育種實驗指導

1、海 南 大 學實 驗 教 學 自 編 教 材作物育種學（育種學原理）實驗指導農(nóng)學院生物技術系編2012年4月實驗一 植物的有性雜交技術一、目的要求 通過有性雜交實際操作，熟悉植物有性雜交技術的主要操作程序。二、實驗用品 1材料：正在開花植物植株。 2用品：70乙醇、鑷子、硫酸紙袋、塑料小牌、棉線、干凈毛筆、放大鏡等。三、時間安排 在實驗課當天選取適當大小的母本花去雄后，于去雄后第二天(利用課余時間)授粉兩次。然后追蹤雜交結實情況，等種子成熟后連塑料小牌一起采收，上交實驗老師。四、方法與步驟 (一)在充分熟悉雜交對象的花器結構和開花授粉習性的基礎上，進行雜交技術操作。 (二)有性雜交技術的主要操

2、作步驟 1株選：選發(fā)育正常，生長健壯，無病蟲危害，具本品種典型特征的植株作為親本植株。 2選花：一般要選植株上結實性強的部位的花，這些花應是即將開放，但花冠尚未展開、花藥尚未散粉的露冠大花蕾或初放的花。洋金鳳（總狀花序生枝頂，花瓣具柄，黃色，紅色。雄蕊長兩倍于花冠。 雄蕊通常10，很少多數(shù)，花藥各式，通常縱裂，有時頂孔開裂；子房上位，1室；）是自花授粉植物，初放時已自花授粉。玉米為雌雄同株異花的異交植物，當雌穗從葉腋中露出尚未吐絲時選擇花朵進。 3去雄去雄的操作是鑷子仔細夾除全部花藥，切勿將花藥夾破或殘留部分破碎花藥。去雄一定要非常小心，切勿傷及雌蕊柱頭、花柱，子房等部位，否則雌蕊極易死亡。去

3、雄后打去多余的花朵、花蕾、立即套袋隔離，并掛牌寫明雜交組合，操作者姓名，雜交時間等項目的小牌。玉米則在雄蕊未能成熟前剪去雄蕊。洋金鳳則除去未成熟的全部雄蕊，即去雄。具體做時，先要尋找合適的花的枝頭，剪去已開放的花，留下5-10個大小適合的花苞進行人工授粉。用尖頭鑷子撥開花蕊（可除去一部分花瓣，方便授粉），除去里面所有的雄蕊，留下雌蕊。4授粉去雄當天或第二天，用事先隔離或事先搜集的，未受污染的純凈父本花粉授粉，可用毛筆、鑷子、海錦、橡皮頭等沾取父本花粉，輕輕涂到母本柱頭上，用肉眼或放大鏡觀察到柱頭上已沾上花粉粒就行了。在正常天氣下，授粉時間在上午911時較為適宜。同時配制幾個雜交組合時，完成一個

4、雜交組合的授粉，就應把授粉用具放在70的酒精中，殺死沾在上面的花粉粒。玉米則可將其它植株的雄蕊花粉抖在雌蕊花絲上，也可將父本的植株種在母本旁，將其自行接受父本花粉。洋金鳳則可取其他花中已成熟的雄蕊，將其在已去雄的母本柱頭上。涂抹上花藥后可以觀察到有明顯的花藥沾附在柱頭上。5、套袋、掛牌輕輕將已去雄授粉的花套在一端開口的隔離袋中，在其花枝上掛上標簽牌，寫上父本、母本類型和授粉日期。 5雜交后的檢查 雜交后繼續(xù)套袋一周，然后去除紙袋，檢查著子房開始膨大，證明雜交成功了。 6雜交后的管理和種子采收 雜交應加強植株的管理，及時整枝、打去多余的花朵或花枝，使養(yǎng)分集中供應雜交的果實、種子。還要注意多施P、

5、K肥，及時防治病蟲害。待雜交果實成熟后，及時采收。采收時分清組合，切忌機械混雜和丟失雜交小牌。五、作業(yè)與思考題 1列表記載雜交結果(包括雜交組合、去雄和授粉日期、授粉花數(shù)，結實粒數(shù)和結實百分率等項目)。2根據(jù)實際體會，談談雜交的各個環(huán)節(jié)要注意那些問題。附；洋金鳳雜交時注意事項1、去雄時，可除去部分或者全部花瓣，以免影響授粉過程。2、去雄時要輕緩，防止其自身花粉脫落，粘在柱頭上，影響實驗。3、低溫及干熱風等不良天氣直接影響人工授粉的效果，所以應選在晴天上午授粉最佳，并且低于15授粉效果不理想。4、授粉時花粉要具有一定的數(shù)量，需要在柱頭上輕輕涂抹數(shù)次，保證有足夠的花粉，有時甚至要連續(xù)幾天授粉，從而

6、保證結果率。實驗二 花粉生活力的測定一、目的要求 通過實驗，初步掌握植物花粉生命力的測定方法。二、實驗用品 1材料：各種事先貯備用的花粉粒和采集的新鮮花粉粒。 2用品：計數(shù)器、載玻片、蓋玻片、酒精燈、燈架、石棉網(wǎng)、小燒杯、特種鉛筆、玻棒、恒溫箱、標簽、蔗糖、瓊脂、硼酸、蒸餾水、PH試紙、1碘碘化鉀溶液、0.5或ITTC液、萘酚、聯(lián)苯胺、碳酸鈉、30%過氧化氫溶液。三、方法步驟 1、形態(tài)檢驗法(適用于新鮮花粉) 抖少許新鮮花粉在載玻片上，滴入12滴蒸餾水，蓋上蓋片，在顯微鏡(40 × 10)下觀察。充實、飽滿、形態(tài)正常的有生活力，而畸形、皺縮、瘦小的無生活力。 注意識別不同花粉的形態(tài)特

7、征，如波斯菊花粉為圓形，金盞菊花粉為三角形等。 2、人工發(fā)芽法 花粉的人工發(fā)芽效果與培養(yǎng)基配方，發(fā)芽的溫度、濕度密切相關，不同的植物對培養(yǎng)基的要求差異明顯，本實驗采用蔗糖固體培養(yǎng)基。初步實驗證明對大多數(shù)花粉而言，在蔗糖濃度為15時，萌發(fā)率較高，本實驗可采用10、15、20、25等濃度進行發(fā)芽比較。(1)培養(yǎng)基配方(以15蔗糖濃度為例) 蒸餾水l00ml、瓊脂1g、蔗糖15g、0.01的硼酸數(shù)滴或少量維生素B。培養(yǎng)基的PH值應調到5.26，蔗糖可維持培養(yǎng)基一定的滲透壓，瓊脂凝固培養(yǎng)基，防止花粉粒過多吸水而破裂。硼酸、維生素B可促進花粉粒的萌發(fā)和花粉管的生長。(2)培養(yǎng)基的配制 將培養(yǎng)基的各成分按

8、配方稱量后，置于小燒杯中，標明液位線，然后將小燒杯置于酒精燈上煮沸，充分攪動直到培養(yǎng)基各成份完全溶解呈均一透明狀，檢查液位線，補足蒸發(fā)損失的水分。用PH試紙測培養(yǎng)基PH值，并用HCl或NaOH調節(jié)PH至5.26。然后將配好的培養(yǎng)基放入熱水浴中，保持溶化狀態(tài)。(3)制片 用玻璃棒蘸少量培養(yǎng)基，趁熱滴在懸滴玻片的凹槽內，放置片刻，使其冷凝。(4)播種花粉 把配制好的片子放在黑色紙上，然后用解剖針粘少量花粉，均勻地撒在培養(yǎng)基上，播完后鏡檢，若花粉成團堆積，則難于計數(shù)，過稀則影響發(fā)芽，若戳破培養(yǎng)基而使花粉埋在培養(yǎng)基里，也影響發(fā)芽，都應重做。載片上應貼上標簽，注明培養(yǎng)基的蔗糖濃度、播種時間、操作者姓名等

9、。然后放在墊有吸水紙的培養(yǎng)皿內，并將培養(yǎng)皿置于2025恒溫箱中培養(yǎng)，讓其發(fā)芽。(5)播種后檢查 播種后第二天，第三天在40 × 10倍顯微鏡下各檢查一次，每次三個視野，用計數(shù)器計算花粉總粒及發(fā)芽粒數(shù)，計算發(fā)芽百分率。凡花粉管伸長超過花粉長度的為發(fā)芽，注意原生質溢出的情況相區(qū)別。 3染色法 (1)氯化三苯基四唑法(TTC)法 TTC(2，3，5三苯基四唑)與花粉粒中脫氫酶脫下的氫發(fā)生作用，使花粉顯現(xiàn)紅色。紅色的深淺與花粉粒中脫氫酶的活性呈正相關，因此也與花粉粒生活力的強弱呈正相關相關。 測定時用事先配發(fā)的0.5或1的TTC液。將花粉粒少許置于載片上，滴l2滴TTC液，用解剖針充分攪勻，

10、蓋上蓋片，放置于2530的溫箱中，待花粉粒染紅后(約需10分鐘)即可鏡檢(40 × 10倍)，紅色最深的為有生活力的花粉粒，淺色或不著色的花粉為無生活力。 (2)夏爾達考夫法具有生活力的花粉中含有過氧化氫酶，它能促使過氧化物放出活性氧，進而去氧化別的物質，如將的聯(lián)苯胺氧化呈蘭色，一萘酶氧化呈紅色，如同時被氧化則呈紫紅色。因此在聯(lián)苯胺、一萘酚和過氧化物混合溶液同時參與作用下，具有生活力的花粉促使H202放入初生態(tài)氧，使花粉粒染成紅色或紫紅色。生活力越強，花粉染色愈深。無生活力的花粉為黃色或無色。 偶氮苯萘酚納(紫紅色)、 萘酚對硝基鈉(黃色，被紫紅色掩蓋) 染色液的配制： A：0.2克

11、聯(lián)苯胺溶于100毫升50%的酒精中，盛入褐色瓶中。 B：0.15克一萘酚溶于100毫升50%的酒精中，盛入褐色瓶中。 C：0.25克碳酸鈉溶于100毫升蒸餾水中，盛入白色瓶中。 以上三種溶液等量混合后，即配成“甲液”，盛入白色瓶中。 D：將30% H202用蒸餾水稀釋成0.3%溶液，即制成乙液。先滴一滴甲液在載片的花粉上，再滴入一滴乙液，用針仔細拌勻，在低倍顯微鏡下觀察，凡具有生活力的花粉呈紅色或玫瑰色，無生活力花粉呈黃色或無色。 (3)碘一碘化鉀法 使用1的碘一碘化鉀溶液，操作同前，反應20分鐘后鏡檢，(40 × 10倍)，有生活力的花粉為棕黃色，無生活力的花粉為淺黃或無色。四、作

12、業(yè)與思考題 1繪制花粉形態(tài)圖。2用染色法作花粉生活力測定，列表記載測定結果(觀察三個視野，計算平均值)?；ǚ勖Q花粉保存時間視野數(shù)花粉總數(shù)有生活力的花粉數(shù)有生活力花數(shù)所占百分比例%有生活力花粉的平均百分率備注視野1視野2視野3 3結合課堂教學，分析花粉生活率高低的原因。 實驗三 植物種子生活力快速測定1、 實驗目的掌握植物種子生活力檢測的基本原理及快速鑒定植物種子生活力的方法。二、實驗原理 種子活力是決定種子在發(fā)芽和出苗期間的活性強度和種子特性的綜合表現(xiàn)（指田間條件下的出苗能力及與此有關的其他特征和指標），種子生活力是指種子的發(fā)芽潛在能力和種胚所具有的生命力（通常指一批種子中具有生命力種子數(shù)占

13、種子總數(shù)的百分率）。種子貯藏過程中必須維持種子是有活力的，因此定期進行生活力和活力的檢測是非常重要的。測定種子生活力方法常用發(fā)芽率測定法，該法是指在最適宜的條件下，在規(guī)定天數(shù)內發(fā)芽的種子占供試種子的百分數(shù)。它是決定種子品質和實用價值大小的主要依據(jù)，與播種時的用種量直接有關。但是常規(guī)方法（直接發(fā)芽）測定種子發(fā)芽率所需的時間較長，對于處于深休眠狀態(tài)的種子，幾乎難于應用。特別是有時為了應急需要，沒有足夠的時間來測定種子發(fā)芽率，所以有必要根據(jù)種子的生理特性建立起一套快速測定種子生活力的方法。目前，植物種子生活力的快速測定法有多種，常用的有以下3種：1 氯化三苯基四氮唑法（TTC法）或溴麝香草酚藍法(B

14、TB 法) 凡有生命活力的種子其胚在呼吸作用過程中都會發(fā)生氧化還原反應，而無生命活力的種子胚則無此反應。當TTC滲入種胚的活細胞內，并作為氫受體被脫氫輔酶（NADH或NADPH）上的氫還原時，便由無色的氯化三苯基四氮唑（TTC，可溶于水）變?yōu)榧t色的三苯基甲腙（TTCH，不溶于水）。生活的種子充分吸脹后，呼吸強度迅速增加，吸收空氣中的氧，放出二氧化碳。二氧化碳溶于水成為碳酸，碳酸解離成H和HCO3-，使種胚周圍酸度增加，可用溴香草酚藍(BTB)來測定酸度變化。BTB 的變色范圍為pH 6.07.6，酸性呈黃色，堿性呈藍色，中間經(jīng)過綠色(變色點為pH 7.1)，色澤差異顯著，易于觀察。因此，可從種

15、子的呼吸強弱來判斷種子的發(fā)芽率。2紅墨水染色法或酸性靛藍染色法 凡是生活的活細胞的原生質膜都具有選擇吸收能力，它對某些染料不讓透過，因此用這類染料(如紅墨水、酸性靛藍等)不能使種胚染色。而死種子的胚細胞原生質膜喪失了選擇吸收能力，于是染料進入死細胞，將胚完全染色。因此，可根據(jù)種胚或子葉對染料的著色情況判斷種子的發(fā)芽率。2、 實驗材料小麥種子、大麥種子、秈稻種子、玉米種子、粳稻種子、蠶豆種子、大豆種子。四、設備與試劑恒溫箱，培養(yǎng)皿，燒杯，鑷子，刀片，紫外熒光燈，濾紙（無熒光），瓊脂，沸水。0.5 TTC 溶液：稱取TTC 0.5 g 放燒杯中，加入少許95 乙醇使其溶解，然后用蒸餾水稀釋至100

16、 mL。配好的溶液需避光保存，若呈紅色時，則不能再用。5 紅墨水：市售紅墨水5 mL加95 mL自來水。0.1 酸性靛藍溶液：稱0.1 g 酸性靛藍，加蒸餾水溶解，定容至100 mL。0.1 BTB水溶液：稱取BTB 0.1 g溶于冷開水(配制指示劑的水應為微堿性，使溶液呈藍色或藍綠色，而蒸餾水為微酸性，故宜用煮沸的自來水或井水)，用濾紙去殘渣。濾液若呈黃色，可加數(shù)滴稀氨水，使之變?yōu)樗{色或藍綠色。此液可長期貯于棕色瓶中。五、實驗步驟（一）氯化三苯基四氮唑法（TTC法）或溴麝香草酚藍法(BTB法) 1、氯化三苯基四氮唑法（TTC 法） 將待測種子在3035溫水中浸種（小麥、大麥、秈稻種子68 h

17、；玉米蠶豆種子5 h 左右；粳稻種子2 h），以增加種胚的呼吸速率，使顯色迅速；取吸脹種子200 粒，用刀片沿種子胚的中心線縱切為兩半，將其中一半置于30恒溫箱中0.5 1 h，另一半在沸水中煮5 min殺死種胚，作為對照觀察；向上述樣品中加入TTC作染色處理，凡被染為紅色的種子是活種子。 2溴麝香草酚藍法(BTB法) 浸種同TTC法；0.1BTB瓊脂凝膠的制備:取0.1 BTB溶液50 mL于燒杯中，加剪碎成小塊的瓊脂0.5 g，用小火加熱并不斷攪拌。待瓊脂完全溶解，保溫備用；取吸脹種子3050粒，(根據(jù)種子大小，及培養(yǎng)皿大小而定)用自來水沖洗，瀝干，用吸水紙吸去種子表面的水分，使胚向下均勻

18、放于培養(yǎng)皿中(種子間距離至少應1 cm)。然后再倒入40左右的BTB瓊脂液。以淹沒種子為度，約0.20.4 cm。瓊脂液層不宜太厚，否則會影響觀察)置于3035的溫箱中保溫30 min(夏天可放在室溫下)。另取一些吸脹種子置沸水中煮5 min殺死種子作同樣的處理，進行比較觀察；經(jīng)0.5 h后(BTB瓊脂溶已凝固)將培養(yǎng)皿拿到光線比較亮的窗前。將培養(yǎng)皿反過來(從底部)進行觀察若種胚附近呈現(xiàn)較深黃色暈圈則是活種子，若種胚周圍黃色很淡或沒有色環(huán)則是無生活力的種子。（二）紅墨水染色法或酸性靛藍染色法1紅墨水染色法 將待測種子在3035溫水中浸種（小麥、大麥、秈稻種子68146h；玉米種子5 h 左右；

19、粳稻種子2 h），以增加種胚的呼吸速率，使顯色迅速；取吸脹的種子200 粒，沿種子胚的中心線縱切為二半，將其中的一半置于紅墨水培養(yǎng)皿中510 min；用紅墨水染色后，倒去廢液，用水沖洗多次，至沖洗液無色為止，并檢查種子死活。凡種胚不著色或著色很淺的為活種子，種胚與胚乳著色程度相同的為死種子。也可用沸水殺死的種子作為對照觀察。2酸性靛藍染色法浸種同紅墨水染色法；將吸脹的種子沿胚和中線切為兩半，一半置于培養(yǎng)皿中加0.1酸性靛藍溶液。以淹沒種子為度，染色15min，另一半棄去；染色時間到后，用自來水反復沖洗種子，將吸附在種子表面的染料沖洗干凈。然后觀察沖洗后的種子子葉或胚部著色情況。凡生活力強的種子

20、胚完全不著色(白色)；有生活力的子葉和胚上有不太明顯的淡色斑點；整個胚全部著色或子葉和胚根上有著色很濃的斑點，就是完全喪失或大部分喪失生活力的死種子。六、實驗結果分別計算經(jīng)不同方法處理的植物種子的生活力。七、注意事項1. TTC 溶液最好現(xiàn)配現(xiàn)用。如需貯藏則應貯于棕色瓶中，并放在陰涼黑暗處，如溶液變紅則不可再用，處理時藥液以浸沒種子為度，溫度一般以2535為宜。2. TTC 法判斷有生活力的種子應具備如下特征：胚發(fā)育良好、完整、整個胚染成鮮紅色；子葉有小部分壞死，其部位不是胚中軸和子葉連接處；胚根尖雖有小部分壞死，但其他部位完好。而無生活力的種子：胚全部或大部分都染色；胚根部染色部分只限于根尖

21、；子葉不染色或喪失機能的組織超過50；胚染成很淡的紫紅色或淡紫紅色；子葉與胚中軸的連接處或在胚根上有較重的壞死部分；胚根受傷以及發(fā)育不良的未成熟的種子。3. 紅墨水染色時間不能太長，因細胞膜的選擇透性具有相對性，染好色后，一定要反復沖洗干凈。八、問題討論1. 將測定結果記錄于種子生活力測定結果表，計算該批種子生活力大小。2、比較本實驗幾種快速測定植物種子生活力方法所測得結果的異同，同時簡述各方法的原理、優(yōu)缺點及其應用范圍。注：實驗2：植物花粉生活力測定實驗（1）采用液體培養(yǎng)基花粉萌發(fā)（2）TTC和碘-碘化鉀染色法： TTC染色法：花粉粒染紅后(約需10分鐘)；碘-碘化鉀染色法：20分鐘實驗3：

22、種子生活力快速測定（1）TTC染色法：染色1h后觀察（2）酸性品紅染色法：染色15min觀察 實驗四 植物無融合生殖的多胚現(xiàn)象觀察及育種中的應用一、實驗目的 通過實驗，了解植物多胚現(xiàn)象發(fā)生途徑、類型及其在植物育種中的應用；并通過外部形態(tài)特征區(qū)別體細胞胚和雜種胚。2、 實驗原理在種子發(fā)育過程中或成熟種子中出現(xiàn)兩個或兩個以上的胚的現(xiàn)象稱之為多胚現(xiàn)象。裸子植物的胚珠中，絕大多數(shù)有兩個以上的頸卵器(卵及受精后原胚發(fā)育的地方) 。如松樹的頸卵器有1個到10多個。柏科植物的Actinostrobus多達 100個以上。在同一個胚珠中，由兩個以上的頸卵器中的卵受精后分別發(fā)育成多胚，稱為簡單多胚現(xiàn)象。另一種情

23、況是由一個受精卵發(fā)育出來的多胚，稱為裂生多胚現(xiàn)象。這種現(xiàn)象在松柏植物中常見。這兩種多胚現(xiàn)象往往可以同時存在于同一種植物中，如松屬、水杉等。在裸子植物胚胎發(fā)育的早期，多胚現(xiàn)象雖然很普遍,但在成熟種子中,往往只有一個胚，其余的幼胚一般都在發(fā)育過程中夭折。 在被子植物中也有多胚現(xiàn)象。最常見的是蕓香科等的一些種屬中，成熟種子中通常有兩個以上大小不等的胚，在柑橘屬可多達30個以上的胚。在這些胚中除一個是由受精卵發(fā)育的合子胚外，其余都是由珠心細胞發(fā)育來的，即由珠心組織細胞侵入胚囊中經(jīng)多次分裂后而成，稱為珠心胚。在韭菜的成熟種子中，有的胚是由珠被細胞發(fā)育而來的，稱為珠被胚（見無融合生殖）。 不定胚起源于珠心

24、或其鄰近的組織除卵細胞以外的其他細胞(如助細胞或反足細胞 )，沒有發(fā)生減數(shù)分裂，它相當于孢子體芽生是一種無融合生殖，但又比孢子體芽生的性分化程度要高。這種不定胚常與來自融合生殖的胚共居于一粒種子中，主要見于蕓香料、仙人掌科、黃楊科、大戟科、桃金娘科、蘭科和菊科。 珠心胚的產(chǎn)生對柑橘雜交育種是一種障礙，因為珠心細胞是體細胞，只具有母本的遺傳特性，而雜交育種要的是由受精卵發(fā)育來的雜種胚，所以怎樣區(qū)別珠心胚，抑制它的生長發(fā)育是一個待解決的問題。柑橘類植物在離體培養(yǎng)中，可從胚珠誘導產(chǎn)生珠心胚。這種從母體組織來源的不定胚，有可能發(fā)育成與母體完全一致的幼苗，既能保持品種的優(yōu)良特性，又可以避免重復地無性繁殖

25、發(fā)生的衰退。在雜交育種上，只有特定起源的多胚苗材料在作物雜種優(yōu)勢固定中才具有比較大的實用價值，因為雜交后胚珠中同時發(fā)育合子胚和不定胚，雜種胚往往生長分化能力弱，受到珠心胚的干擾。應用胚培養(yǎng)的方法，有可能使雜交合子胚正常分化和長成幼苗。這在橙和枳的雜交中已獲得成功。三、實驗用品1、材料：柑橘、咖啡、芒果等植物種子。2、用品：解剖刀、尖頭鑷子、吸水紙、培養(yǎng)皿、牛皮紙（或黑紙）、鉛筆、毛筆。四、方法與步驟1、在牛皮紙上用解剖刀小心切開酸橙果實，取出種子；2、用鑷子撕開種皮并撥開種子，可見種子內大小不一的多胚現(xiàn)象；3、把同一種子中所有胚取出置于培養(yǎng)皿中進行觀察，計算含多胚種子頻率及多胚種子的胚數(shù)范圍。

26、4、柑橘果皮易剝離，子葉及胚通常綠色，間有乳白而帶淡綠色則很可能是雜交種。通過同一種子中各胚的形態(tài)、大小及顏色初步判斷遺傳來源不同的有性胚和無性胚。5、多胚種子的胚分離培養(yǎng)及后代的葉形態(tài)和分子標記（SSR）鑒定： 為探明多胚來源,對多胚進行了分胚組織培養(yǎng)，以獲得同一種子來源的多胚苗；再選取多胚苗進行葉形態(tài)比較分析及分子標記（SSR）鑒定，確定雜交苗和無性苗。五、作業(yè)與思考題1、 列表計算含多胚種子頻率及多胚種子的胚數(shù)范圍。2、 如何鑒別遺傳來源不同的有性胚和無性胚？這兩類胚在作物育種上各自具有哪些不同的意義？ 實驗五 植物多倍體的誘導及鑒定一、實驗目的了解多倍體在植物及其植物遺傳與進化中的重要

27、作用；了解人工誘導植物多倍體的原理、方法及其在植物育種中的應用；采用形態(tài)特征及解剖學觀察初步鑒定多倍體，應用植物染色體制片技術，鑒別誘導后染色體數(shù)目的變化。二、實驗原理 秋水仙素誘導植物多倍體的機制在于其能阻止正在分裂的分生細胞不能形成紡錘絲，使已縱裂的染色體不能彼此分向兩極，從而形成一個加倍的核，進而發(fā)育成一個新的多倍體植株。三、實驗材料材料：（1）柱花草、草坪草等植物的幼苗及種子。 （2）巴西橡膠三倍體葉片或中粒種咖啡四倍體葉片四、實驗儀器及藥品 1儀器：游標卡尺、直尺、顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、鑷子、載玻片、蓋玻片、燒杯、棕色瓶、玻棒、滴管、吸水紙、培養(yǎng)皿等。2 藥品：秋水仙素、冰

28、醋酸、甲醇、l%高錳酸鉀、蒸餾水、無水乙醇、甘油、醋酸洋紅溶液、1碘碘化鉀等、1mol/L鹽酸。五、方法與步驟 (一)藥液的配制 將1g秋水仙素溶于100m1蒸餾水中，即為1%的濃度秋水仙素溶液，裝入棕色瓶中作為原液，置入冰箱中保存。處理時稀釋成所需要的濃度，為防止處理藥液很快干燥，可加少許甘油。 (二)誘導多倍體的處理 一般常用的有浸漬法、點滴法、根吸法等。 實驗采用一定濃度的秋水仙素，用蒸餾水處理作對照。 1浸漬法選取充實飽滿、大小一致的植物種子，用1%的高錳酸鉀進行表面消毒幾分鐘，沖洗干凈，置于培養(yǎng)皿中加蒸餾水預浸24h左右，待種子充分吸脹后，用吸水紙吸干多余的水分，再按實驗要求，將種子

29、分別裝在各個培養(yǎng)皿中，加入秋水仙素藥液，進行不同時間的處理(約824h)。處理結束后，用清水洗干凈殘余藥液，播種在營養(yǎng)皿中，標明處理濃度、處理時間，處理者姓名等。 2點滴法待幼苗兩片子葉展開，露出生長點或一片真葉期進行處理。處理時將脫脂棉搓成米粒大小，緊貼放在幼苗生長點上，然后將藥液滴12滴在棉球上，使棉球充分吸脹又不下流為度。處理完后，及時去掉棉球，并用清水沖洗生長點，去除殘留落物。處理時間可參考浸漬法。 3根吸法選取充實飽滿、大小一致的植物種子，用1%的高錳酸鉀進行表面消毒幾分鐘，沖洗干凈，浸泡半小時，然后轉入有浸潤吸水紙的培養(yǎng)皿中，于25培養(yǎng)箱中催芽3648h。待種子萌發(fā)至根長0.51.

30、0cm，留下發(fā)芽的種子，用水洗凈，吸干水，加入一定濃度的秋水仙素溶液，使萌發(fā)出的根尖浸泡在秋水仙素溶液中。蓋上培養(yǎng)皿上蓋，置于25溫箱中處理24h。經(jīng)處理之后，根尖膨大，形如鼓棰。(三)觀察及鑒別1植株形態(tài)特征的觀察 觀察比較對照植株與處理植株的外部形態(tài)特征。如葉片厚度、葉片皺縮情況、葉色、莖的特征、生長速度等。橡膠三倍體葉片與對照（CK）形態(tài)上的差異：（1） 葉片厚度及色澤：（2） 葉形指數(shù)（小葉的長寬比）：（3） 葉脈粗細：（4） 側脈檢定角：主脈與側脈的夾角，通常比二倍體小，具有明顯的拐點。2 葉片氣孔保衛(wèi)細胞的測定 葉片氣孔是由兩個保衛(wèi)細胞組成，雙子葉植物的保衛(wèi)細胞多呈腎臟型，單子葉植

31、物的保衛(wèi)細胞多呈啞鈴型。測量保衛(wèi)細胞時，仔細撕取二倍體和多倍體植株的葉片下表皮，置于載玻片上，并加12滴1碘碘化鉀，蓋上蓋玻片。在高倍鏡下比較保衛(wèi)細胞的大小。觀察內容：（1） 比較氣孔及保衛(wèi)細胞的大?。?） 單位面積氣孔數(shù)的多少（3） 葉片柵欄組織的厚薄3染色體數(shù)目的檢查 將秋水仙堿處理和未處理材料的根尖固定，采用壓片制片，然后鏡檢觀察，進行染色體計數(shù)。染色體數(shù)目檢查的方法步驟：（1）培養(yǎng)取材經(jīng)誘導后的材料及對照培養(yǎng)根長至12cm時，于上午910時或下午35時左右剪取根尖備用。（2）預處理（冷凍處理）將剪取的根尖浸入盛有蒸餾水的燒杯中，置于03的冰箱中處理24小時。染色體數(shù)較多的實驗材料可適當

32、延長時間(2040小時)，但需注意勿使材料結冰。（3）固定將預處理的材料用蒸餾水沖洗干凈(沖洗兩次或兩次以上) 卡諾氏液，415，固定24h可立即使用。不立即使用，可將固定后的材料用梯度酒精法浸洗(用95%、85%、70%的酒精各浸洗一次，沖洗直至聞不到醋酸味為止)，然后將其保存在70%的酒精中置于4冰箱內，可隨時取用。(保存時間最好不超過二個月)，若保存時間較長需要重新固定后再用。經(jīng)過較長時間保存的材料，進行觀察前可換用固定液再處理一次效果較好。（4）解離先將固定后的根尖用蒸餾水洗56次，然后放入已經(jīng)在60中預熱的1mol/L的鹽酸中，在60恒溫條件下解離515分鐘，當根尖透明呈米黃色時取出，用蒸餾水沖洗35次。一定要沖洗干凈，否則影響染色。或者不用水浴，而直接加熱進行酸解。從培養(yǎng)皿里取出45條根置于塑料量杯(表面皿)內，并用蒸餾水沖洗幾次，沖洗干凈。將干凈的根放入表面皿內，加入數(shù)滴1mol/L的鹽酸，以浸泡著根為準。用鑷子夾住表面皿邊緣(注意用力適度，不宜過大)在酒精燈上間接式加熱24分鐘(即發(fā)現(xiàn)鹽酸溶液有氣泡冒出時，立即遠離火焰)，用鑷子尖夾根是否已經(jīng)變軟，若變軟，則說明已解離好，否則繼續(xù)解離。解離完后用蒸餾水沖洗35次。一定要沖洗干凈，否則影響染色。（5）染色制片醋酸洋紅染色制片取一處理好的根尖置于載玻片中間，用吸