實(shí)驗(yàn)室論文PPT

1、卡氏住白細(xì)胞蟲、隱孢子蟲文章匯總 姓名：王明威2016年7月23日 卡氏住白細(xì)胞蟲文章一目錄目錄 隱孢子蟲文章二卡氏住白細(xì)胞蟲文章ABcDEF A 復(fù)方泰滅凈對蛋雞卡氏住白細(xì)胞蟲病預(yù)防效果A A組組（169169只雞）只雞）B B組組（159159只雞）只雞）對照組對照組（172172只雞）只雞）血涂片、瓊脂血涂片、瓊脂擴(kuò)散法化驗(yàn)擴(kuò)散法化驗(yàn)產(chǎn)蛋及存活產(chǎn)蛋及存活觀察觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)材料和方法實(shí)驗(yàn)材料和方法高產(chǎn)海蘭白雞、卡氏住白細(xì)胞蟲標(biāo)準(zhǔn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽性抗體血涂片、瓊脂血涂片、瓊脂擴(kuò)散法化驗(yàn)擴(kuò)散法化驗(yàn)血涂片、瓊脂血涂片、瓊脂擴(kuò)散法化驗(yàn)擴(kuò)散法化驗(yàn)30 g/L復(fù)方泰滅凈50 g/L復(fù)方泰滅凈統(tǒng)計(jì)

2、分析復(fù)方泰滅凈 50 g/ L 組對卡氏住白細(xì)胞蟲的感染完全保護(hù), 整個(gè)試驗(yàn)期間血涂片和瓊脂擴(kuò)散檢查均為陰性。 30 g/ L 組基本能夠控制其感染, 整個(gè)試驗(yàn)期間僅檢出 1例抗體陽性, 感染率為 0. 63% ( 1/ 160), 同時(shí)未見臨床癥狀。對照組蛋雞從 5 月份開始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束連續(xù)發(fā)病并出現(xiàn)血清學(xué)陽性反應(yīng), 抗體檢出率為 27.80% 80. 00%, 抗原檢出率為 0. 68%( 1/ 158), 裂殖子檢出率為 0. 63% ( 1/ 158), 并且出現(xiàn)大量死亡。 B 卡氏住白細(xì)胞蟲子孢子凍存方法及感染力試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料和方法實(shí)驗(yàn)材料和方法 32 35 日齡的健康 AA 雞、患卡氏

3、住白細(xì)胞蟲病雞 誘捕誘捕 庫蠓庫蠓庫蠓庫蠓勻漿勻漿 子孢子孢子純子純化化A A途途徑子徑子孢子孢子B B途途徑子徑子孢子孢子病雞玻璃勻漿器營養(yǎng)液A組（6只）B組（6只）C組（6只）D組（6只）注射新鮮子孢子A類子孢子觀察臨床癥狀B類子孢子抹片、染色、鏡檢第13天注：每組雞中每兩只雞分別注射0.1ml、0.2、0.3ml實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 靜脈接種未經(jīng)凍存的新鮮子孢子的雞全部發(fā)病，且隨著接種劑量增加，病情亦加重。經(jīng) A 途徑緩慢凍存的子孢子在較大劑量時(shí)可引起雞發(fā)?。唤?jīng) B 途徑凍存的子孢子無論劑量大小均不能引起雞發(fā)病。結(jié)論：子孢子的保存應(yīng)選擇A 途徑, 而人工發(fā)病試驗(yàn)最好使用新鮮的子孢子進(jìn)行接種。

4、A凍存法B凍存法 C 卡氏住白細(xì)胞蟲配子體的濃集和純化實(shí)驗(yàn)材料和方法實(shí)驗(yàn)材料和方法4只患卡氏住白細(xì)胞蟲病雞分離分離液的液的制備制備樣本樣本收集收集處理處理單密單密度分度分離法離法 多密多密度分度分離法離法配子配子體純體純化化計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì)方法方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖 1 采用多密度法純化 的配子體（1000X）圖 2 采用單密度法濃集 的配子體（1000X）圖 3 濃集后進(jìn)一步純化的配子體（1000X）圖 5 雞外周血液中的 卡氏住白蟲配子體 （1000X）實(shí)驗(yàn)結(jié)論：該二種方法均取得了較好的分離和純化效果,達(dá)到了直接從雞血液中分離純化配子體的目的, 純化的蟲體純度已基本符合蟲體代謝、抗原分析及

5、核酸分析研究等工作的要求。 D PCR Amplication and Sequencing of ITS-2 rDNA of Leucocytozoon caulleryi。MATERIALS AND METHODSDiseased chickens (the huge schizonts were isloated from muscle ,heart, liver, and other tissues.DNA extracte PCRamplification cloningsequencing analysisITS-2DNA UNIQ-5 spin column purificati

6、on kiturRESULTSPCR Amplication of ITS-2 rDNA of Leucocytozoon caulleryiRestriction patternof recombinant plasmid E 卡氏住白細(xì)胞蟲 rDNA ITS-2 的 PCR擴(kuò)增與測序?qū)嶒?yàn)材料和方法實(shí)驗(yàn)材料和方法廣州某雞場病死雞（從肌肉組織及心臟等部位采集卡氏住白細(xì)胞蟲巨型裂殖體）卵囊卵囊純化純化DNADNA提取提取ITS2ITS2PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增 鑒定鑒定回收回收產(chǎn)物產(chǎn)物克隆克隆篩選篩選DNADNA測序測序分析分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. 蟲體擴(kuò)增片段; 2. 雞肌肉擴(kuò)增片段; 3. 空白

7、對照1. SalI 酶切重組質(zhì)粒; 2. 重組陽性質(zhì)粒; 3. EcoRI 酶切重組質(zhì)粒結(jié)論：根據(jù)上述比較分析，本試驗(yàn)所測為卡氏住白細(xì)胞蟲的 ITS-2 及部分 5. 8S 和28S( ITS2+ ) 序列，其中 ITS-2 序列為卡氏住白細(xì)胞蟲種特異性序列。 F 卡氏住白蟲病 PCR 診斷方法的建立實(shí)驗(yàn)材料和方法實(shí)驗(yàn)材料和方法卡氏住白蟲蟲體材料（采自廣州花都某雞場病雞）、 微孢子蟲DNA、 弓形蟲 DNA、 瘧原蟲DNA、荒川庫蠓 DNA。卵囊卵囊純化純化蟲體蟲體DNADNA提取提取引物引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)稀釋稀釋 ITS2ITS2PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)物回收回收測序測序特異特異性試性試驗(yàn)驗(yàn)敏感

8、敏感性實(shí)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果PCRPCR條件條件優(yōu)化優(yōu)化圖 1 氏住白蟲ITS-2 擴(kuò)增結(jié)果圖 2 特異性試驗(yàn)圖 3 敏感性試驗(yàn)1.卡氏住白蟲 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 2.肌肉對照組 3.空白對照組1. 卡氏住白細(xì)胞蟲 2.健康肌肉 3.雞球蟲 4.荒川庫蠓 5.健康雞血液 6.微孢子蟲 7.弓形蟲 8.原蟲1.10ng/l 2.1ng/ l 3.100pg/l4.10pg/l 5.1pg/ l 6.100fg/ l 7.10fg/ l 8.1fg/ l DNA隱孢子蟲文章ACIBDEFGHJKO A 廣東省乳牛隱孢子蟲病的流行病學(xué)調(diào)查實(shí)驗(yàn)材料和方法實(shí)驗(yàn)材料和方法1087頭奶牛新鮮糞便（廣東）。

9、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果飽和蔗糖漂浮法 改良抗酸染色法形態(tài)學(xué)鑒定評判標(biāo)準(zhǔn)圖1 乳牛隱孢子蟲卵囊改良抗酸染色的形態(tài)學(xué)觀察 1 000圖2 乳牛隱孢子蟲卵囊直接涂片的形態(tài)學(xué)觀察 1 000結(jié)論：初步鑒定為鼠隱孢子蟲( C. muris) 。結(jié)論：乳牛年齡越小,感染率越高 ,感染強(qiáng)度越大。并且明隱孢子蟲感染在一定程度上受季節(jié)性變化的影響 ,但影響不是很大。 B 安氏隱孢子蟲 PCR 檢測方法的建立實(shí)驗(yàn)材料和方法實(shí)驗(yàn)材料和方法安氏隱孢子蟲卵囊、微小隱孢子蟲、弓形蟲、大腸桿菌、球蟲、圓孢子蟲 、 纖毛蟲、肝片吸蟲 、 血矛線蟲和莫尼茨絳蟲、牛糞便。蟲體、對蟲體、對組組DNADNA提取提取測定測定HSP70HSP

10、70擴(kuò)增擴(kuò)增退火溫度退火溫度篩選篩選HSP70HSP70克克隆與鑒定隆與鑒定 引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)與合成與合成特異、敏感特異、敏感性試驗(yàn)性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖 1 安氏隱孢子PCR 檢測的特異性試驗(yàn)結(jié)果。圖 2 安氏隱孢子蟲PCR 檢測的敏感性試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果：僅安氏隱孢子蟲樣品DNA 擴(kuò)增出約500 bp 的特定片段, 特異性良好，當(dāng)樣本中含有DNA 含量 1.5210 - 1 ( ng/ L) 包含 4. 45 10 2 個(gè)隱孢子蟲的DNA 時(shí),即可擴(kuò)增產(chǎn)生清晰可辯的條帶，說明該方法靈敏性高。 C 安氏隱孢子蟲內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)I （ITS-1） 序列的PCR擴(kuò)增、克隆及分析卵囊卵囊純化純化DNADN

11、A提取提取PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)物克隆克隆質(zhì)粒質(zhì)粒鑒定鑒定ITS1ITS1測序測序分析分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)材料和方法實(shí)驗(yàn)材料和方法安氏隱孢子蟲卵囊GD株（廣東奶牛場）、HN株（鄭州奶牛場）以及AH株（安徽農(nóng)大）。M1 2 3 4 5bp20001000750500100 M 1 2 3 4bp20001000750500100M1 1 2 3 M2 bp20001000750500100500025001000250圖1 C.andersoni ITS-1 PCR產(chǎn)物 瓊脂糖電泳分析 圖2 C.andersoni ITS-1 重組質(zhì)粒 PCR鑒定圖3 C.andersoni ITS-1

12、 重組質(zhì)粒 EcoR I酶切鑒定1. GD株 2. HN株 3. AH株 4. 宿主對照 5.空白對照測序結(jié)果1. CTTACGTATTTGTTTATTAAACAAAAAATCTTATAATTGAACCTGAACTTGCCTAATTTTCTTAA 652. CTTACGTATTTGTTTATTAAACAAAAAATCTTATAATTGAACCTGAACTTGCCTAATTTTCTTAA3. CTTACGTATTTGTTTATTAAACAAAAAATCTTATAATTGAACCTGAACTTGCCTAATTTTCTTAA1. AGATTATACTTAAGTTGAGTATCTTTTTTAAAATT

13、AGGCCCTGTTCTTAAGAATTAATCCCTACT 1302. AGATTATACTTAAGTTGAGTATCTTTTTTAAAATTAGGCCCTGTTCTTAAGAATTAATCCCTACT3. AGATTATACTTAAGTTGAGTATCTTTTTTAAAATTAGGCCCTGTTCTTAAGAATTAATCCCTACT1. AGCTTTGTATAATTTTTGTATCTTTTCTTTATACCTTGAGAGGGTTCCCTTTTAAGGACTTTGCA 1952. AGCTTTGTATAATTTTTGTATCTTTTCTTTATACCTTGAGAGGGTTCCCTTTTAA

14、GGACTTTGCA3. AGCTTTGTATAATTTTTGTATCTTTTCTTTATACCTTGAGAGGGTTCCCTTTTAAGGACTTTGCA1. AGCTAAATATTCATTTTAGGGGAAAGATCCAGATATTCTTATACTTAATTTTT AGGGGTTTTCTT 2602. AGCTAAATATTCATTTTAGGGGAAAGATCCAGATATTCTTATACTTAATTTTT AGGGGTTTTCTT3. AGCTAAATATTCATTTTAGGGAAAAGATCCAGATATTCTTATACTTAATCTTT AGGGGTTTTCTT1. ATTTTTTT

15、AAAATACTTTTTTGTTATTTGCCGACTTTTTTATTAGTCGTTT ATAATCTCTA 3212. ATTTTTTTAAAATACTTTTTTGTTATTTGCCGACTTTTTTATTAGTCGTTT ATAATCTCTA3. ATTTTTTTAAAATACTTTTTTGTTATTTGCCGACTTTTTTATTAGTCGTTT GTAATCTCTA 圖4 C.andersoni ITS-1 核酸序列的比較1.GD株，2.HN株，3.AH株；“A”，“C”及“G”代表DNA變異位點(diǎn)結(jié)果：GD株、HN株和AH株的ITS-1序列基本一致，僅AH株有三個(gè)堿基差異；但與GenB

16、ank上注冊的C.muris和C.parvum存在種間差異，而且差異顯著。 D Molecular Identification and Characterization of Cryptosporidium spp. from Mainland China。MATERIALS AND METHODSCryptosporidium oocysts（dairy cows in Guangdong, Anhui and Jiangsu provinces）DNA extracte PCRamplificationPurification cloningsequencing analysisSSU

17、rRNA and HSP70DNA UNIQ-5 spin column purification kiturRESULTSM: DG005 marker; 1: Guangdong isolate; 2: Anhui isolate; 3: Jiangsu isolate; 4: No-DNA control450bp290bp(HSP70)(SSU rRNA)Table The length and base composition of the HSP70 and the SSU rDNA sequences representing Cryptosporidium spp. from

18、ChinaSpecies Host Geographicalorigin Length (bp) A+T contents (%) Accession NoHSP70C.andersoniC.andersoniC. parvumSSU rDNAC.andersoni C.andersoni C. parvum Dairy cow Dairy cow Dairy cow Dairy cow Dairy cow Dairy cow Guangdong, ChinaAnhui, ChinaJiangsu, China Guangdong, ChinaAnhui, ChinaJiangsu, Chin

19、a 44644644629029129261.6561.6560.5365.1665.6269.85AJ567386AJ567387AJ567388AJ567389AJ567390AJ567391E 安氏隱孢子蟲PCR診斷試劑盒的初步應(yīng)用XXXX年實(shí)驗(yàn)材料和方法實(shí)驗(yàn)材料和方法 PCR檢測試劑盒、234份奶牛糞樣（廣東、河南）。改良抗酸染色法 飽和蔗糖溶液漂浮法常規(guī)方法常規(guī)方法PCR試劑試劑盒檢測盒檢測檢測樣品處理DNA提取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果M：DL2000 DNA Marker；1，12：陽性對照；2-11，13-22：陽性樣品； 23：陰性對照結(jié)論：改良抗酸法陽性檢出率4%-

20、25%，飽和蔗糖漂浮法陽性檢出率4%-18%，PCR陽性檢出率6%-31%。本試劑盒的檢出率比常規(guī)方法高出2%-13%，顯示本試劑盒具有特異性、敏感性等優(yōu)點(diǎn)。 F Development and Application of Nested PCR Assay for Detection of Dairy Cattle-Derived Cyclospora sp. DNA samples of cattle-derived Cyclospora-like organisms, Giardia sp., Eimeria sp., Cryptosporidiumandersoni, ciliate,

21、 Trichuris sp., and swine-derived Eimeria sp., chicken-derived Eimeria sp. and Cryptosporidium baileyi DNA extracte PCR primers nested PCRPCRamplificationEvaluation of specificityEvaluation of sensitivityMATERIALS AND METHODSRESULTS G Combined PCR-oligonucleotide ligation assay for detection of dair

22、y cattle-derived Cyclospora sp Materials and methods cattle-derived Cyclospora sp, Giardia sp, Eimeria sp,Cryptosporidium andersoni,ciliate Trichuris sp.DNA extracte primers reporter probe selectionPCR procedureOLA procedure Evaluation of specificitysensitivity RESULTSFig. 4. Agarose gel electrophor

23、esis of different content of PCR products. Lane M, DL-2000 marker; lane 1, 50 ng; lane 2, 5 ng; lane3, 0.5 ng; lane 4, 0.05 ng.Fig.1. PCR amplicon of different genomic DNAFig. 3. Spectrophotometric absorbance (A 405 ) value of different content of PCR products.Fig. 2. Spectrophotometric absorbance (

24、A 405 ) value for different nested-PCR products. H 貝氏隱孢子蟲 PCR 檢測試劑盒的研制實(shí)驗(yàn)材料和方法實(shí)驗(yàn)材料和方法貝氏隱孢子蟲GD 株卵囊卵囊純化純化DNADNA提取提取特異特異引物引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì) 反應(yīng)反應(yīng)條件條件優(yōu)化優(yōu)化試劑試劑盒組盒組裝裝特異特異性試性試驗(yàn)驗(yàn)敏感敏感性試性試驗(yàn)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定穩(wěn)定性試性試驗(yàn)驗(yàn)重復(fù)重復(fù)性試性試驗(yàn)驗(yàn)保存保存期試期試驗(yàn)驗(yàn)圖1 試劑盒的特異性試驗(yàn)結(jié)果圖2 試劑盒敏感性試驗(yàn)結(jié)果圖3 試劑盒穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果XXXX年XXXX年圖 2 飽和蔗糖溶液漂浮法處理的貝氏隱孢子蟲卵囊( A 400; B 1000AB圖 3 16份 C. baileyi 陽性樣品的 PCR 擴(kuò)增I 貝氏隱孢子蟲 PCR 診斷試劑盒的應(yīng)用XXXX年X