熒光原位雜交FISH實(shí)驗(yàn)步驟與方法

1、FISH實(shí)驗(yàn)步驟一、實(shí)驗(yàn)儀器：熒光顯微鏡:高速離心機(jī)：可達(dá)12000r/min高壓滅菌鍋：160以上殺菌恒溫箱：為雜交提供恒定溫度恒溫水浴鍋照相機(jī)（與熒光顯微鏡配套）：熒光捕捉圖片二、試劑的配制：1、0.2mol/ L (pH7.4磷酸緩沖溶液(PB試劑為NaH2P04·2H20和Na2HP04·12H2O。-02M的NaH2P04溶液: 31.2g NaH2P04·2H20,加蒸餾水1000mL溶解-02M的Na2HP04溶液: 71.632g Na2HP04·12H2O 加蒸餾水至1000ml溶解-02M (pH7.4磷酸緩沖溶液(PB : 19ml

2、的NaH2P04溶液和81ml的Na2HP04溶液充分混合高壓滅菌，常溫保存。2、0.03 mol/ L磷酸鹽緩沖溶液（(PBS）試劑為NaCl和磷酸緩沖溶液PB-0.03MPBS溶液：22.8gNaCl ，150ml磷酸緩沖溶液(PB ，加蒸餾水至1000ml，混勻-0.02 MPBS溶液：取100ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至150ml-0.01 MPBS溶液：取50ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至150ml高壓滅菌，常溫保存。3、4%多聚甲醛溶液（1000ml）（在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行操作）-將略小于2/3體積的水（660ml）加熱到

3、50，-40g多聚甲醛PFA，邊攪拌邊加入到水中，繼續(xù)保持60-1滴2mol/LNaOH溶液，立即澄清，但仍有小顆粒。-1/3體積的PBS溶液，-用Hcl將pH調(diào)至7.2，定容，-用孔徑為0.22m的濾膜過濾，-4保存最多保存兩天，或者取少量保存在-20。（加熱時(shí)溫度不宜過高，為60-65，否則PFA容易降解，配置好后應(yīng)盡快使用，否則固定效果較差）。4、1mol/L(pH8.0Tris-HCl緩沖液的配置-121.1g Tris(三羥基氨基甲烷, 加800mL蒸餾水溶解，加入大約42mL的濃HCl-用1M的HCl或lM的NaOH將pH調(diào)至8.0，最后加蒸餾水至1000Ml高壓滅菌，4冰箱保存。

4、5、10%SDS-10g SDS（十二烷基硫酸鈉）于50ml滅菌水中，加水至100ml，分裝后室溫保存。滅菌，或用濾膜過濾稱取SDS時(shí)需戴口罩！6、0.5M EDTA（pH8.0）溶液的配置- 186.1g乙二胺四乙酸二鈉 加800mL蒸餾水溶解，劇烈攪拌(最好使用磁力攪拌機(jī)-用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH至8.0，然后定容至1000mL。7、雜交緩沖液配置2ml雜交緩沖液于2ml離心管中，各試劑的加入順序：360L 5M NaCl；40L 1MTrisHClxL 100甲酰胺（見下表）yL 無菌水（見下表）2L 10SDS0.22m孔徑的濾膜過濾，4保存。表1 配置不同甲酰胺雜交液中甲酰胺和無菌水

5、的體積甲酰胺濃度（%）甲酰胺體積x（L）無菌水體積y（L）0015985100149810200139815300129820400119825500109830600998357008984080079845900698501000598551100498（甲酰胺有劇毒，操作時(shí)需戴手套，在通風(fēng)處內(nèi)進(jìn)行，廢液需要回收）不同甲酰胺雜交液的配制甲酰胺濃度（%）5M NaCl溶液（mL）1M Tris-HCl(mL10% SDS(mL甲酰胺體積x（mL）無菌水體積y（mL）207280.480239.6357280.4140179.6407280.4160159.6557280.422099.68、

6、雜交后洗滌液的配置配制50mL雜交洗滌液于50mL離心管中，各試劑加入的順序如下：Z L 5M NaCl1mL 1MTris-HCl(pH7.6無菌水加至50mL50L 10SDS500L EDTA表2 根據(jù)雜交緩沖液中甲酰胺濃度而定的探針清洗液液中NaCl體積數(shù)甲酰胺濃度%NaCl體積z（L）NaCl最終濃度（mM）090009005640064010460046015328032820225022525159015930112011235800804056056454004050280285520020不同甲酰胺對應(yīng)的洗滌液的配制甲酰胺濃度（%）1M Tris-HCl(mL10% SDS(

7、mL0.5M EDTA（mL）5M NaCl溶液（mL）無菌水體積（mL）2080.4418369.63580.446.4381.24080.444.48383.125580.441.63869、4',6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI 常備：1 mg µl-1 需要稀釋為：1 µg µl-1滅菌儲存在-20 (用鋁箔覆蓋管子DAPI可誘變致癌，所以在使用時(shí)要戴手套并且收集廢液，包括早使用移液管時(shí)。為了避免使用時(shí)對溶液造成污染，所有的溶液應(yīng)取出置于50ml管中，夠每天使用的量。三、實(shí)驗(yàn)步驟：1、玻片的

8、預(yù)處理：（1）玻片預(yù)處理1）玻片清洗：載玻片與蓋玻片用熱肥皂水刷洗干凈，在實(shí)驗(yàn)室可用超聲清洗代替刷洗（45次 每次10 min），然后用清水浸泡過夜；2）硅化處理：第二天換用1%的鹽酸浸泡24小時(shí)，然后用蒸餾水清洗干凈后放入高壓滅菌鍋滅菌，60°C烘干。蓋玻片用錫紙包好4°C保存?zhèn)溆谩＃ㄉw玻片干凈即可，不用處理）(2黏附劑涂片制備載玻片放入APES與丙酮的1:50溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）中約1min，取出用高壓滅菌處理過的蒸餾水清洗后于室溫下干燥（也可放入烘箱里25°C烘干），然后置4保存?zhèn)溆?、熒光探針的選擇和標(biāo)記（見fish探針的選擇表）3、樣品的制備與固定（1）用已

9、滅菌的聚乙烯取樣管取反應(yīng)器內(nèi)泥水混合液1mL，加適量滅菌蒸餾水振蕩混勻，并用超聲波處理使細(xì)菌分散。取處理后的懸濁液約 0.5ml進(jìn)行后續(xù)處理。（2）將懸濁液混合均勻后，按1:1加入4%多聚甲醛，于4固定24小時(shí)，（3）然后置于12000r/min離心5min去除固定劑，將固定樣本加入1ml 0.0lmol/L PBS以10000r/min的速度離心漂洗兩次，棄去上清液。（4）采用PBS與乙醇的1:1溶液稀釋定容至1ml于20保存?zhèn)溆?、樣品的預(yù)處理（1）用微型振蕩器將樣品混合均勻，取10l樣品在載玻片上涂抹20mm×20mm大小（不要太大），37的烘箱熱固定2h，最高溫度不超過60（

10、2）風(fēng)干后于50、80、95的乙醇中各脫水3min，自然風(fēng)干。（脫水：準(zhǔn)備三個(gè)瓷盤，然后將載玻片取出依次放入瓷盤中，用50%乙醇淹沒載玻片，脫水3min，取出放入第二、三個(gè)瓷盤，然后用80%乙醇脫水，96%乙醇脫水。脫水后的80%、96%乙醇回收。）脫水后的玻片可以在室溫下保存幾個(gè)月，可在-20的條件下保存幾個(gè)月5、原位雜交探針濃度為50ng/L，在密閉的雜交盒內(nèi)鋪滿吸水紙（經(jīng)高壓滅菌烘干），用雜交液濕潤，使雜交環(huán)境保持一定的濕度。用移液槍分別取24L的雜交液和1L探針滴入帶有樣品的載玻片上（均勻覆蓋涂片面積），（加蓋硅化蓋玻片，不用）放入雜交盒內(nèi)進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交溫度與雜交時(shí)間如下。所有有關(guān)

11、探針的操作在處理時(shí)都應(yīng)避光處理！探針種類溫度（）時(shí)間（h）甲酰胺濃度%備注EUB MIX46520同步染色法AOB MIX 46355重復(fù)染色法NOB MIX 46540重復(fù)染色法GAO MIX462.530同步染色法HGC69a462.530同步染色法PAO651462.530同步染色法6、雜交后洗滌從恒溫箱中取出玻片之前將盛有清洗液的容器放入到48的水浴中預(yù)熱20分鐘。雜交完成后取出玻片，立即放入到預(yù)熱好的容器中。注意不能讓玻片干燥，不然將很難洗去非特異性結(jié)合的信號，增加背景染色。清洗液的量應(yīng)當(dāng)淹沒玻片，清洗1520分鐘后取出，用清水洗去剩余的清洗液，然后室溫下晾干。7、DAPI染色每個(gè)玻

12、片用10L DAPI（用甲醇稀釋至1g/L）滴加到載玻片樣品上，在冰上染色10min，用水沖洗多次，室溫下自然晾干，鏡檢前加蓋蓋玻片。8、熒光顯微鏡觀察經(jīng)過以上處理的樣品，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。探針目標(biāo)菌群探針序列甲酰胺濃度修飾EUB338Domain BacteriaGCTGCCTCCCGTAGGAGT20%HEXNSO190Ammonia-oxidizing bacteriaCGATCCCCTGCTTTTCTCC55%HEXNIT3Nitrite-oxidizing bacteriaCCTGTGCTCCATGCTCCG40%FITCcNIT3bCCTGTGCTCCAGGCTCCGGAOQ9

13、89CompetibacterTTCCCCGGATGTCAAGGC35%Cy5TMHGC69aActinobacteriaTATAGTTACCACCGCCGT25%FITCPAO651AccumulibacterCCCTCTGCCAAACTCCAG35%Cy3TMDenitrifierCGGGAGGCAGCAGT35%FAM注：a探針濃度均為50ng/L；bcNIT3為硝酸菌探針NIT3的競爭探針。Abbreviationmaximum absorptionMaximum emissionFilter setFITC（綠色）492nm528nm10(Zeiss DAPI（藍(lán)色）365 nm418 nm02(ZeissCY3（橙色/紅色）554 nm570 nm15(ZeissCY5（紅外線檢測） 650 nm667 nm26(Zeiss HEX探針的選用選用EUB MIX(EUB338、EUB338、EUB338來檢測活性污泥中的全部的細(xì)菌。選用PAOMIX來檢測活性污泥中的聚磷菌，選用AOB MIX NOBMIX來檢測活性污泥中的硝化菌。選用GAOMIX探針來檢測活性污泥中的聚糖菌，選用HGC69a探針來檢測反硝化聚磷菌的優(yōu)勢菌種Actinobacteria，用PAO651來檢測優(yōu)勢菌種Rhodocyclus，雜交后用4¢