實驗一_雞新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗體水平測定法

1、雞新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗體水平測定法1本次實驗的目的和要求掌握雞新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗體水平測定法，以便檢查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。2實驗內(nèi)容或原理  某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)能夠與動物的紅細胞發(fā)生凝集，此即為紅細胞凝集現(xiàn)象(HA)。這種紅細胞凝集現(xiàn)象可于病毒懸液中加入特異免疫血清所抑制，即為紅細胞凝集抑制試驗(HI)。3需用的儀器或試劑等動物 健康成雞2-5只，被檢雞15-25只。器材 高壓滅菌器、濾紙、試管、試管架、離心機、離心管、三棱針、內(nèi)徑2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精燈、石蠟、96孔V型微量凝集試驗板、0.025mm

2、微量吸液器、微型振蕩器、微量移液器、脫脂棉等。藥劑（1）濃縮抗原；（2）生理鹽水或磷酸緩沖鹽水（PBS）；（3）Alsever細胞保存液；（4）紅細胞懸液；（5）待檢血清4實驗步驟(1)發(fā)現(xiàn)與鑒定病毒：雞新城疫和禽流感病毒分離后，這些病毒能凝集雞的紅細胞，又能被特異性的已知免疫血清抑制其凝集反應(yīng)，即可鑒定此病毒。 (2)診斷病毒性疾病：如取同一發(fā)病的動物早期和恢復(fù)期血清進行紅細胞凝集抑制實驗，如抗體效價有4倍以上升高，即有診斷意義。（3）免疫機體抗體效價的測定： 3.雞新城疫（ND）的HA和HI（1）試驗準備  抗原：一般以雞新城疫系或LaUra系凍干苗

3、作為已知抗原，進行試驗。  0.7細胞懸浮液：由雞翅靜脈或心臟采血，放入含有抗凝劑的滅菌試管(按每毫升血加入3.8滅菌檸檬酸鈉0.2毫升做抗凝劑)內(nèi)，迅速混勻。如當時不用，可直接采血放入紅細胞保存液內(nèi)(保存液2份，血液1份)于4冰箱內(nèi)可保存兩周。紅細胞懸液的配制：將血液注入離心管中，經(jīng)3000轉(zhuǎn)分鐘，離心5-10分鐘，用吸管吸去上清液和紅細胞上層的白細胞薄膜，將沉淀的紅細胞加稀釋液(生理鹽水)洗滌。再用離心機3000轉(zhuǎn)分鐘離心5-10分鐘，棄上清，再加稀釋液洗滌，如此反復(fù)洗滌三次，將最后一次離心后的紅細胞泥，按0.7的稀釋度加入稀釋液(0.7毫升紅細胞泥加99.3毫升稀釋液

4、)。  被檢血清：將被檢雞群編號登記，用消毒過的干燥注射器采血，注入潔凈干燥試管內(nèi)(微量法可用孔徑2-3毫米塑料管由翅靜脈采血)，在室溫中靜置或離心，待血清析出后使用。每只雞應(yīng)更換一個注射器，嚴禁交叉使用。 稀釋液：為滅菌的生理鹽水。 紅細胞保存液的配制方法：葡萄糖2.05克，檸檬酸鈉(SHOO)0.80克，檸檬酸(2H20)0.055克，氯化鈉0.42克，蒸餾水加至100毫升。過濾分裝，高壓滅菌10分鐘，放4冰箱保存。(2)紅細胞凝集試驗(HA)   主要是測定病毒的紅細胞凝集價，以確定紅細胞凝集抑制試驗所用病毒稀釋倍數(shù)(抗原單位)

5、。雞新城疫病毒的HA試驗與HI試驗現(xiàn)采用微量法，以u或v形微孔塑料板代替試管。 首先用移液器向每個孔加入稀釋液一滴(0.05毫升)。 用微量移液器取病毒抗原0.05毫升，加入第一孔，反復(fù)抽動6次后，吸出0.05毫升加入第二孔，在第二孔反復(fù)抽動6次后，吸出0.05毫升加入第三孔，如此連續(xù)稀釋至第十一孔后吸出0.05毫升棄去。第12孔不加病毒液為紅細胞空白對照。判斷：沿著傾斜面向下呈線狀流動者為沉淀，表明紅細胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細胞不流動，說明紅細胞被病毒所凝集。如上例：病毒液的HA效價以出現(xiàn)完全凝集的抗原最大稀釋度為準。H

6、I試驗時，病毒抗原液為0.05毫升內(nèi)須含4個凝集單位，則應(yīng)將原病毒液作成644=16倍的稀釋液?？滋枺?1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12滴度： 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:517 1:1024 1:2048 對照稀釋液 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25抗原(病毒) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 紅細胞懸液 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25作用時間與溫度 輕輕振蕩1-2min 靜置30-60min結(jié) 果 + +

7、+ + + + + 注意：+為完全凝集 +為部分凝集 為不凝集(3)紅細胞凝集抑制試驗(HI試驗)：新城疫病毒凝集紅細胞的作用，能被特異性抗體抑制，因此，可用HI試驗(簡稱血凝抑制試驗)測定雞血清中的HI抗體效價(滴度)，并可用標準血清，作新分離病毒的鑒定與未知病毒的診斷。      微量法：具體操作如下： 用移液器向每孔加0.05毫升稀釋液，十一孔加0.1毫升。 用移液器吸取被檢血清(或高免卵黃抗體)0.05毫升注入第一孔，抽放6次后，吸出0.05毫升，注入第二孔，如此連續(xù)稀釋至第10孔，并從第十孔吸出0.05毫升棄去，血

8、清稀釋倍數(shù)依次為1：21024，11孔和12孔空白。 每孔再加入已標定好的四單位病毒液0.05毫升，第十一孔為紅細胞對照孔，不加病毒液。 置振蕩器上振蕩1-2分鐘，放1822靜置20分鐘。 每孔再加入0.7紅細胞懸浮液0.05毫升，放振蕩器上振蕩l-2分鐘，置18-22，30-60分后判定結(jié)果。 第十一孔為紅細胞對照孔，第十二孔作為抗原對照孔。  HI試驗與結(jié)果孔號1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12被檢血清稀釋倍數(shù) 紅細胞 抗原1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512

9、1:1024 對照 對照稀釋液被檢血清25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 棄去稀釋液標準陽性血清25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 棄去4單位病毒25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25作用時間與溫度振蕩1-2min，靜置20 min紅細胞懸液25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25作用時間與溫度振蕩1-2min，靜置30-60 min結(jié)果1 + +

10、+ + +結(jié)果2 + +結(jié)果觀察：將反應(yīng)板傾斜成45角，沉于管底的紅細胞沿著傾斜面向下呈線狀流動者為沉淀，表明紅細胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細胞不流動，說明紅細胞被病毒所凝集。       能將4單位病毒物質(zhì)凝集紅細胞的作用完全抑制的血清最高稀釋倍數(shù)，稱為該血清的紅細胞凝集抑制效價，用被檢血清的稀釋倍數(shù)或以2為底的對數(shù)(log2)表示。如上例，該血清的紅細胞凝集抑制效價為1：64或HI效價為6(log2)。第十一孔僅含稀釋液和紅細胞為不凝集對照孔，第十二孔含稀釋液，病毒液和紅細胞為凝集對

11、照孔。結(jié)果分析如下：  一般認為雞的免疫臨界水平為1：8(成年)或1：16(雛雞)，但隨地區(qū)不同而有差異。  雞血清的HI抗體效價高于1：16時可適當推遲新城疫免疫的時間，HI抗體效價在1：16以下，須馬上進行新城疫疫苗接種，在新城疫流行的地區(qū)或雞場，雞的免疫臨界水平，應(yīng)再提高。 雞群的HI抗體水平是以抽檢樣品的HI抗體效價(1og2)的平均值表示的。       如果某雞群的10份樣品中，HI抗體效價為8的有3份樣品，為7的有5份樣品，為6的有2份樣品，它們的平均值為：  

12、    平均水平在4(log2)，說明該雞群為免疫雞群。若在檢樣中HI抗體效價的最高值與最低值相差太大時，則不能用上法計算平均水平，應(yīng)根據(jù)臨界水平以下的樣品數(shù)在全部樣品中所占的百分比決定免疫與否。 大型養(yǎng)雞場，每次進行抽測時，抽樣率一般不低于0.10.5，小型雞群，抽樣率應(yīng)有所增加，一般認為理想的抽樣率應(yīng)為2。 雞群接種新城疫疫苗后，經(jīng)23周測血清中的HI抗體效價，若提高2個滴度以上，表示雞的免疫應(yīng)答良好，疫苗接種成功；若HI抗體效價無明顯提高，表示免疫失敗。附注：采用HA試驗對各生物藥廠生產(chǎn)的新城疫疫苗產(chǎn)品有質(zhì)量檢測作用。采用HI試驗對各廠家

13、生產(chǎn)高免血清及卵黃抗體有質(zhì)量檢測作用。實驗二 兔有機磷中毒的診斷和治療1、 本次實驗的目的和要求掌握有機磷中毒的診斷要點熟悉有機磷中毒的簡易檢驗方法。了解有機磷中毒的解毒原理和治療措施。2實驗內(nèi)容或原理1.阿托品（Atropinum）抗膽堿藥原理：通過阻止乙酰膽堿和受體的結(jié)合而產(chǎn)生抗膽堿作用。但有機磷中毒病畜對阿托品的耐受性較高，故需用常規(guī)劑量的2（牛）4（羊）倍。2.氯磷定（Pyraloximi Methyl-Chloriaum，PAM-CL或2-PAMCL）為膽堿酯酶復(fù)活劑。原理：能與磷?；憠A酯酶中的有機磷結(jié)合，使膽堿酯酶釋放并恢復(fù)其水解乙酰膽堿的活性；還能直接與有機磷結(jié)合為無毒物質(zhì)排出

14、體外。3需用的儀器或試劑等動物：有機磷中毒病例，或用試驗動物（豬或兔）做人工病例復(fù)制。器材：測瞳尺、磁反應(yīng)板、磁蒸發(fā)皿、乳缽、分液漏斗、分液漏斗架、離心機、培養(yǎng)皿、玻璃容器、量筒、棕色玻璃、玻棒、微量吸管、25ml滴管、注射器、針頭、聽診器、體溫計、定性濾紙、新華濾紙、試紙、紗布、脫脂棉、剪刀、解剖器械、載玻片、皮筯等。藥物試劑：氯仿、氯化乙酰膽堿、溴麝香草酚藍、無水乙醇、干燥馬血消化、飽和溴水、0.4mol/L氫氧化鈉液，二氯甲烷、酒石酸、苯、三氯醋酸、無水硫酸鈉、弗羅里矽士、丙硐、石油醚、蒸餾水、注射用水、精制敵百蟲、0.5%硫酸阿托品、氯磷定、解磷定、雙復(fù)磷、碘酊棉、酒精棉等。4實驗步驟

15、一、診斷要點（一）流行病學(xué)調(diào)查（二）生前癥狀：主要為膽堿能神經(jīng)受過量乙酰膽堿的作用所引起的過度興奮現(xiàn)象。出現(xiàn)以下三類癥候群。1.草蕈堿樣癥狀2.煙堿樣癥狀3.中樞神經(jīng)癥狀（三）有機磷檢驗1.檢品的采取和處理2.有機磷檢驗法（1）酶化磷檢驗法（2）B.T.B全血試紙片法（四）病理變化二、治療措施具體方法為：靜脈注射阿托品1/3量的2%溶液以迅速取得效果；皮下注射阿托品2/3量的生理鹽水溶液以取得持續(xù)效果；分點皮下注射氯磷定或其他膽堿酯酶復(fù)活劑的生理鹽水溶液。必要時重復(fù)使用。1.阿托品（Atropinum）抗膽堿藥。2.氯磷定（Pyraloximi Methy Chloriaum，PAM-CL或2

16、-PAMCL）為膽堿酯酶復(fù)活劑。3.解磷定（Pyraloximi Methiodidum，PAM）膽堿酯酶復(fù)活劑。4.雙復(fù)磷（Toxogoninum，DMO-4）亦為膽堿酯酶復(fù)活劑。5教學(xué)方式講述與實驗6考核要求實驗報告7實驗報告要求1.有機磷中毒的診斷要點有哪些？2.治療在機磷中毒的最好方案是什么？其理論基礎(chǔ)何在？實習(xí)三 禽霍亂(禽巴氏桿菌病)診斷技術(shù)（綜合性）（三個實驗計9學(xué)時）1本次實驗的目的和要求（1）觀察家禽巴氏桿菌病的臨診表現(xiàn)和病理解剖變化 （2）掌握禽巴氏桿菌病的微生物學(xué)診斷方法2實驗內(nèi)容或原理根據(jù)典型癥狀和病變，以及在顯微鏡下檢查組織涂片發(fā)現(xiàn)的兩極染色的桿菌，可初步診斷本病。但

17、確診應(yīng)依靠病原分離鑒定，病原分離鑒定原理為革蘭氏染色法。3需用的儀器或試劑等動物：雞、小白鼠器材：外科鑷子、外科剪、滅菌紗布、載玻片、糖發(fā)酵管等。藥品：草酸銨結(jié)晶紫、革蘭氏碘、碳酸復(fù)紅、瑞特氏染液、美藍染液、棉拭子、接種環(huán)、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、甘露醇、鼠李糖、戊醛糖、纖維二糖、綿子糖、菊糖、赤蘚糖、戊五醇、M肌醇、水楊苷。胰蛋白酶、L-胱胺酸、瓊脂粉、酚紅。4實驗步驟一、臨床癥狀和病理變化 癥狀（1）急性癥狀:描述 （2）慢性癥狀:描述 病理變化:描述二 、微生物學(xué)診斷 抹片的制備 用鑷子夾持病變組織肝或脾，然后以滅菌剪刀剪取小塊，夾出后將其新鮮切面在載玻片上壓印或涂抹成薄層；若取血液

18、，用滅菌剪刀剪開心臟進行蘸取或剪取凝血塊，用新鮮切面在載玻片上壓印或涂抹成薄層。自然干燥。將干燥好的抹片，涂抹面向上，以其背面在酒精火焰上來回通過數(shù)次，略作加熱進行固定。 革蘭氏染色法 固定好的抹片上滴加草酸銨結(jié)晶紫色液，染色2min水洗+加革蘭氏碘溶液于抹片上媒染2min水洗加95酒精于抹片上脫色1min水洗加稀釋碳酸復(fù)紅復(fù)染30s水洗吸干鏡檢。巴氏桿菌為革蘭氏陰性球桿菌或短桿菌，單個或成對存在，常有莢膜。 其他染色法 甲醇固定，瑞特氏或美藍染色呈兩極濃染的菌體。 病原分離 （1）病料的采集：最急性和急性病例可采集死亡禽只的肝、脾、心血；慢性病例一般采集局部病灶組織；對不新鮮或已被污染的樣品

19、，可自骨髓中采取病料。采病料時用燒紅的刀片燒烙組織，而后用滅菌棉拭子或接種環(huán)通過燒烙表面插入組織或心血內(nèi)取樣。如果為活禽，可通過鼻孔擠出粘液，或?qū)⒚奘米硬迦氡橇阎腥?。?）培養(yǎng)基制備：馬丁瓊脂培養(yǎng)基（本實驗中采用該培養(yǎng)基）、5雞血清葡萄糖淀粉瓊脂、鮮血瓊脂培養(yǎng)基。（3）動物接種：如果病料污染嚴重，則可將0.2mL碾碎的病料，經(jīng)皮下或腹腔內(nèi)接種家兔、小鼠或易感雞，接種動物在24h48h內(nèi)死亡，可以從肝臟、心血中分離到巴氏桿菌。（4）培養(yǎng)：將病料接種于馬丁瓊脂培養(yǎng)基在3537下培養(yǎng)，經(jīng)18h24h培養(yǎng)后菌落直徑為1mm3mm，菌落呈散在、圓形，表面凸起呈奶滴狀。注意：如果病料未污染，（3）、（4

20、）步驟可省略。 病原鑒定（1）培養(yǎng)特性：為兼性厭氣菌，生長最適溫度為3537，經(jīng)18h24h培養(yǎng)后，菌落直徑為l mm3mm，呈散在的圓形凸起和奶油狀，有莢膜菌落稍大。（2）鏡檢：從菌落上挑取少量涂片，干燥，固定、染色、鏡檢同上。（3）生化鑒定：1糖發(fā)酵試驗：取純培養(yǎng)物分別接種葡萄糖、單奶糖、甘露醇、蔗糖、麥芽糖、乳糖、鼠李糖發(fā)酵管，37培養(yǎng)23d，觀察結(jié)果。2吲哚試驗：取純培養(yǎng)物接種蛋白胨水，37培養(yǎng)23d，加入吲哚試劑，觀察結(jié)果。3硫化氫試驗：取純培養(yǎng)物接種醋酸鉛瓊脂，37培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果。4對紫乳作用的觀察：取純培養(yǎng)物接種紫乳培養(yǎng)基，37培養(yǎng)23d，觀察結(jié)果。巴氏桿菌生化試驗 細菌名稱 葡萄糖 乳糖 麥芽糖 甘露醇 蔗糖 單奶糖 鼠李糖 吲哚試驗 H2S試驗紫乳作用 動力 巴氏桿菌 +-?+-+-注： + 糖發(fā)酵試驗中表示產(chǎn)酸不產(chǎn)氣、其它試驗中表示陽性； - 陰性。 動物試驗 1取病料制成1:10乳劑，或用細菌的培養(yǎng)液。2取0.20.5ml皮下注射小白鼠，經(jīng)2448h動物死亡。置解剖盤內(nèi)剖檢觀察其敗血癥變化，同時取心血、肝、脾組織涂片，分別進行美藍染色或瑞氏染色、革蘭氏染色，鏡檢可見大量兩極濃染球桿狀的巴氏桿菌，革蘭氏染色陰性。7. 結(jié)果判定：依據(jù)病原分離培養(yǎng)特性、生化鑒定、動物接