實驗一細胞培養(yǎng)技術1

1、實驗一實驗一 細胞培養(yǎng)技術細胞培養(yǎng)技術一、定義：一、定義：細胞培養(yǎng)（細胞培養(yǎng)（cell culture）是指將動物組織或細胞分）是指將動物組織或細胞分散成單個細胞，在模擬機體內的生長環(huán)境下使其繼散成單個細胞，在模擬機體內的生長環(huán)境下使其繼續(xù)生長增殖的過程。續(xù)生長增殖的過程。一般體外培養(yǎng)的細胞不會發(fā)生分化成為組織，在體一般體外培養(yǎng)的細胞不會發(fā)生分化成為組織，在體外培養(yǎng)的條件下可以觀察細胞生命活動規(guī)律，此外外培養(yǎng)的條件下可以觀察細胞生命活動規(guī)律，此外收獲細胞本身的同時也可以收獲細胞的產物。收獲細胞本身的同時也可以收獲細胞的產物。1、美國生物學家哈里森于、美國生物學家哈里森于1907年采用蓋片覆蓋凹

2、窩玻璃懸滴培年采用蓋片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法將蛙胚的神經組織培養(yǎng)在淋巴液中，存活了幾周，開創(chuàng)了養(yǎng)法將蛙胚的神經組織培養(yǎng)在淋巴液中，存活了幾周，開創(chuàng)了細胞培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)。2、1923年，卡瑞爾發(fā)明了卡士瓶培養(yǎng)法，擴大了培養(yǎng)組織的生年，卡瑞爾發(fā)明了卡士瓶培養(yǎng)法，擴大了培養(yǎng)組織的生存空間。存空間。3、1951年，厄爾利開發(fā)了動物細胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基，動物細年，厄爾利開發(fā)了動物細胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基，動物細胞培養(yǎng)技術開始形成。胞培養(yǎng)技術開始形成。4、20世紀世紀70年代，大規(guī)模微生物培養(yǎng)技術的出現，幾乎代替了年代，大規(guī)模微生物培養(yǎng)技術的出現，幾乎代替了動物的細胞培養(yǎng)，但在生產過程中，出現了許多生物活性蛋

3、白動物的細胞培養(yǎng)，但在生產過程中，出現了許多生物活性蛋白質只能在動物細胞中產生，因為原核細胞缺乏蛋白質轉錄后修質只能在動物細胞中產生，因為原核細胞缺乏蛋白質轉錄后修飾能力，也不能將蛋白質產物自動分泌到細胞外。飾能力，也不能將蛋白質產物自動分泌到細胞外。5、20世紀世紀80年代：基因工程技術和細胞融合技術迅速發(fā)展，能年代：基因工程技術和細胞融合技術迅速發(fā)展，能把特定的外源基因轉染到動物細胞體內，使其得到高質量的表把特定的外源基因轉染到動物細胞體內，使其得到高質量的表達。達。二、發(fā)展的歷史二、發(fā)展的歷史 包括病毒疫苗，非抗體免疫調節(jié)劑，多肽生包括病毒疫苗，非抗體免疫調節(jié)劑，多肽生長因子，酶類，激素

4、，腫瘤特異性抗原，單長因子，酶類，激素，腫瘤特異性抗原，單克隆抗體，病毒殺蟲劑等?？寺】贵w，病毒殺蟲劑等。三、動物細胞生產的生物制品三、動物細胞生產的生物制品1.培養(yǎng)細胞的生長方式培養(yǎng)細胞的生長方式貼附生長：貼附生長： 必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實體瘤細胞。體瘤細胞。懸浮生長：懸浮生長： 于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統腫瘤細胞。表面。見于各種造血系統腫瘤細胞。四、培養(yǎng)細胞的生長特性四、培養(yǎng)細胞的生長特性2.每代貼附生長細胞的生長過程每代貼附生長細胞的生長過程游離期游離期貼

5、壁期貼壁期潛伏期潛伏期對數期對數期平臺期平臺期衰退期衰退期2.每代貼附生長細胞的生長過程每代貼附生長細胞的生長過程游離期：細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)也游離期：細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)也稱懸浮期。此時細胞質回縮，胞體呈圓球形。一般稱懸浮期。此時細胞質回縮，胞體呈圓球形。一般維持維持10分鐘至分鐘至4小時。小時。貼壁期：細胞附著于底物上，游離期結束。細胞貼壁期：細胞附著于底物上，游離期結束。細胞株平均在株平均在10分鐘至分鐘至4小時貼壁。底物：膠原、玻璃、小時貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等。塑料、其它細胞等。潛伏期：貼壁后并不馬上分裂而是有一個潛伏期，潛伏期：貼壁后并不馬上分裂

6、而是有一個潛伏期，該期長短與接種量、細胞種類有關，一般為該期長短與接種量、細胞種類有關，一般為6至至24小小時。時。2.每代貼附生長細胞的生長過程每代貼附生長細胞的生長過程對數生長期：細胞分裂旺盛，可持續(xù)對數生長期：細胞分裂旺盛，可持續(xù)35天，天，細胞接觸匯合成片，腫瘤細胞或轉化細胞可發(fā)生細胞接觸匯合成片，腫瘤細胞或轉化細胞可發(fā)生細胞堆積，正常細胞無此現象。細胞堆積，正常細胞無此現象。穩(wěn)定期（平臺期）：細胞達一定數量后，由于穩(wěn)定期（平臺期）：細胞達一定數量后，由于培養(yǎng)空間與營養(yǎng)物質有限，特別是代謝廢物積累培養(yǎng)空間與營養(yǎng)物質有限，特別是代謝廢物積累的不利條件下，細胞進入新生的細胞數等于死亡的不利

7、條件下，細胞進入新生的細胞數等于死亡細胞數的動態(tài)平衡時間。細胞數的動態(tài)平衡時間。衰亡期：營養(yǎng)物的耗盡和有害物質的作用，細衰亡期：營養(yǎng)物的耗盡和有害物質的作用，細胞進入衰亡期，活細胞減少，死細胞增多。胞進入衰亡期，活細胞減少，死細胞增多。3.細胞的生長條件細胞的生長條件恒定的溫度：恒定的溫度：37，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱恒定的濕度恒定的濕度:培養(yǎng)箱中有水盤培養(yǎng)箱中有水盤等滲環(huán)境：培養(yǎng)液提供等滲環(huán)境：培養(yǎng)液提供營養(yǎng)物質：培養(yǎng)液提供營養(yǎng)物質：培養(yǎng)液提供無污染：包括微生物的污染和雜質的污染無污染：包括微生物的污染和雜質的污染 要求使用純水，并對所有和細胞接觸的物品都要清洗干凈并滅菌，培養(yǎng)液中還要加入青

8、鏈霉素，操作在無菌環(huán)境下進行培養(yǎng)用器皿：培養(yǎng)皿，培養(yǎng)瓶等培養(yǎng)用器皿：培養(yǎng)皿，培養(yǎng)瓶等氣體：培養(yǎng)器皿并非完全密閉的，細菌不能通過，氣體可以氣體：培養(yǎng)器皿并非完全密閉的，細菌不能通過，氣體可以盡量恒定的盡量恒定的pH值：值：NaHCO3與與CO2形成緩沖對。形成緩沖對。5% CO2 。各種操作液：如胰酶，各種操作液：如胰酶，EDTA，PBS等。等。此外還要對細胞狀態(tài)進行觀察和監(jiān)測（倒置顯微鏡）。此外還要對細胞狀態(tài)進行觀察和監(jiān)測（倒置顯微鏡）。五、實驗準備工作五、實驗準備工作1.實驗器具及設備：實驗器具及設備：v超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，

9、酸缸器，酸缸vCO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱v倒置顯微鏡倒置顯微鏡v液氮罐液氮罐v自動雙重純水蒸餾器，純水儀自動雙重純水蒸餾器，純水儀v耗材：細胞培養(yǎng)瓶，細胞培養(yǎng)板，細胞凍存管耗材：細胞培養(yǎng)瓶，細胞培養(yǎng)板，細胞凍存管超凈工作臺超凈工作臺超凈工作臺的工作原理超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅動空氣是利用鼓風機驅動空氣遁過高效濾器除去空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒和細菌，中的塵埃顆粒和細菌，使空氣得到凈化。凈化使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內構成無菌環(huán)使工作臺內構成無菌環(huán)境。境。 壓力蒸汽消毒器壓力蒸汽消毒器高壓蒸汽滅菌鍋高壓蒸汽滅菌鍋濕熱消毒，用途廣。濕熱消毒

10、，用途廣。電熱干燥箱電熱干燥箱干熱消毒干熱消毒180 ，作用作用2小時至小時至4小小時。主要用于玻時。主要用于玻璃器皿的消毒璃器皿的消毒 。濾器及濾膜濾器及濾膜過濾除菌：大多數培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、過濾除菌：大多數培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌血清、酶液等均采用濾過法除菌 。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設定的條件為培養(yǎng)箱設定的條件為37，5CO2。使用。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應注意的問題：注意的問題：用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。蓋微松，以保證通氣。保持培養(yǎng)箱內空氣干凈。定期消保持培養(yǎng)箱內空氣

11、干凈。定期消毒。毒。箱內蒸餾水槽中應放置滅菌蒸餾箱內蒸餾水槽中應放置滅菌蒸餾水水3000毫升以保持箱內濕度，避免毫升以保持箱內濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。培養(yǎng)液蒸發(fā)。倒置顯微鏡倒置顯微鏡液氮罐液氮罐自動雙重純水蒸餾器自動雙重純水蒸餾器 純水儀純水儀細胞培養(yǎng)板細胞培養(yǎng)板細胞培養(yǎng)瓶細胞培養(yǎng)瓶離心管離心管凍存管凍存管2.常用器皿清洗常用器皿清洗v玻璃器皿用玻璃器皿用自來水浸泡、洗滌劑刷洗、烘自來水浸泡、洗滌劑刷洗、烘干、浸干、浸酸酸（24小時）。小時）。v流動的流動的自來水洗自來水洗10遍，蒸溜水遍，蒸溜水沖洗沖洗3次，三次，三蒸水或純凈水洗蒸水或純凈水洗1次，次，180干熱滅菌干熱滅菌4h-6h。v塑料

12、及橡膠制品等，超聲波清洗塑料及橡膠制品等，超聲波清洗3次，次，121高壓濕熱滅菌高壓濕熱滅菌15min,烘干備用。烘干備用。3.細胞培養(yǎng)用液的配制細胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮的三蒸水或去離子水水：新鮮的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液的緩沖液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至加水至1000 ml消化液消化液v胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架

13、，從而使細胞分離。而使細胞分離。 v胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。度會損傷細胞。v胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25。用濾器過濾除菌。用濾器過濾除菌。v胰蛋白酶液消化時間：胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。分鐘。v用含血清培養(yǎng)液可以終止其對細胞的消化作用。用含血清培養(yǎng)液可以終止其對細胞的消化作用。培養(yǎng)基培養(yǎng)基 （1）天然培養(yǎng)基）天然培養(yǎng)基v天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚天然培養(yǎng)基有血清、血

14、漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。和牛胚浸液）。v優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好v缺點：來源受限。缺點：來源受限。v成分復雜，影響對某些實驗產物的提取和實驗結果成分復雜，影響對某些實驗產物的提取和實驗結果的分析。的分析。v易發(fā)生支原體污染。易發(fā)生支原體污染。 培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。（2）合成培養(yǎng)基）合成培養(yǎng)基v合成培養(yǎng)基是根據細胞生存所需物質的種類和數量，合成培養(yǎng)基是根據細胞生存所需物質的種類和數量，用人工方法模擬合成的。目前已設計出許

15、多種培養(yǎng)用人工方法模擬合成的。目前已設計出許多種培養(yǎng)基，如基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM、DF12等。等。v合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質。物、無機鹽和其它一些輔助物質。v優(yōu)點：標準化生產，組分和含量相對固定。成本低。優(yōu)點：標準化生產，組分和含量相對固定。成本低。 v缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。需要。 v在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內常加適量抗菌素，以抑在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。制可能

16、存在的細菌的生長。v青霉素抑制細菌的細胞壁合成。青霉素抑制細菌的細胞壁合成。v鏈霉素抑制細菌蛋白質的合成。鏈霉素抑制細菌蛋白質的合成。v通常是青霉素和鏈霉素聯合使用。培養(yǎng)基內青霉素、通常是青霉素和鏈霉素聯合使用。培養(yǎng)基內青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。單位。抗菌素的使用抗菌素的使用六、細胞的培養(yǎng)方法六、細胞的培養(yǎng)方法v主要包括兩種主要包括兩種 1.原代培養(yǎng)：將機體取出的組織或細胞進行初次原代培養(yǎng)：將機體取出的組織或細胞進行初次培養(yǎng)的過程。培養(yǎng)的過程。 2.傳代培養(yǎng)：從原代培養(yǎng)的細胞繼續(xù)轉接培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：從原代培養(yǎng)的細胞繼續(xù)轉接培養(yǎng)。舉例舉例:采用組織塊

17、法培養(yǎng)小鼠心臟組織細胞采用組織塊法培養(yǎng)小鼠心臟組織細胞無菌情況下取出心臟，經無菌情況下取出心臟，經PBS漂洗三次后，放在表面皿中。漂洗三次后，放在表面皿中。在表面皿中，用滴管加入少量培養(yǎng)液（在表面皿中，用滴管加入少量培養(yǎng)液（ RPMI 1640 含含20小牛血清，小牛血清，0.2%白蛋白，白蛋白，10ug/ml胰島素，胰島素，100U青霉素和鏈霉素）用鋒利的剪刀將青霉素和鏈霉素）用鋒利的剪刀將組織塊剪成約組織塊剪成約1mm3的小塊。的小塊。用彎頭鑷子將組織小塊移入細胞瓶中，把它們排列成行，每塊組織相距用彎頭鑷子將組織小塊移入細胞瓶中，把它們排列成行，每塊組織相距約約0.5cm，每瓶細胞貼，每瓶

18、細胞貼2030小塊，隨即翻轉細胞瓶，使貼組織塊的一面小塊，隨即翻轉細胞瓶，使貼組織塊的一面朝上，然后加培養(yǎng)液朝上，然后加培養(yǎng)液3ml。將細胞瓶置于將細胞瓶置于37，5CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)箱中靜置24小時，然后將瓶輕輕翻轉，小時，然后將瓶輕輕翻轉，使組織塊浸入培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜止培養(yǎng)。使組織塊浸入培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜止培養(yǎng)。72小時后在顯微鏡下檢查，若見細胞自組織邊緣長出，則繼續(xù)培養(yǎng)小時后在顯微鏡下檢查，若見細胞自組織邊緣長出，則繼續(xù)培養(yǎng)3-5日，日，再換部分或全部培養(yǎng)液，待多數組織塊的生長暈相接時，可進行傳代培再換部分或全部培養(yǎng)液，待多數組織塊的生長暈相接時，可進行傳代培養(yǎng)。養(yǎng)。 1.細胞的原代培養(yǎng)細胞的原代培養(yǎng):包括組織塊法和消化培養(yǎng)法包括組織塊法和消化培養(yǎng)法2.細胞傳代培養(yǎng)細胞傳代培養(yǎng)根據細胞生長的恃點，采取不同的傳代方法。根據細胞生長的恃點，采取不同的傳代方法。1.懸浮生長細胞傳代懸浮生長細胞傳代 離心法傳代：離心（離心法傳代：離心（1000轉轉/分分）去上清，沉淀物加新培）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。養(yǎng)液后再混勻傳代。 直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除除l2一一23，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。2.半懸浮生長細胞傳代（半懸浮生長細胞傳代（Hela細