觀察DNA和RNA在細胞中的分布--實驗方案

1、觀察DNA和RNA在細胞中的分布實驗方案第二組目錄一、 實驗前的思考2二、 背景資料21. 核酸是什么?22. DNA是什么?33. RNA是什么?34. DNA的種類和分布35. RNA的種類和分布36. 染色劑成分47. 染色原理5三、 實驗原理5四、 實驗目的6五、 實驗用具及試劑6六、 實驗方法及步驟分析61. 實驗材料62. 實驗方法6七、 注意事項8八、 附錄91. 試劑配制方法92. 重要儀器的使用方法9 觀察DNA和RNA在細胞中的分布1、 實驗前的思考實驗前已經(jīng)知道的知識通過實驗想知道的知識實驗之后獲得了的知識1.顯微鏡的使用方法；2.臨時裝片的制作方法；3.細胞中含有DNA

2、和RNA兩種核酸，DNA主要分布在細胞核中，RNA大部分存在于細胞質(zhì)中；4.細胞的基本結(jié)構(gòu)。1.Unna試劑如何將 DNA 和 RNA 染上不同顏色；2.材料的選擇、用不用鹽酸水解、染色時間等對染色效果分別有什么影響，如何獲得最佳的實驗效果。1.對Unna試劑與核酸結(jié)合的染色原理有了更深刻的認識；2.比較分析不同實驗步驟所獲得的實驗效果，學會優(yōu)化實驗；3.驗證了DNA 和 RNA 在細胞中分布，對理論知識有了深刻感知。2、 背景資料1. 核酸是什么?核酸是由許多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，為生命的最基本物質(zhì)之一。DNA和RNA都是由一個一個核苷酸(nucleotide)頭尾相連而形成的。單

3、個核苷酸是由含氮有機堿(稱堿基)、戊糖(即五碳糖)和磷酸三部分構(gòu)成的。根據(jù)化學組成不同，核酸可分為核糖核酸（簡稱RNA）和脫氧核糖核酸（簡稱DNA）。核酸是相鄰二個核苷酸之間的連接鍵即：3，5磷酸二酯鍵。這種連接可理解為核糖核酸基上的3'位羥基與相鄰5'核苷酸的磷酸殘基之間，以及核苷酸糖基上的5'位羥基與相鄰3'核苷酸的磷酸殘基之間形成的兩個酯鍵。2. DNA是什么?DNA是由數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸按一定堿基順序彼此用3，5-磷酸二酯鍵相連構(gòu)成的長鏈。3. RNA是什么?RNA由核糖核苷酸經(jīng)磷酯鍵縮合而成長鏈狀分子。一個核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和堿基構(gòu)成。R

4、NA的堿基主要有4種，即A腺嘌呤，G鳥嘌呤，C胞嘧啶，U尿嘧啶。其中，U尿嘧啶取代了DNA中的T胸腺嘧啶而成為RNA的特征堿基。4. DNA的種類和分布原核細胞的遺傳物質(zhì)是一個長DNA分子，但是原核細胞沒有真正的細胞核。真核細胞核中有不止一個染色體，每個染色體也只含一個DNA分子。不過它們一般都比原核細胞中的DNA分子大而且和蛋白質(zhì)結(jié)合在一起。DNA分子的功能是貯存決定物種的所有蛋白質(zhì)和RNA結(jié)構(gòu)的全部遺傳信息；策劃生物有次序地合成細胞和組織組分的時間和空間；確定生物生命周期自始至終的活性和確定生物的個性。除染色體DNA外，有極少量結(jié)構(gòu)不同的DNA存在于真核細胞的線粒體和葉綠體中。DNA病毒的

5、遺傳物質(zhì)也是DNA。5. RNA的種類和分布 信使RNA。mRNA的功能就是把DNA上的遺傳信息精確無誤地轉(zhuǎn)錄下來，然后再由mRNA的堿基順序決定蛋白質(zhì)的氨基酸順序，完成基因表過程中的遺傳信息傳遞過程。在真核生物中，轉(zhuǎn)錄形成的前體RNA中含有大量非編碼序列，大約只有25%序列經(jīng)加工成為mRNA，最后翻譯為蛋白質(zhì)。 轉(zhuǎn)運RNA。如果說mRNA是合成蛋白質(zhì)的藍圖，則核糖體是合成蛋白質(zhì)的工廠。但是，合成蛋白質(zhì)的原材料20種氨基酸與mRNA的堿基之間缺乏特殊的親和力。因此，必須用一種特殊的RNA轉(zhuǎn)移RNA（transferRNA，tRNA）把氨基酸搬運到核糖體上，tRNA能根據(jù)mRNA的遺傳密碼依次準

6、確地將它攜帶的氨基酸連結(jié)起來形成多肽鏈。每種氨基酸可與1-4種tRNA相結(jié)合，已知的tRNA的種類在40種以上。核糖體RNA（ribosomalRNA），rRNA是組成核糖體的主要成分。核糖體是合成蛋白質(zhì)的工廠。在大腸桿菌中，rRNA量占細胞總RNA量的75%-85%，而tRNA占15%，mRNA僅占3-5%。rRNA一般與核糖體蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，形成核糖體（ribosome），如果把rRNA從核糖體上除掉，核糖體的結(jié)構(gòu)就會發(fā)生塌陷。原核生物的核糖體所含的rRNA有5S、16S及23S三種。MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約

7、2025個核苷酸。成熟的miRNAs是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進RNA誘導的沉默復合體，通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。最近的研究表明miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。小分子RNA存在于真核生物細胞核和細胞質(zhì)中，它們的長度為100到300個堿基(酵母中最長的約1000個堿基)。多的每個細胞中可含有105 106 個這種RNA分子，少的則不可直接檢測到, 它們由RNA聚合酶或RNA聚合酶所合成, 其中某些象mR

8、NA一樣可被加帽。主要有兩種類型的小分子RNA:一類是snRNA(small nuclear RNA),存在于細胞核中；另一類是scRNA(small cytoplasmic RNA)，存在于細胞質(zhì)中。小分子RNA通常與蛋白質(zhì)組成復合物, 在細胞的生命活動中起重要的作用。端體酶RNA(telomeraseRNA），它與染色體末端的復制有關(guān)。反義RNA(antisenseRNA），它參與基因表達的調(diào)控。6. 染色劑成分染色劑的主要成分為甲基綠和吡羅紅，甲基綠和吡羅紅在水中電離后，都產(chǎn)生帶正電荷的陽離子。甲基綠電離后產(chǎn)生兩個正電荷，堿性較強。吡羅紅電離后產(chǎn)生一個正電荷，堿性較甲基綠弱。 甲基綠 吡

9、羅紅7. 染色原理甲基綠與派洛寧作為混合染料時，甲基綠與染色質(zhì)中DNA選擇性結(jié)合顯示綠色或藍色；派洛寧與核仁、細胞質(zhì)中的RNA選擇性結(jié)合顯示紅色。其原因可能是兩種染料的混合染液中有競爭作用。DNA和RNA兩種核酸分子都是多聚體，但是它們的聚合程度有所不同。DNA聚合程度高，易于甲基綠結(jié)合6  ；RNA聚合程度低易于吡羅紅結(jié)合。所以當吡羅紅與甲基綠混在一起作為染料時吡羅紅與核仁、細胞質(zhì)中的RNA選擇性結(jié)合，從而顯示紅色；甲基綠與染色質(zhì)中的DNA選擇性結(jié)合，從而顯示綠色。綜上所述，RNA對吡羅紅的親和力大，被染成紅色；DNA對甲基綠的親和力大，被染成綠色。3、 實驗原理細胞核內(nèi)含有DNA

10、以及核仁RNA等。大部分的RNA存在于細胞質(zhì)中。此外，線粒體、葉綠體也含有DNA。DNA 和 RNA 核酸分子上磷酸基團帶有負電荷密度差異，與甲基綠和吡咯紅染料的親和力不同，形成鹽鍵，在原位沉淀顯色，從而顯示出不同類型的核酸在完整細胞中的分布。其中，甲基綠與空間構(gòu)型完整的 DNA 親和力強，甲基綠分子中的兩個含 N 基團帶正電荷，正好與 聚合程度高的DNA 分子的帶負電的磷酸基團相結(jié)合，這樣 DNA 能被甲基綠染成藍綠色。RNA 是單鏈，聚合程度較低，負電荷密度小，吡咯紅與其磷酸基團結(jié)合在原位呈紅色。所以，甲基綠和吡咯紅（Unna 試劑）就是很好的選擇性染色的混合堿性染液。4、 實驗目的1.鞏

11、固臨時裝片制備和顯微鏡操作的方法；2.結(jié)合DNA和RNA的物理特性，闡述染色原理，掌握染色技術(shù)；3.觀察DNA和RNA在細胞中的分布，指出DNA和RNA在細胞中的具體位置。5、 實驗用具及試劑材料人的口腔上皮細胞用具消毒牙簽、載玻片、蓋玻片、鑷子、濾紙、燒杯、滴管、容量瓶、顯微鏡、試劑瓶、棕色試劑瓶試劑Unna試劑、0.9%Nacl溶液、8%鹽酸6、 實驗方法及步驟分析1. 實驗材料材料理由口腔上皮細胞取材簡單經(jīng)濟，易于得到單個細胞，細胞透明，便于觀察。2. 實驗方法步驟操作方法作用改進1)制片在潔凈的載玻片上，滴一滴質(zhì)量分數(shù)為 0.9%的NaCL用消毒牙簽在自己漱凈的口腔內(nèi)壁上刮幾下，把牙簽

12、上附有碎屑的一端，放在上述載玻片的液滴中涂抹幾下點燃酒精燈，將涂有口腔上皮細胞的載玻片烘干0.9%的NaCL溶液：維持口腔上皮細胞的正常形態(tài)烘干：固定細胞，防止沖洗時將其沖掉烘干殺死細胞， 補充做一組烘干改為自然晾干的裝片2)水解在小燒杯中加入 30ml質(zhì)量分數(shù)為 8的鹽酸，將烘干的載玻片放入小燒杯中在大燒杯中加入 30溫水將盛有鹽酸和載玻片的小燒杯放在大燒杯中保溫 5min鹽酸：改變細胞膜的通透性，加速染色劑的跨膜運輸。同時，使染色體中的 DNA與蛋白質(zhì)分離，便于 DNA 與染色劑的結(jié)合。30溫水：保持溫度，利于反應更充分鹽酸會破壞 DNA 的結(jié)構(gòu)，補充一組不用鹽酸浸泡 鹽酸會改變實驗材料的

13、pH 值，補充一組在蒸餾水沖洗前用NaHCO3沖洗 10 秒3)沖洗涂片用蒸餾水的緩水流沖洗載玻片 10 秒，用吸水紙吸去載玻片上的水分緩水流沖洗：避免細胞被水沖掉4)染色將吡咯紅甲基綠染色劑1-2 滴在載玻片上，染色 5 分鐘吸去多余的染色劑，清水漂洗后，蓋上蓋玻片漂洗：去除染液浮色染色時間影響染色效果，補充兩組染色時間為2分鐘、3.5分鐘5)觀察低倍鏡觀察：選擇染色均勻，色澤淺的區(qū)域，移至視野中央，將物象調(diào)節(jié)清晰高倍鏡觀察：調(diào)節(jié)細準焦螺旋，觀察細胞核和細胞質(zhì)的染色情況實驗流程 滴加0.9%的NaCL的載玻片 涂抹口腔上皮細胞 酒精燈烘干 侵泡鹽酸（9張） 不侵泡鹽酸（3張）緩水沖洗 NaH

14、CO3沖洗 不沖洗 （3張） （3張） （3張） Unna 試劑染色（同組裝片的染色時間 依次為2、3.5、5min） 洗去染液浮色 顯微鏡鏡檢（小組4名成員每人完成一組實驗）紀錄實驗結(jié)果浸泡鹽酸NaHCO3 沖洗緩水沖洗結(jié)果是是是2min3.5min5min是否是2min3.5min5min是否否2min3.5min5min否否否2min3.5min5min7、 注意事項1. 甲基綠吡咯紅染液要現(xiàn)用現(xiàn)配，否則，染料會被氧化，影響染色效果。同時，為避免變質(zhì)，需要使用棕色瓶盛放。2. 保證取到實驗材料，即人的口腔上皮細胞的外部形態(tài)。用消毒牙簽的鈍端刮取，實驗時要強調(diào)兩點：取材部位，是口腔側(cè)壁，不

15、是齒眼和齒縫；刮取的力度為輕刮且有微痛感，過輕，則取不到口腔上皮細胞。3. 在制作人的口腔上皮細胞臨時裝片時，要用消毒牙簽盡量把細胞抹開，避免細胞重疊。4. 該實驗需要觀察染色情況，所選擇的材料應為白色或無色，例如教材中選用的植物材料為洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮，而不能使用紫色外表皮。5. 實驗中需要許多干凈載玻片和蓋玻片，應提前準備好；觀察完的載玻片和蓋玻片應放入清水中浸泡，實驗完成后應立即清洗干凈烘干，并放入稀鹽酸中浸泡 24 小時，之后清洗干凈烘干完后可放入 95%酒精中保存。6. 顯微鏡的使用要注意：持鏡時必須是右手握臂、左手托座的姿勢，不可單手提取，以免零件脫落或碰撞到其它地方。輕拿輕放，不可

16、把顯微鏡放置在實驗臺的邊緣，以免碰翻落地。7. 使用完畢后，必須復原才能放回鏡箱內(nèi)，其步驟是：取下標本片，轉(zhuǎn)動旋轉(zhuǎn)器使鏡頭離開通光孔，下降鏡臺，平放反光鏡，下降集光器(但不要接觸反光鏡)、關(guān)閉光圈，推片器回位，蓋上綢布和外罩，放回實驗臺柜內(nèi)。最后填寫使用登記表。8、 附錄1. 試劑配制方法Unna試劑：A液：吡羅紅甲基綠粉1g加入蒸餾水溶解至100ml，置于棕色瓶中備用B液：乙酸鈉16.4g加入蒸餾水溶解至1000ml。取乙酸12ml加入蒸餾水稀釋至1000ml。取稀釋的乙酸鈉溶液30ml和乙酸20ml，加蒸餾水50ml，配成pH為4.8的溶液。取A液20ml、B液80ml,混合配成，現(xiàn)配現(xiàn)用

17、。8%鹽酸：取 18.8ml 的濃鹽酸（36%38%）加到蒸餾水中，蒸餾水定容到100ml。0.9%的氯化鈉溶液：用電子天平稱量 0.9g 氯化鈉，加少量蒸餾水溶解，蒸餾水定容到 100ml。2. 重要儀器的使用方法普通光學顯微鏡使用 用前的準備工作 a) 打開鏡箱，右手握住鏡臂，左手托住鏡座，小心地把顯微鏡從鏡箱內(nèi)取出，輕輕地放在實驗桌上。 b) 檢查顯微鏡的各部件是否完整和正常，如發(fā)現(xiàn)有部件損壞或出現(xiàn)故障，應立即停止使用，待排除故障或修復后，才能繼續(xù)操作。 低倍鏡的使用 a) 準備：將顯微鏡放于前方略偏左側(cè)，必要時使鏡簡傾斜（有的顯微鏡本身已經(jīng)傾斜）以便觀察。轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋，將鏡筒略升高(或?qū)⑤d物臺下降)使物鏡與載物臺距離拉開。以免物鏡與載物臺相碰。然后旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器，將低倍鏡對準載物臺中央的通光孔(可聽到“咔嗒”聲)。 b) 對光：打開光圈，上升聚光器，雙眼同時睜開，雙眼向目鏡內(nèi)觀察，雙手并用，左手調(diào)焦，右手移片或繪圖記錄，同時調(diào)節(jié)反光鏡的方向，使視野內(nèi)的光線均勻，亮度適中。 c)放標本片：標本片的蓋片朝上，將標本片放到載物臺前方，然后推到物鏡下面，用壓片夾壓住，如有標本移動器，可用上面的彈簧夾夾住標本片，然后把要觀察