低能量紅激光局部照射預(yù)防血管成形術(shù)后再狹窄的實(shí)驗(yàn)研究

1、    低能量紅激光局部照射預(yù)防血管成形術(shù)后再狹窄的實(shí)驗(yàn)研究        【摘要】目的評價低能量紅激光局部照射對血管成形術(shù)后再狹窄的預(yù)防作用。方法對雄性新西蘭白兔進(jìn)行腹主動脈和髂動脈球囊拉傷（單純拉傷組50只）和拉傷后低能量密度的紅激光局部照射（激光照射組50只）。兩組分別于術(shù)后3天、1周、2周、4周和8周分批進(jìn)行血管病理形態(tài)學(xué)、氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷（3H-TDR）滲透實(shí)驗(yàn)和血管造影檢查。 結(jié)果血管拉傷后8周造影顯示，激光照射組血管最小內(nèi)徑顯著大于單純拉傷組（P<0.0

2、5）;血管狹窄程度明顯減低（P<0.05）；病理形態(tài)學(xué)分析表明，兩組血管損傷程度相同，與單純拉傷組相比，激光照射后血管內(nèi)膜增生受到顯著抑制，血管壁3H-TDR滲透量減少，外彈力膜圍繞面積增大，管腔狹窄程度明顯減輕。結(jié)論低能量紅激光局部照射可以顯著減少血管成形術(shù)后再狹窄的形成。【關(guān)鍵詞】血管成形術(shù)，氣囊，激光輔助血管內(nèi)膜血管造影術(shù) Preventive role of introvascular low power red laser illumination on restenosis after balloon angioplasty in rabbits.CHEN Jiyan,LI

3、Guang,ZHOU Yingling,et al. Guangdong Cardiovascular Institute, Guangzhou 510080【Abstract】ObjectiveTo investigate the preventive role of introvascular low power red laser illumination on restenosis after balloon angioplasty in rabbits. Methods100 New Zealand White rabbits were balloon injuried on abd

4、ominal and iliac arteries and half of which were followed by intravascular low power red laser illumination (0.9 J/cm2). At the end of 3 days, 1 weeks, 2 weeks,4 weeks and 8 weeks after injury, the animals were killed in groups. Abdominal and iliac arteries were excised for histomorphometrical, immu

5、nohistochemical and 3H-TDR incorporation studies. Before killed, the last group of rabbits would receive arterial angiography. ResultsCompared with the rabbits received simple injury, the rate of neointimal proliferation and vascular stenosis in rabbits received laser illumination were suppressed an

6、d the arterial remodelings were improved significantly. ConclusionIt showed that intravascular low power red laser illumination could prevent arterial restenosis after balloon injury. 【Key words】angioplasty,balloon,laser-assistedtunica intimaangiography經(jīng)皮球囊冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)（PTCA）是冠心病主要的治療方法之一，但由于術(shù)后較高的再狹窄率（3

7、0%50%）影響了它的長期臨床效果。再狹窄的機(jī)制是多方面的，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞的剝離和修復(fù)障礙對再狹窄的發(fā)生起著重要作用1,2。低能量紅激光照射具有一種非熱效應(yīng)的生物刺激作用，可以促進(jìn)細(xì)胞的增生和組織的修復(fù)3。本研究旨在通過在體的動物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步評價低能量紅激光局部照射對血管成形術(shù)后再狹窄的預(yù)防作用。材料與方法一、 材料1.實(shí)驗(yàn)動物：雄性新西蘭白兔100只，體重2.53.0kg。按照完全隨機(jī)的方法分為單純球囊拉傷組（簡稱單純拉傷組）和球囊拉傷加紅激光照射組（簡稱激光照射組）各50只。每組按照取材時間再隨機(jī)分成5個亞組，每個亞組10只。2.實(shí)驗(yàn)器械：(1)普通球囊導(dǎo)管和附件： 美國Medtroni

8、c 4.0 mm×10 mm、3.0 mm×10 mm球囊、ACS Hi-Torque 0.014英?×190 cm導(dǎo)絲、4F普通右心導(dǎo)管、ACS壓力泵。(2)激光球囊： 采用帶有200 m光纖和頭端可以同軸輻射樣發(fā)射激光的球囊導(dǎo)管（大小3.0 mm×20 mm）和激光發(fā)生器（氦-氖He-Ne激光，波長632 nm，輸出功率10 mW），均為美國Globle Therapeutic公司生產(chǎn)。二、方法1. 單純拉傷組：氯胺酮2030 mg/kg加氯丙嗪1020 mg/kg肌肉注射麻醉動物。采用右股動脈切開，逆行插入PTCA導(dǎo)絲和球囊導(dǎo)管（4.0 mm

9、15;10 mm），插入深度為12 cm，使球囊位于腹主動脈內(nèi)，同時通過耳緣靜脈注入肝素150 IU/kg。通過壓力泵向球囊內(nèi)注入肝素生理鹽水，維持壓力8 atm并緩慢回拉球囊導(dǎo)管10 mm，拉傷血管后，抽出球囊內(nèi)液體，使壓力為零。重復(fù)上述拉傷過程2次。退出球囊導(dǎo)管，重新插入3.0 mm×10 mm球囊，插入深度5 cm，使球囊位于髂動脈內(nèi)，重復(fù)上述拉傷過程3次。退出球囊導(dǎo)管，結(jié)扎股動脈并縫合傷口，通過耳緣靜脈推注青霉素80萬單位預(yù)防感染。術(shù)后繼續(xù)高脂喂養(yǎng)作為對照組。2.激光照射組：按照上述方法拉傷血管后插入激光球囊導(dǎo)管（3.0 mm×20 mm），插入深度同前，使球囊位于

10、腹主動脈拉傷處。通過壓力泵向球囊內(nèi)注入肝素鹽水，維持壓力4 atm，開通激光，輸出功率10 mW，持續(xù)照射60秒后，抽空球囊，關(guān)閉激光。1分鐘后重復(fù)上述照射過程2次，每次間隔1分鐘。后撤激光球囊7 cm，使球囊位于髂動脈拉傷處，重復(fù)上述照射過程3次，每次間隔1分鐘，球囊內(nèi)壓力改為2 atm。3. 血管造影：血管拉傷后8周，兩組各10只兔進(jìn)行髂動脈造影。經(jīng)左頸總動脈插入4F普通右心導(dǎo)管到腹主動脈上端，應(yīng)用Philip 3000雙球管造影機(jī)，導(dǎo)管內(nèi)推注38%的泛影葡胺1015 ml進(jìn)行髂動脈造影檢查。采用造影機(jī)自帶軟件測定髂動脈拉傷處管腔最小內(nèi)徑、拉傷處近端鄰近正常血管腔內(nèi)徑和狹窄程度（與鄰近正常

11、血管相比）。4.病理形態(tài)學(xué)檢查:兩組分別于血管拉傷后3天及1、2、4和8周進(jìn)行腹主動脈病理形態(tài)學(xué)檢查，每組每時間段各10只。動物麻醉后行腹腔切開，分離從腹主動脈上端至股動脈切開處。從腹主動脈拉傷處下3 cm順行插入導(dǎo)管并結(jié)扎腹主動脈于導(dǎo)管上，同時處死動物。結(jié)扎除髂動脈以外的所有腹主動脈分支。以80100 mm Hg (1 mmHg=0.133 kPa)灌注肝素生理鹽水，股動脈遠(yuǎn)端插管引流，沖洗掉管腔內(nèi)血液，再用10%甲醛溶液按同樣壓力灌注30分鐘，原位固定血管4，確保拉傷血管保持原有在體時的形態(tài)，防止取材和病理標(biāo)本制作造成血管的變形，以便于進(jìn)行血管形態(tài)學(xué)的分析。原位固定后，按插入深度取髂動脈拉

12、傷血管20 mm及相鄰正常血管10 mm于10%甲醛溶液中進(jìn)一步固定。石蠟包埋后每隔23 mm進(jìn)行切片，切片厚度4 m，分別進(jìn)行HE染色、彈力纖維染色和平滑肌細(xì)胞-肌鈣蛋白單克隆抗體染色后，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡和計(jì)算機(jī)像分析系統(tǒng)（Knotron IBAS 2.0）測定內(nèi)膜加中膜面積、管腔面積和外彈力板圍繞面積（包括管腔、內(nèi)膜和中膜），并計(jì)算血管狹窄程度（與鄰近正常血管相比）。血管損傷程度參考Schneider5方法進(jìn)行評分。5. 氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷(3H-TDR)滲透實(shí)驗(yàn)：在灌注甲醛溶液進(jìn)行原位固定前，在無菌條件下按照插入深度，截取腹主動脈拉傷血管20 mm及其上端鄰近正常血管10 mm，分別縱行剖

13、開制成組織片，加入2.0 ml的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37溫箱內(nèi)通95%O2+5%CO2溫育24小時后，加入1微居里3H-TDR，繼續(xù)溫育24小時后，取出用磷酸鹽緩沖液（酸堿度7.2）沖洗3次，吸干稱重。以高氯酸和雙氧水各0.5 ml在80溫箱中溫育60分鐘消化后，加入5 ml閃爍液并用無水酒精調(diào)到平衡。用液閃記數(shù)儀（瑞典LKB1209 RACKBETA）測定3H-TDR放射活性，計(jì)算每毫克血管組織中的3H-TDR摻入量。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理兩組之間的數(shù)據(jù)（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）分析采用成組t檢驗(yàn)和方差分析，P值以小于0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.血管造影定量分析：髂動脈造影結(jié)果見表1

14、。鄰近正常血管內(nèi)徑兩組間差異無顯著性。單純拉傷組血管最小內(nèi)徑明顯小于激光照射組；與鄰近正常血管相比，狹窄程度兩組間存在顯著差異(P<0.05)。表1兩組白兔(各10只)血管拉傷后8周造影結(jié)果（±s）項(xiàng)目單純拉傷組激光照射組P值參照內(nèi)徑（mm）1.52±0.331.48±0.26>0.05最小內(nèi)徑（cm）0.57±0.161.32±0.29<0.01狹窄程度(%)64.31±6.3711.75±4.82<0.012.病理形態(tài)學(xué)分析：病理形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果見表2。 兩組血管損傷程度相似;鄰近正常血管的管腔面積

15、相同。拉傷后3天，單純拉傷組血管管腔面積和外彈力板圍繞面積明顯低于激光照射組，管腔狹窄程度顯著高于激光照射組；內(nèi)膜加中膜面積從第2周開始兩組顯示明顯差異。表2各組白兔(每組10只)各時間段的病理形態(tài)學(xué)結(jié)果（±s）項(xiàng)目3天1周2周4周8周單純拉傷組激光照射組單純拉傷組激光照射組單純拉傷組激光照射組單純拉傷組激光照射組單純拉傷組激光照射組正常管腔面積(mm2)1.43±0.371.41±0.421.40±0.291.43±0.331.42±0.271.42±0.361.39±0.301.40±0.281.43

16、±0.371.42±0.26管腔面積(mm2)0.98±0.231.28±0.271.06±0.271.32±0.261.25±0.341.33±0.390.73±0.241.30±0.320.32±0.131.28±0.21管腔狹窄程度(%)38.75±6.428.67±1.7524.57±5.147.49±2.3611.28±2.436.08±1.5449.29±5.427.26±2.1376

17、.53±9.629.64±3.88內(nèi)膜+中膜面積(mm2)0.42±0.140.41±0.200.49±0.190.48±0.230.72±0.340.54±0.270.95±0.480.62±0.251.25±0.450.76±0.37正常外彈力板圍繞面積(mm2)1.82±0.261.83±0.321.81±0.351.82±0.301.78±0.261.82±0.331.79±0.241.83

18、7;0.321.82±0.221.81±0.27外彈力板圍繞面積(mm2)1.40±0.281.69±0.361.55±0.421.80±0.401.97±0.391.87±0.311.68±0.381.92±0.411.57±0.442.14±0.393. 3 H-TDR滲透實(shí)驗(yàn)結(jié)果:術(shù)后3天的3H-TDR摻入量增加值（拉傷血管3H-TDR摻入量-正常血管3H-TDR摻入量）兩組差異無顯著性。從第1周開始單純拉傷組血管壁3H-TDR摻入量增加值顯著高于激光照射組，并持續(xù)到術(shù)

19、后4周。術(shù)后8周兩組間3H-TDR摻入量增加值恢復(fù)到相似,并接近正常血管的水平（表3）。 表33H-TDR（cmp/mg）滲透實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）時間兔數(shù)(只)單純拉傷組激光照射組P值3天10707.44±91.57686.31±81.53>0.051周10609.62±78.48315.63±88.72<0.052周10368.27±53.46137.52±41.88<0.054周10106.38±67.2924.76±62.54<0.058周1026.23±71.8523

20、.64±60.17>0.05討論低能量激光照射具有一種非熱效應(yīng)的生物刺激作用。這種生物刺激作用的具體機(jī)制尚不清楚。細(xì)胞和分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，低能量激光照射可能影響線粒體氧化呼吸鏈中的電子傳遞，促進(jìn)氧化磷酸化，改變細(xì)胞的生物活性6。低能量密度照射時，可促進(jìn)組織的生長和修復(fù)，過高密度照射時，則可產(chǎn)生大量的自由基，對細(xì)胞和組織產(chǎn)生殺傷和抑制作用。因此，低能量激光照射的生物學(xué)效應(yīng)具有雙重性。另外，低能量激光照射首先要通過細(xì)胞膜7，引起細(xì)胞膜上某些離子通道和跨膜蛋白如整合蛋白等的構(gòu)形和功能發(fā)生改變，激活細(xì)胞內(nèi)多種信息傳遞，最終可影響DNA的表達(dá)和復(fù)制。以往，低能量激光照射主要用于促進(jìn)創(chuàng)傷

21、后的組織修復(fù)2。后來Kipshidze等8應(yīng)用不同能量密度的低能量紅激光照射離體培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，當(dāng)照射的能量密度在1.0 J/cm2以下時，血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性增強(qiáng)，生長和增殖加快，對血管平滑肌細(xì)胞的活性則無任何的直接作用。增加照射的能量密度，首先表現(xiàn)出血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性受到抑制；說明血管內(nèi)皮細(xì)胞與血管平滑肌細(xì)胞相比，對低能量紅激光照射更敏感。進(jìn)一步的研究表明，低能量密度的紅激光照射可以顯著的提高內(nèi)皮細(xì)胞的粘附能力，這對于內(nèi)皮細(xì)胞的增生是至關(guān)重要的9。在以上研究的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行了血管損傷后局部低能量密度的紅激光照射（0.9 J/cm2）的在體動物實(shí)驗(yàn)。8周后病理組織學(xué)檢查和

22、血管造影結(jié)果顯示,激光照射組血管狹窄程度明顯低于單純拉傷組。兩組間內(nèi)膜加中膜面積同樣存在著顯著的差別。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，血管拉傷后第3天,單純拉傷組管腔面積縮小了38.75%，而激光照射組管腔面積只減少8.67%，兩組間存在顯著的差異。但是此時內(nèi)膜加中膜面積兩組間相似，并且與鄰近正常血管壁相比，并沒有明顯的增厚。相反整個外彈力板圍繞面積與管腔面積減小的幅度相似。表明血管拉傷后第1周血管舒張發(fā)生障礙，而低能量紅激光照射對這種回縮起到了抑制作用。在以后的1、2、4和8周的病理組織學(xué)檢測顯示,單純拉傷組血管內(nèi)膜加中膜面積進(jìn)行性增大，管腔面積先增大后進(jìn)行性減小，外彈力板圍繞面積第1周時與3天時相比增大

23、，第2周時達(dá)到最大，后進(jìn)行性減小，血管呈現(xiàn)出一種重塑現(xiàn)象。激光照射組同樣出現(xiàn)血管內(nèi)膜加中膜面積逐漸增厚，但是管腔面積卻無顯著的變化。更重要的是激光照射后血管外彈力板圍繞面積從第1周開始，與第3天相比卻呈現(xiàn)出一種逐漸擴(kuò)大的趨勢，在第8周時已顯著大于正常血管外彈力膜圍繞面積。因此我們認(rèn)為,血管損傷后給予低能量紅激光照射改善了血管重塑的形成。低能量密度的紅激光照射減少血管損傷后狹窄發(fā)生的機(jī)制尚不明確。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，第3天紅激光照射組血管的回縮受到抑制，而此時內(nèi)皮細(xì)胞尚未能得到足夠的修復(fù)，因此這種抑制作用與內(nèi)皮依賴性的舒張無關(guān)?？赡苁堑湍芰考す庹丈鋵ρ芷交〖?xì)胞起到了直接舒張作用、抑制了血管損

24、傷后的反應(yīng)10。從第2周開始，與單純拉傷組相比，紅激光照射組血管內(nèi)膜的增生受到了明顯抑制，血管壁平滑肌細(xì)胞-肌鈣蛋白單克隆抗體染色顯示，增生的內(nèi)膜主要的細(xì)胞成分是血管平滑肌細(xì)胞;而3H-TDR滲透實(shí)驗(yàn)表明，紅激光照射后1周，血管平滑肌細(xì)胞的增殖顯著減少，而中膜血管平滑肌細(xì)胞的壞死程度與單純拉傷組相似。表明以能量密度為0.9 J/cm2的紅激光局部照射對血管平滑肌細(xì)胞沒有直接的殺傷作用。根據(jù)以往的研究結(jié)果，低能量紅激光照射可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的再生和修復(fù)。PTCA術(shù)后內(nèi)皮細(xì)胞的剝脫、修復(fù)障礙和功能不良對再狹窄的發(fā)生起著重要的作用。而PTCA術(shù)后內(nèi)皮細(xì)胞的剝脫很少是完全性的，往往存在著島狀的內(nèi)皮細(xì)胞。

25、因此，血管損傷后應(yīng)用低能量密度的紅激光照射可能會通過促進(jìn)殘存的和損傷周邊的內(nèi)皮細(xì)胞的再生和功能修復(fù)，抑制血管平滑肌細(xì)胞的遷移、增生以及病理性重塑，來減少狹窄的發(fā)生。其具體的作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步的研究來明確。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在球囊拉傷術(shù)后給予低能量的紅激光局部照射可以通過抑制血管平滑肌細(xì)胞的增生，改善血管重塑的形成，減少再狹窄的發(fā)生。其對血管壁作用的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究和探討。作者單位：510080 廣州，廣東省心血管疾病研究所參考文獻(xiàn)1Scott BT, Vanhoutt PM. The endothelium as a regulator of vascular smooth m

26、uscle proliferation. Circulation,1993,87(Suppl ):51-55.2Luscher TF. 1993 Mack Forster Award Lecture. Review. The endothelium as a target and mediator of cardiovascular disease. Eur J Clin Invest,1993,23:670-685.3Lyons RF, Abergel RP, White RA, et al. Biostimulation of wound healing in vivo by He-Ne

27、laser. Ann Plastic Surgery,1987,18:47-50.4Haudenschild C, Baumgartner HR, Studer A. Significance of fixation procedure for preservation of arteries. Experientia,1972,28:828-831.5Schneider JE, Berk BC, Gravanis MB, et al. Probucol decreases neointimal formation in a swine model of coronary artery balloon injury: a possible role for antioxidants in restenosis. Circulatio