第六章分子雜交技術

1、第六章第六章 分子雜交技術分子雜交技術第一節(jié)第一節(jié) 探針的選擇和標記探針的選擇和標記第二節(jié)第二節(jié) 雜交和洗膜雜交和洗膜第三節(jié)第三節(jié) 檢測與分析檢測與分析 1、原理、原理 堿基互補配對堿基互補配對 探針（探針（probe） 同特異性目標作用同特異性目標作用 有效檢測有效檢測2、基本步驟、基本步驟 探針的選擇和標記探針的選擇和標記 轉膜轉膜 預雜交、雜交預雜交、雜交 洗膜洗膜 檢測檢測第一節(jié)第一節(jié) 探針的選擇和標記探針的選擇和標記1、克隆探針和合成的寡核苷酸探針、克隆探針和合成的寡核苷酸探針 特異性特異性 靈敏度靈敏度 雜交時間雜交時間2、寡核苷酸探針的類型和應用、寡核苷酸探針的類型和應用 特定序

2、列的單一寡核苷酸探針特定序列的單一寡核苷酸探針 較短而簡并性較高的成套的寡核苷酸探針較短而簡并性較高的成套的寡核苷酸探針 對少量高度純化的蛋白質進行測序；按照遺傳密碼推導對少量高度純化的蛋白質進行測序；按照遺傳密碼推導 較長而簡并性較低的寡核苷酸探針較長而簡并性較低的寡核苷酸探針只含有所有可能密碼中的一部分只含有所有可能密碼中的一部分簡并位點上帶上一個簡并位點上帶上一個“中性中性”堿基，如次黃苷酸堿基，如次黃苷酸例：根據(jù)氨基酸序列選擇長例：根據(jù)氨基酸序列選擇長17個核苷酸的寡核苷個核苷酸的寡核苷酸探針酸探針l 數(shù)目數(shù)目22 24=323、寡核苷酸探針的選擇原則寡核苷酸探針的選擇原則 長度長度1

3、8-50bp G、C堿基組成在堿基組成在40%-60% 分子內不存在互補區(qū)分子內不存在互補區(qū) 避免在序列中連續(xù)出現(xiàn)一個堿基的多次重復避免在序列中連續(xù)出現(xiàn)一個堿基的多次重復4、探針的標記方法、探針的標記方法 雙鏈雙鏈DNA探針的制備探針的制備 切口平移；隨機引物切口平移；隨機引物 使用前變性；雜交過程中可能發(fā)生自退火使用前變性；雜交過程中可能發(fā)生自退火 單鏈單鏈DNA探針的制備探針的制備 在單鏈模板上進行引物延伸反應；化學合成；在單鏈模板上進行引物延伸反應；化學合成；PCR 單鏈單鏈RNA探針的制備探針的制備雙鏈雙鏈DNA的切口平移標記法的切口平移標記法DNA的隨機引物標記法的隨機引物標記法ba

4、ck酶切位點要選擇在酶切位點要選擇在正好處于插入的正好處于插入的目標目標DNA的下游的下游使轉錄產(chǎn)物使轉錄產(chǎn)物不含載體序列不含載體序列 利用體外轉錄體系產(chǎn)生單鏈利用體外轉錄體系產(chǎn)生單鏈RNA探針探針5、標記物的選擇、標記物的選擇 放射性同位素放射性同位素 非放射性同位素非放射性同位素地高辛（地高辛（Digoxigenin）-11-dUTP的結構的結構第二節(jié)第二節(jié) 雜交和洗膜雜交和洗膜1、雜交的速率與探針長度及復雜性、雜交的速率與探針長度及復雜性示示t1/2和雜交探針長度之間的關系和雜交探針長度之間的關系2、雜交的最適條件、雜交的最適條件 雜交分子的穩(wěn)定性雜交分子的穩(wěn)定性 溫度溫度 雜交的嚴緊性

5、雜交的嚴緊性 高溫高溫/低鹽低鹽第三節(jié)第三節(jié) 檢測與分析檢測與分析非放射性非放射性DNA標記和檢測程序標記和檢測程序例：轉基因植物的檢測例：轉基因植物的檢測抗生素篩選、抗生素篩選、PCR、Southern、Northern、Western 雙酶切檢測雙酶切檢測 單酶切檢測單酶切檢測R0代轉化子的代轉化子的Southern分析分析轉化子轉化子R1后代的后代的Southern分析分析 如何判斷插入拷貝數(shù)？如何判斷插入拷貝數(shù)？與含有不同拷貝數(shù)（與含有不同拷貝數(shù)（1、5、10）的質粒雜交結果做對照）的質粒雜交結果做對照通過多個單酶切結果判斷通過多個單酶切結果判斷 通過選擇酶切位點和探針位置，可進行通過

6、選擇酶切位點和探針位置，可進行comprehensive雜交雜交，以判斷外源插入片段是否串，以判斷外源插入片段是否串聯(lián)排列，以及排列方向聯(lián)排列，以及排列方向 原位雜交（原位雜交（in situ hybridization，ISH） 利用含有互補序列的利用含有互補序列的DNA或或RNA探針直接檢測在染色體、探針直接檢測在染色體、細胞或組織內特定細胞或組織內特定DNA或或RNA序列的技術序列的技術 廣泛應用于檢測染色體的結構變異、外源染色體的滲入和廣泛應用于檢測染色體的結構變異、外源染色體的滲入和轉基因的分子細胞遺傳學鑒定等轉基因的分子細胞遺傳學鑒定等 熒光原位雜交熒光原位雜交 （fluoresc

7、ence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）習題習題1 某人在做某人在做Southern雜交時，為節(jié)省時間，完成凝膠電泳后，雜交時，為節(jié)省時間，完成凝膠電泳后，未經(jīng)未經(jīng)NaOH溶液浸泡凝膠，就直接將溶液浸泡凝膠，就直接將DNA從凝膠轉至硝酸從凝膠轉至硝酸纖維素膜上，然后應用標記探針雜交，結果發(fā)現(xiàn)放射自顯纖維素膜上，然后應用標記探針雜交，結果發(fā)現(xiàn)放射自顯影后膠片上一片空白。請問應如何解釋這一結果。影后膠片上一片空白。請問應如何解釋這一結果。習題習題2 2個正常個體生育一個患有唐氏綜合癥（個正常個體生育一個患有唐氏綜合癥（21號染色體三體）號染色體三體）的病兒，利用的病兒，利用1段段21號染色體探針，