分子用酶解法或微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的，分子量分布在量分布在10000Da以下的肽稱為大豆多以下的肽稱

18、為大豆多肽。肽。能夠指示豆粕蛋白質(zhì)的水解狀態(tài)。能夠指示豆粕蛋白質(zhì)的水解狀態(tài)。4.14.1大豆多肽分析方法大豆多肽分析方法 由于精確分析難度大，一般以三氯由于精確分析難度大，一般以三氯乙酸乙酸-可溶性氮指數(shù)可溶性氮指數(shù) (TCA-SNI)和水和水解度解度(DH)表示。表示。對蛋白質(zhì)水解由于存在內(nèi)切酶和外對蛋白質(zhì)水解由于存在內(nèi)切酶和外切酶的差距，上述方法不能完全準(zhǔn)切酶的差距，上述方法不能完全準(zhǔn)確預(yù)示一個(gè)混合蛋白質(zhì)或飼料原料確預(yù)示一個(gè)混合蛋白質(zhì)或飼料原料蛋白質(zhì)水解狀況。蛋白質(zhì)水解狀況。 4.1.1三氯乙酸-可溶性氮指數(shù) (TCA-SNI)的測定 將發(fā)酵豆粕水溶液與濃度為將發(fā)酵豆粕水溶液與濃度為10%

19、的三氯的三氯乙酸以乙酸以1: 1比例混合，比例混合，4500 r/min離心離心10 min后取上清液用凱氏定氮法測定。后取上清液用凱氏定氮法測定。 4.1.2水解度(DH)的測定 蛋白質(zhì)水解度蛋白質(zhì)水解度 (DH) 的定義為水解過程中的定義為水解過程中打開的肽鍵占蛋白質(zhì)肽鍵總數(shù)的百分比，打開的肽鍵占蛋白質(zhì)肽鍵總數(shù)的百分比，采用甲醛法測定采用甲醛法測定 。溫度對溫度對DHDH和和TCA-SNITCA-SNI的影響的影響 大豆蛋白質(zhì)肽鏈分子量主要分布在大豆蛋白質(zhì)肽鏈分子量主要分布在40000-70000之間，平均約為之間，平均約為55000。以。以此推算，氨基酸殘基數(shù)約為此推算，氨基酸殘基數(shù)約為

20、458（氨基酸（氨基酸平均分子量取平均分子量取120），有），有457個(gè)肽鍵，若個(gè)肽鍵，若水解度為水解度為10%，即有，即有45個(gè)肽鍵被分解，個(gè)肽鍵被分解，產(chǎn)生產(chǎn)生46個(gè)分子，其平均分子量為個(gè)分子，其平均分子量為55000/46=1195，其水溶性指數(shù)理論上是，其水溶性指數(shù)理論上是100%，與上述，與上述40%相差甚遠(yuǎn)。相差甚遠(yuǎn)。4.1.3 4.1.3 酸溶性氮指數(shù)法酸溶性氮指數(shù)法1 1、發(fā)酵豆粕水溶（蒸餾水，一般按、發(fā)酵豆粕水溶（蒸餾水，一般按1 1：5 5），）， 調(diào)調(diào)至至pH=4.5pH=4.5，并于，并于12000rpm12000rpm離心離心10min10min（或過濾），（或過濾）

21、，取上清檢測。取上清檢測。2 2、采用凱式定氮法檢測上清中氮的含量（、采用凱式定氮法檢測上清中氮的含量（a a）：）：3 3、直接取上清液（不消化）檢測無機(jī)氮（主要是、直接取上清液（不消化）檢測無機(jī)氮（主要是銨態(tài)氮）銨態(tài)氮） （b b）；）；4 4、樣品中多肽量的計(jì)算、樣品中多肽量的計(jì)算多肽量多肽量= =（a-ba-b）* *蛋白質(zhì)換算系數(shù)蛋白質(zhì)換算系數(shù)4.24.2發(fā)酵豆粕多肽含量發(fā)酵豆粕多肽含量液體酶解條件下，在底物（大豆蛋白）和蛋液體酶解條件下，在底物（大豆蛋白）和蛋白酶都過量情況下，大豆多肽含量最高在白酶都過量情況下，大豆多肽含量最高在6.5%-7.0%。固體發(fā)酵由于受到水分限制，發(fā)酵豆

22、粕產(chǎn)品固體發(fā)酵由于受到水分限制，發(fā)酵豆粕產(chǎn)品的多肽含量理論上不會(huì)超過的多肽含量理論上不會(huì)超過10%。有些產(chǎn)品超過有些產(chǎn)品超過10%，是非蛋白氮較高，或者，是非蛋白氮較高，或者加入氨基酸生產(chǎn)廢液廢渣。加入氨基酸生產(chǎn)廢液廢渣。底物濃度與多肽含量的關(guān)系底物濃度與多肽含量的關(guān)系5 5、胰蛋白酶抑制劑的測定（、胰蛋白酶抑制劑的測定（GB/T 21498-2008GB/T 21498-2008） 原理原理：胰蛋白酶抑制劑能夠和胰蛋白酶結(jié)合，通過測：胰蛋白酶抑制劑能夠和胰蛋白酶結(jié)合，通過測定底物（定底物（BAPABAPA）被未結(jié)合的胰蛋白酶酶解生成的）被未結(jié)合的胰蛋白酶酶解生成的產(chǎn)物產(chǎn)物對硝基苯胺溶液的吸光

23、度，然后以它和對硝基苯胺溶液的吸光度，然后以它和未加抑制劑的標(biāo)準(zhǔn)吸光度之差來表示被抑制的胰未加抑制劑的標(biāo)準(zhǔn)吸光度之差來表示被抑制的胰蛋白酶活性。蛋白酶活性。6 6、植酸含量的測定、植酸含量的測定 原理原理：用分光光度法測定用過量的：用分光光度法測定用過量的FeFe3+3+與植酸反與植酸反應(yīng)后的上清液中剩余應(yīng)后的上清液中剩余FeFe3+3+，從而間接測定植酸含，從而間接測定植酸含量。量。、7 7、脂肪氧化酶活性的測定、脂肪氧化酶活性的測定原理原理：利用豆粕中的脂肪氧化酶與不飽和脂肪酸：利用豆粕中的脂肪氧化酶與不飽和脂肪酸亞油酸反應(yīng)，測定反應(yīng)物的吸光值大小來表亞油酸反應(yīng)，測定反應(yīng)物的吸光值大小來表示酶活的大小。示酶活的大小。、 9 9、 脲酶活性的測定脲酶活性的測定 原理原理：將粉碎的豆粕與中性尿素緩沖溶液混合：將粉碎的豆粕與中性尿素緩沖溶液混合, ,在在3030保持保持30min, 30min, 尿素酶催化尿素水解產(chǎn)生氨的反尿素酶催化尿素水解產(chǎn)生氨的反應(yīng)。用過量鹽酸中和所產(chǎn)生的氨應(yīng)。用過量鹽酸中和所產(chǎn)生的氨, ,再用氫氧化鈉標(biāo)再用氫氧化鈉