非清髓造血干細(xì)胞移植后致敏供者淋巴細(xì)胞輸注對(duì)嵌合狀態(tài)及GVHD影響的實(shí)驗(yàn)研究

1、非清髓造血干細(xì)胞移植后致敏供者淋巴細(xì)胞輸注對(duì)嵌合狀態(tài)及GVHD影響的實(shí)驗(yàn)研究    作者：陳寶安，張琰，丁家華，畢延智，趙剛，高沖，孫耘玉，孫雪梅，王駿，陳寧娜，程堅(jiān)    【摘要】 本研究目的是探討經(jīng)受者皮膚致敏后的異基因供者淋巴細(xì)胞輸注（DLI）是否能在促進(jìn)形成完全供者嵌合（CC）的同時(shí)減輕移植物抗宿主病（GVHD）。以C57BL/6小鼠（H-2b，B6）為受者，于第0天接受60Co 線全身照射（TBI），總劑量為5.5 Gy，照射當(dāng)天移植經(jīng)粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）動(dòng)員后的BALB/c小鼠（H-2d，B

2、A）外周血干細(xì)胞（2×107個(gè)），移植后第2天腹腔注射環(huán)磷酰胺200 mg/kg，并分別于移植后第28天輸注致敏/未致敏的供者淋巴細(xì)胞2×106。結(jié)果顯示，致敏后DLI的受鼠（黑色）無(wú)1例出現(xiàn)GVHD，60天時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆┱咔逗希硇兔黠@呈現(xiàn)為供鼠（白色）特征，CD4 /CD8 T淋巴細(xì)胞比值在DLI后早期下降，半月后有所升高，但仍低于正常水平；未致敏的DLI受鼠出現(xiàn)不同程度的GVHD，嵌合率稍有上升，仍表現(xiàn)為混合嵌合體（MC），CD4 /CD8 比值在DLI后早期升高，后期降至正常水平。結(jié)論：經(jīng)受者皮膚致敏后的DLI在誘導(dǎo)CC的同時(shí)降低GVHD發(fā)病率，CD4 /CD8 比

3、值與GVHD發(fā)病率間具有良好的相關(guān)性。    【關(guān)鍵詞】 非清髓性異基因造血干細(xì)胞移植 Effects of Sensitized Donor Lymphocyte Infusion on the Chimerism and Graft-versus-Host Disease after Nonmyeloablative Allogeneic Stem Cell Transplantation Abstract    To explore whether the complete donor chimerism c

4、ould be achieved and graft-versus-host disease could be alleviated by donor lymphocyte infusion    which was sensitized by the skin of the recipient，female C57BL/6 mice (H-2b，B6) as recipients received total body irradiation (TBI) of 5.5 Gy (60Co -ray) on day 0 followed by alloge

5、neic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT). The allo-grafts consisted of 2×107 peripheral hematopoietic stem cells from mobilized male BALB/c (H-2d) donor mice with the granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF). Day 2 after allo-HSCT，the recipient mice were given 200 mg/kg cyc

6、lophosphamide intraperitoneally. Afterwards these recipient mice were infused 2×106 sensitized or unsensitized-donor lymphocytes at the 28 days after transplantation. The results showed that the mice receiving sensitized-donor lymphocyte infusion did not suffer from GVHD and the phenotypic char

7、acter of the recipient mice (black color) converted to that of the donor mice (white color)，and to become full-donor chimerism. It was found that the ratio 0f CD4 /CD8 T lymphocytes of them decreased at the earlier period and increased after half month，but which were also lower than that of the norm

8、al value. While various grades of acute GVHD was observed in that of the control group and the mixed-chimeras were maintained，though it increased a little，and the ratio of CD4 /CD8 T lymphocytes increased at first，then decreased to the normal level half month later. It is concluded that sensitized D

9、LI converted mixed to comlete donor chimerism without GVHD，and the rate of CD4 /CD8 has close relation to the incidence of GVHD. Key words    nonmyeloablative allogeneic hematopoietic stem cell transplantation；donor lymphocyte infusion；chimerism；graft-versus-host diseaseJ Exp Hem

10、atol 2006；14(1):102-106    異基因外周造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)是治療惡性血液病的重要手段，特別是近年來(lái)隨著非清髓性SCT的開(kāi)展，給更多的血液病患者帶來(lái)了希望。非清髓性移植以較低強(qiáng)度的預(yù)處理誘導(dǎo)受者的免疫耐受，使得供者細(xì)胞植入并形成混合嵌合體，減少了移植相關(guān)并發(fā)癥和相關(guān)死亡。由于混合嵌合體的移植物抗白血病(GVL)作用較弱1，2，且隨著嵌合率的逐漸下降，移植后復(fù)發(fā)率明顯增高，故在其基礎(chǔ)上進(jìn)行供者淋巴細(xì)胞輸注(DLI)，對(duì)加強(qiáng)GVL效應(yīng)，降低疾病復(fù)發(fā)率，提高無(wú)病生存期具有重要臨床意義。GVHD作為DLI后的主要并發(fā)癥，明

11、顯限制了DLI的臨床應(yīng)用，探索一種既避免GVHD而又不損害GVL效應(yīng)的方法成為目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)之一。本研究探討C57BL/6小鼠經(jīng)非清髓性異基因外周造血干細(xì)胞移植后，輸注經(jīng)受鼠皮膚致敏后的供者淋巴細(xì)胞對(duì)于嵌合狀態(tài)及GVHD發(fā)病率的影響，同時(shí)檢測(cè)DLI后T細(xì)胞亞群的變化，以評(píng)價(jià)CD4/CD8比值與GVHD之間的相關(guān)性。 材料和方法 動(dòng)物 受鼠為清潔級(jí)雌性C57BL/6小鼠(H-2b，B6)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，8-10周齡，體重16.7×1.4 g；供鼠為清潔級(jí)雄性BALB/c小鼠(H-2d)，由揚(yáng)州大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院提供，均飼養(yǎng)于東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，

12、飼料及墊料均經(jīng)輻照消毒，飲用高壓消毒無(wú)菌水。 試劑及器材 環(huán)磷酰胺（CTX，200毫克/支，上海華聯(lián)制藥有限公司產(chǎn)品），重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF，75微克/支，上海三維生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品），單克隆熒光抗體（FITC anti-mouse CD3、CD4、CD8，25微克/支，杭州聯(lián)科公司代理的美國(guó)Caltag公司產(chǎn)品），全血樣本DNA抽提試劑盒（晶美公司代理的美國(guó)Gentra公司產(chǎn)品），60Co放療機(jī)（中國(guó)核動(dòng)力研究設(shè)計(jì)院GWGT80型60Co遠(yuǎn)距離治療機(jī)，南京市第二人民醫(yī)院提供幫助），流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman-coulter公司產(chǎn)品)。 供鼠外周血?jiǎng)訂T及干細(xì)胞懸液的制

13、備 BALB/c小鼠于移植前4天起給予250 g/kg G-CSF，皮下注射，每日1次，末次注射2-3小時(shí)后在無(wú)菌條件下經(jīng)內(nèi)齜靜脈取血，置入含EDTA的抗凝管中，利用淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-hypaque液，比重1.077，20)水平離心30分鐘，400×g，提取單個(gè)核細(xì)胞，然后用0.01 mmol/L的PBS液漂洗2次后重懸細(xì)胞并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至8×107/ml。 異基因干細(xì)胞移植 受鼠移植前6天開(kāi)始飲用含紅霉素（250 mg/L）和慶大霉素（320 mg/L）的無(wú)菌水，并持續(xù)至移植后2周。移植當(dāng)日將受鼠置于清潔級(jí)包裝的塑料盒內(nèi)接受60Co 射線5.5 Gy全身照射(

14、TBI)，劑量率167.68 cGy/min，照射后4小時(shí)內(nèi)經(jīng)尾靜脈輸注供鼠PBMNC 2×107個(gè)，移植后第2天予CTX 200 mg/kg腹腔注射。    供鼠淋巴細(xì)胞制備 移植后第1天起取B6小鼠背部皮膚1 cm×1 cm，埋入供鼠皮內(nèi)，切口局部縫合。每周1次×4周，以致敏供鼠。第28天致敏與未致敏的供鼠分別經(jīng)內(nèi)齜靜脈采血后以Ficoll分離淋巴細(xì)胞（分離方法同干細(xì)胞采集），用0.01 mmol/L的PBS液重懸細(xì)胞并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至8×106/ml。操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì) 移植后每3天采血計(jì)數(shù)

15、白細(xì)胞、稱(chēng)量體重，同時(shí)觀察小鼠狀態(tài)，排除死亡小鼠，待第21天造血恢復(fù)，體重穩(wěn)步回升后將22只受鼠隨機(jī)分為3組。A組：?jiǎn)渭円浦步M（n=6）；B組：第28天回輸2×106個(gè)未致敏供鼠淋巴細(xì)胞（n=8）；C組：第28天回輸2×106個(gè)致敏后供鼠淋巴細(xì)胞（n=8）。同時(shí)設(shè)預(yù)處理對(duì)照組，觀察造血恢復(fù)及表型變化。所有受鼠均未給予GVHD防止措施。 GVHD主要觀察指標(biāo) 移植后每日觀察小鼠體重、體形、體位、毛發(fā)、腹瀉等，記錄存活期，存活時(shí)間超過(guò)60天者為長(zhǎng)期存活。每3天稱(chēng)量體重。死亡小鼠取肝臟、脾臟、小腸和爪墊皮膚組織大體形態(tài)觀察后置于10%福爾馬林液中固定保存，集中包埋、切片，HE染色

16、后光學(xué)顯微鏡下觀察，判斷GVHD情況。 異基因嵌合體的測(cè)定 于移植后第21、60、90天分別經(jīng)內(nèi)眥靜脈取各組小鼠外周血250 l，EDTA抗凝后，應(yīng)用Genomic DNA Purification試劑盒提取DNA，保存于-20。PCR擴(kuò)增：輸入雌性B6小鼠體內(nèi)的雄性BALB/c小鼠造血干細(xì)胞帶有Y染色體特有的性別決定基因(SRY基因)。SRY引物用DNAStar軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程公司合成，上游引物序列為5TGGTGTGGTCCCGTGGTGAGAG3，下游引物序列為5GATGGCATGTGGGTTCCTGTCC3，擴(kuò)增產(chǎn)物為296 bp，以BALB/C的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物為參照。PCR

17、反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液5 l，25 mmol/L MgCl2 5 l，dNTPs 1 l，10 molL上游及下游引物各0.5 l，DNA模板2 l，TaqDNA聚合酶0.5 U（上海申能博采公司提供），補(bǔ)足雙蒸水至50 l。擴(kuò)增條件：95預(yù)變性5分鐘，95變性60秒，60退火60秒，72延伸1分鐘，循環(huán)39次，末次循環(huán)后72再延伸10分鐘。產(chǎn)物檢測(cè)：擴(kuò)增產(chǎn)物在含0.5 mmolL溴乙錠的2瓊脂糖凝膠中以4-5 V/cm電壓降電泳30-45分鐘，于Image Master VDS凝膠掃描儀上成像。用Totallab v2.01凝膠圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，所有B6小鼠擴(kuò)增產(chǎn)物

18、的光密度均以BALB/c為基準(zhǔn)較正，以B6/BA表示嵌合率。    T細(xì)胞亞群測(cè)定 移植后第45、60天分別取各組小鼠外周血50l（EDTA抗凝），加入10 l的直標(biāo)單克隆抗體于室溫下放置10分鐘，再加入50 l的溶血?jiǎng)╈o置10分鐘后加入2ml的蒸流水室溫放置10分鐘，然后以300×g離心5分鐘，加0.5ml的PBS后上機(jī)檢測(cè)CD3 、CD4 、CD8 細(xì)胞數(shù)。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.O專(zhuān)業(yè)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以x±SD表示，行方差分析、t檢驗(yàn)。 結(jié)    果 存活期 A組及C組小鼠體重

19、均穩(wěn)步上升，無(wú)1例死亡，長(zhǎng)期存活率100%；B組小鼠輸注未致敏的供者淋巴細(xì)胞后，3只小鼠在輸注半月內(nèi)死亡，長(zhǎng)期存活率62.5%。A、C組小鼠存活時(shí)間均較B組明顯延長(zhǎng)（P<0.05）。 GVHD發(fā)生情況 B組小鼠行未致敏DLI后均出現(xiàn)不同程度的弓背體位、翹毛、體重下降、消瘦、精神萎靡、腹瀉等表現(xiàn)（圖1），3只小鼠在輸注后半月內(nèi)死亡。病理檢查符合GVHD表現(xiàn)： 肝臟：肝細(xì)胞空泡樣變，匯管區(qū)內(nèi)有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)灶狀出血；脾臟：萎縮，巢狀結(jié)構(gòu)破壞，可見(jiàn)大量散在浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞、出血壞死灶及含鐵血黃素的沉積；小腸：腸粘膜水腫出血，固有層和基層有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；皮膚：厚薄不均，真皮層內(nèi)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞

20、浸潤(rùn)、膠原纖維腫脹。與移植后未回輸淋巴細(xì)胞前死于GVHD小鼠的尸解結(jié)果一致。C組小鼠無(wú)1例出現(xiàn)GVHD表現(xiàn)，體重穩(wěn)步上升，精神狀態(tài)良好。 表型變化及嵌合體檢測(cè)結(jié)果 B、C組小鼠于移植后第35天開(kāi)始逐漸呈現(xiàn)出供鼠的表型，以C組小鼠變化明顯（圖2），移植后90天已完全轉(zhuǎn)變?yōu)楣┦蟊硇吞卣鳌、B、C組小鼠在移植后21天時(shí)均檢測(cè)到混合嵌合體，目的基因表達(dá)率分別為31.247±4.337，30.880±4.118，30.608±4.064， 各組間差異無(wú)顯著性；60、90天時(shí)A組均未檢測(cè)到嵌合體，B組仍為混合嵌合體，表達(dá)率分別為58.767±13.683和58.5

21、79±13.01，C組60天則轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆┱咔逗希?0天時(shí)維持不變，各組間比較差異具有顯著性（P<0.05）。 T淋巴細(xì)胞亞群 如圖3、4及附表所示，DLI后早期(45天 )CD4/CD8比值在B組中明顯升高，而C組顯著降低，各組間比較差異有顯著性（P<0.05），且C組CD8 細(xì)胞數(shù)明顯升高，與其它各組比較有顯著性差異（P<0.05）；半月后B組（60天）CD4/CD8比值下降，與正常及預(yù)處理對(duì)照組間差異無(wú)顯著性，C組CD4/CD8雖有所上升，仍低于其它各組，差異具有顯著性（P<0.05）。討 論 DLI作為一種過(guò)繼性免疫療法通過(guò)促進(jìn)完全供者嵌合體、加強(qiáng)GV

22、L效應(yīng)，在預(yù)防與治療移植后復(fù)發(fā)病例中發(fā)揮了重要作用3，4。由于DLI后存在有致死性GVHD及骨髓衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥，故目前大量的實(shí)驗(yàn)研究集中于如何降低DLI后的GVHD發(fā)病率。抑制受體抗原呈遞細(xì)胞，導(dǎo)入自殺基因、阻斷B7-CD28途徑、選擇性去除供體同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞等多種方法均處于實(shí)驗(yàn)階段。    大量試驗(yàn)證實(shí)，通過(guò)亞致死劑量射線照射結(jié)合CTX可以建立小鼠骨髓移植的混合嵌合體模型，我們?cè)诖嘶A(chǔ)上，以G-CSF動(dòng)員后的供鼠外周血干細(xì)胞回輸，在主要組織相容性復(fù)合體（MHC）完全錯(cuò)配的兩種近交系C57BL/6與BALB/c小鼠間成功地建立了非清髓性外周血干細(xì)

23、胞移植的混合嵌合體模型，然后回輸經(jīng)受鼠皮膚致敏過(guò)的供者淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)形成了完全供者嵌合體，同時(shí)無(wú)GVHD的發(fā)生，而未經(jīng)任何處理的DLI組仍保持混合嵌合狀態(tài)，且出現(xiàn)了不同程度的GVHD，生存期較致敏后DLI組明顯縮短。這與George等5在MHC配型相同的犬類(lèi)非清髓移植模型中，通過(guò)受者皮膚（次要組織相容性抗原差異）致敏供者后進(jìn)行DLI誘導(dǎo)了完全嵌合體（CC）形成的同時(shí)降低GVHD發(fā)病率的結(jié)果相一致。另外Junghanss等6以混合嵌合體受者腎臟致敏供者后行DLI亦促進(jìn)了CC的形成，且無(wú)排斥反應(yīng)的發(fā)生。Slavin等7將供者的外周淋巴細(xì)胞與受者父母外周血淋巴細(xì)胞共孵育后回輸治療移植后復(fù)發(fā)病例取得了

24、良好的臨床效果，獲得了穩(wěn)定持久CC的同時(shí)未觀察到GVHD的發(fā)生。    免疫供者淋巴細(xì)胞后回輸明顯優(yōu)于直接回輸，對(duì)于促進(jìn)完全嵌合狀態(tài)的轉(zhuǎn)變及降低GVHD的發(fā)病率具有重要意義，這種作用的可能機(jī)制是：受者組織（除造血組織外）表達(dá)MHC類(lèi)抗原，可以提供T細(xì)胞激活所需要的第一信號(hào)，在致敏過(guò)程中，其表面可受到多種細(xì)胞因子的作用而表達(dá)MHC類(lèi)抗原，為T(mén)細(xì)胞的活化提供第二信號(hào)，通過(guò)間接途徑加速了致敏物的排斥反應(yīng)。誘導(dǎo)產(chǎn)生的記憶性T細(xì)胞輸入受者體內(nèi)，接觸非應(yīng)激狀態(tài)下僅表達(dá)MHC類(lèi)抗原的組織細(xì)胞后，由于缺乏共刺激信號(hào)而誘導(dǎo)了免疫無(wú)能，對(duì)受者組織的攻擊性下降，從而降低了GV

25、HD發(fā)病率6。造血細(xì)胞與其他組織細(xì)胞間存在抗原性的差異，特別是小鼠，僅骨髓源性的細(xì)胞表達(dá)MHC類(lèi)抗原，可迅速激活已致敏的記憶性T細(xì)胞，從而打破了原有的免疫耐受，促進(jìn)了CC的形成；移植排斥與耐受是一個(gè)復(fù)雜的體內(nèi)過(guò)程，致敏物中的可溶性抗原、反復(fù)致敏過(guò)程中激活的T細(xì)胞本身及其所釋放的多種細(xì)胞因子可激活體液免疫，從而參與免疫耐受的形成。致敏過(guò)程中可溶性抗原刺激產(chǎn)生的封閉抗體及T細(xì)胞的抗獨(dú)特型網(wǎng)絡(luò)等可能在致敏后DLI受鼠GVHD發(fā)病率降低過(guò)程中發(fā)揮了一定的作用。其確切機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討。    在移植后發(fā)揮作用的T細(xì)胞亞群主要為CD4 的Th1/Th2及CD8

26、的Tc1/Tc2，其中CD4 細(xì)胞通過(guò)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”始動(dòng)了GVHD的病理過(guò)程，而Th2及Tc2亞群在移植后發(fā)揮GVL及抗病毒感染、調(diào)節(jié)GVHD上發(fā)揮了重要作用8，9。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)各組的T細(xì)胞亞群進(jìn)行監(jiān)測(cè)，存在明顯差異，致敏后DLI組早期CD8 細(xì)胞數(shù)增高，CD4 /CD8 下調(diào)；未致敏DLI組早期以CD4 細(xì)胞增高明顯，CD4 /CD8 升高；后期致敏后DLI組CD4 /CD8 雖有所上升，但仍低于正常對(duì)照，差異有顯著性，且DLI后兩組小鼠的免疫重建均明顯優(yōu)于單純移植組。CD4 /CD8 比值的變化在一定程度上反應(yīng)了受者的耐受狀態(tài)，這與趙振林等10在T細(xì)胞疫苗免疫前后CD4 、CD8 T細(xì)胞變

27、化的研究結(jié)果相一致。致敏后DLI組CD4 /CD8 比值的變化反應(yīng)了B6小鼠對(duì)供者較高的耐受性，與較低的GVHD發(fā)病率間具有良好的相關(guān)性。    【參考文獻(xiàn)】 1Beck JF，Klingebiel T，Kreyenberg H，et al. Relapse of childhood ALL，AML and MDS after allogeneic stem cell transplantation can be prevented by donor lymphocyte infusion in a critical stage of increasin

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