天花粉蛋白對荷瘤小鼠抑瘤作用的實驗研究

1、天花粉蛋白對荷瘤小鼠抑瘤作用的實驗研究                           作者：張艷瓊， 黃利鳴， 吳江鋒【摘要】  目的通過建立荷U14小鼠宮頸癌模型，從個體水平初步探索天花粉蛋白（TCS）對荷瘤小鼠體內抗腫瘤活性。方法建立荷U14小鼠宮頸癌模型，TCS治療，檢測抑瘤率、脾指數(shù)、流式細胞術分析T細胞亞群。結果

2、TCS治療組，脾指數(shù)明顯高于陰性對照組，C較陰性對照組、CTX組明顯減少（P<0.05）；與正常組比較無顯著性差異。TCS組的C/C較陰性對照組、正常組明顯增大（P<0.05）；與CTX組比較無顯著性差異。結論在體內，當TCS的劑量為0.2 mg/kg時，具有一定的免疫調節(jié)和增強體液免疫功能作用。 【關鍵詞】  天花粉蛋白 荷瘤鼠 抑瘤作用Abstract：Objective To study the anti-tumor effect of trichosanthin(TCS) in U14 mice.MethodsAfter setting up the animal

3、 model of U14, the subset of the T cells was analyzed by the tumor inhibitory rate, the index of spleen and FCM. ResultsAfter treatment with TCS, the index of spleen was increased obviously compared with the negative group, the C decreased obviously compared with the negative and CTX groups（P<0.0

4、5）, but had no significant difference as compared with the normal group. The C/C in TCS group was increased obviously compared with the negative and normal groups（P<0.05）, but had no siguificant difference as compared with the CTX group.ConclusionThe TCS can regulate immunity and increase the hum

5、oral immunity in vivo when its dose is 0.2 mg/kg.Key words：Trichosanthin;  Mice with tumor;  Effect of tumor- inhibition    人子宮頸癌是導致婦女死亡的一種常見惡性腫瘤。天花粉蛋白（trichosanthin，TCS)是從葫蘆科植物栝樓trichosanthin kirilouii Maxim的塊根中提取的一種單鏈核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP)。體外大量實驗證實其具有抗宮

6、頸癌的作用1，2，為進一步證實TCS是否具有體內抗宮頸癌和調節(jié)機體免疫的活性，我們進行了TCS對荷小鼠宮頸磷癌U14裸鼠體內實驗研究。1  材料1.1  材料TCS購自上海金山制藥廠（1.2mg/ml）；環(huán)磷酰胺購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司； RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibcol公司；PE標記C抗體購自eBioscience公司；FITC標記C抗體購自eBioscience 公司；倒置顯微鏡和多功能顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)購自德國Leica公司；EPICSXL-4型流式細胞儀購自Beckman coulter公司。U14腫瘤細胞株由三峽大學醫(yī)學院免疫重點實驗室提供。1.2&

7、#160; 動物68周齡近交系Balb/c小鼠32只，體質量1820 g，雌性，購自武漢大學實驗動物中心。2  方法2.1  TCS對實體瘤的抑制作用復蘇U14細胞株，昆明小鼠腹腔中反復傳代，第3代后57 d，取小鼠腹水，用無菌生理鹽水調整細胞濃度為2×107/ml。常規(guī)消毒后，取0.2 ml細胞懸液接種于Balb/c小鼠右側腋窩皮下。接種后的小鼠隨機分3組：TCS實驗組、陰性和陽性對照組，每組8只。TCS實驗組：用生理鹽水稀釋TCS注射液，藥物濃度為0.2 mg/kg，0.2 ml/只，給藥1次/d，連續(xù)給藥10次。陽性對照組：環(huán)磷酰胺（cytoxan, CTX

8、），30 mg/kg。陰性對照組給予等體積的生理鹽水。另設正常組8只，不進行任何處理。2.2  組織取材和稱重第11天稱小鼠體質量。眼球取血，置于加有抗凝劑的試管內。處死小鼠，取出腫瘤組織、脾臟，稱瘤重、脾重，計算抑瘤率(inhibition rate, IR)。計算脾指數(shù)，公式為：脾指數(shù)(SI)=脾臟重量(S)/體質量(W)(g/g)。2.3  流式細胞術分析T細胞亞群將血液中分別加入PE標記的C、FITC標記的C單克隆抗體各20 l，混勻，于室溫下避光作用1530 min。每個試管內加入溶血劑2 ml，顛倒混勻后放暗處10 min，離心，用PBS洗1次，加1%甲醛PBS

9、液0.6 ml，固定1030 min，經流式細胞儀檢測每管中C，C細胞百分比。2.4  統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據以±s表示，采用SPSS10.0軟件進行分析（t檢驗）。3  結果3.1  小鼠一般情況的觀察小鼠皮下接種U14瘤細胞5 d內外觀無明顯的變化，活潑，大小便、飲食正常；接種癌細胞57 d后可觸及皮下腫塊，成瘤率100%，生理鹽水組后期腫瘤生長迅速。3.2  TCS對荷瘤小鼠體質量、脾重和瘤重的影響結果見表1。表1  荷瘤小鼠的體質量、脾指數(shù)、瘤重和抑瘤率（略）3.3  流式細胞儀檢測T細胞亞群的結果實驗結果表明：陽性對照

10、組的C較其它各組均明顯增高，差異有顯著性（P<0.05）；陰性對照組的C較其它組均明顯減少，與TCS組有差別（P<0.05），與正常對照組比較統(tǒng)計學上無差異；TCS組的C較陰性對照組、陽性對照組明顯減少（P<0.05）；與正常組比較無顯著性差異；TCS組的C/ C較陰性對照組、正常組明顯增大（P<0.05）；與陽性對照組比較無顯著性差異；其它各組之間無顯著性差異。結果見表2。表2  天花粉蛋白對荷瘤小鼠T細胞的影響（略）4  討論    TCS具有廣泛地抗腫瘤作用，現(xiàn)陸續(xù)有報道TCS具有體內抗實驗性腫瘤作用。孫健等3在研

11、究TCS抑制肝癌肺轉移時，應用LCI-D20模型觀察荷瘤裸鼠肺轉移發(fā)現(xiàn)TCS組肺轉移率為41.7%(5/12)，而對照組高達100%(20/20)。為了進一步提高TCS的療效，靶向治療受到重視，將重組免疫毒素 EGF-TCS 重組蛋白用于荷人肝癌 BEL-7402裸鼠體內的實驗研究，可以有效地抑制實體瘤的生長4。眾多體外實驗也證實，TCS能引起多種宮頸癌細胞株凋亡1，2。而對其是否具有體內抑制宮頸癌生長的作用，尚未見報道。為了證實其療效，我們通過建立荷U14小鼠動物模型，檢測了TCS的體內抗宮頸癌效果。小鼠子宮頸鱗癌U14是應用專用線結經甲基膽蒽浸泡后, 穿進幼鼠宮頸誘發(fā)成瘤后，移植于遠交系K

12、M小鼠皮下形成的一個異位子宮頸癌, 能在小鼠皮下形成實體瘤(成瘤率達100%)，因此建立 U14動物模型是研究宮頸癌的理想模型5。我們的研究表明TCS的抑瘤率是11.2%，采用重組免疫毒素EGF-TCS進行靶向治療是否可以進一步提高抑瘤率值得進一步探討。    TCS通過不同途徑影響機體的細胞免疫和體液免疫。TCS可使正常人外周血C和CD+20T細胞百分比升高, CT細胞百分比下降, 從而使C/C比值增大6。TCS能誘導Th2細胞中IL-4和IL-10的表達，但抑制Th1細胞中IL-2和IFN-gamma的表達7。我們初步探索了劑量為0.2 mg/kg的TCS在機

13、體免疫應答中的作用，TCS可以引起小鼠外周血中C細胞顯著增加, C明顯減少，C/ C比值升高，該結果與TCS對人體外周血的影響吻合6，因此，TCS具有一定的免疫調節(jié)和增強體液免疫功能的作用?！緟⒖嘉墨I】  1Wang P, Yan H, Li JC.CREB-mediated Bcl-2 expression in trichosanthin-induced Hela cell apoptosisJ.Biochem Biophys Res Commun,2007, 363(1):101.2王艷華，黃利鳴.OPCML、DAPK基因甲基化與宮頸癌CasKi細胞凋亡相關性的研究J.中國藥理

14、學通報，2008，24 (4) : 543.3孫健，吳志全，薛瓊,等.天花粉蛋白抑制肝細胞癌肺轉移的實驗研究J.中華肝膽外科雜志，2005，11（4）：253.4楊海文, 李詠梅, 羅仁.重組免疫毒素EGF-TCS對荷瘤小鼠抗腫瘤效果的實驗研究J.南方醫(yī)科大學學報，2007，27(10)：1535.5李秀真, 朱萬孚, 曹卉，等.乳酸桿菌誘導小鼠宮頸鱗癌U14細胞凋亡的動物實驗J.中華微生物學學和免疫學雜志，2004，24（4）：268.6周廣宇, 畢黎琦, 高申,等.天花粉蛋白對淋巴細胞亞群的免疫調節(jié)作用J.吉林大學學報( 醫(yī)學版)，2003，29（3）：289.7Zhou X, Yang N, Lu L, et al. Up-regulation of IL-10 expr