微生物遺傳變異與育種——工業(yè)微生物菌種的篩選

1、微生物遺傳變異與育種微生物遺傳變異與育種 工業(yè)微生物菌種的篩選工業(yè)微生物菌種的篩選一、前言一、前言 理想工業(yè)發(fā)酵菌種具有的特征：理想工業(yè)發(fā)酵菌種具有的特征： 1.純種培養(yǎng)物；純種培養(yǎng)物； 2.遺傳性狀穩(wěn)定；遺傳性狀穩(wěn)定； 3.生長(zhǎng)速度快；生長(zhǎng)速度快； 4.能利用廉價(jià)、來(lái)源廣、成分簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基；能利用廉價(jià)、來(lái)源廣、成分簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基； 5.能忍耐不良環(huán)境因素如溫度、能忍耐不良環(huán)境因素如溫度、pH、離子強(qiáng)度、剪切、離子強(qiáng)度、剪切力等；力等； 6.快速生產(chǎn)目的產(chǎn)物，不產(chǎn)或少產(chǎn)毒性物質(zhì)或副產(chǎn)物；快速生產(chǎn)目的產(chǎn)物，不產(chǎn)或少產(chǎn)毒性物質(zhì)或副產(chǎn)物；二、微生物菌種獲得的途徑二、微生物菌種獲得的途徑 微生物的自然分

2、布微生物的自然分布 土壤土壤 空氣空氣 水水 動(dòng)植物體動(dòng)植物體 各種極端環(huán)境各種極端環(huán)境三、工業(yè)微生物的篩選三、工業(yè)微生物的篩選 （一）微生物樣品的采集（一）微生物樣品的采集 根據(jù)篩選的目的、微生物的分布情況、菌種的主根據(jù)篩選的目的、微生物的分布情況、菌種的主要特征及其生態(tài)環(huán)境等因素，確定具體的時(shí)間、環(huán)境要特征及其生態(tài)環(huán)境等因素，確定具體的時(shí)間、環(huán)境和目標(biāo)物。和目標(biāo)物。土壤采樣土壤采樣(1)采樣對(duì)象采樣對(duì)象土壤土壤 細(xì)菌和放線菌細(xì)菌和放線菌 一般園田土和耕作過(guò)的沼澤土一般園田土和耕作過(guò)的沼澤土 酵母和霉菌酵母和霉菌 富含碳水化合物的土壤和沼澤地中富含碳水化合物的土壤和沼澤地中,如一些野果生長(zhǎng)區(qū)

3、如一些野果生長(zhǎng)區(qū) 和果園內(nèi)和果園內(nèi) 采樣的對(duì)象也可以是植物、腐敗物品、某些水域等。采樣的對(duì)象也可以是植物、腐敗物品、某些水域等。土壤采樣土壤采樣(2)采樣方式采樣方式選點(diǎn)在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)，用小鏟子除去5cm表土取土取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中扎好。標(biāo)記記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，分離將樣品逐步分批寄回，及時(shí)分離。 土壤采樣土壤采樣 影響因素影響因素 （1）土層的縱剖面：）土層的縱剖面： 最好的土層是最好的土層是525cm （2）土壤的）土壤的pH： 偏堿土壤（偏堿土壤（pH 7.07.5），細(xì)菌、放線菌；），細(xì)菌、放線菌； 偏酸土壤（偏酸土壤（pH 7.0

4、以下），霉菌、酵母菌；以下），霉菌、酵母菌； （3）土壤有機(jī)質(zhì)含量和通氣狀況）土壤有機(jī)質(zhì)含量和通氣狀況 （4）表面的植被）表面的植被 （5）地理?xiàng)l件）地理?xiàng)l件 （6）季節(jié)條件）季節(jié)條件（二）富集培養(yǎng)（二）富集培養(yǎng) 定義：一類使混合微生物群體中某特定微生物比例激定義：一類使混合微生物群體中某特定微生物比例激增的培養(yǎng)方法。增的培養(yǎng)方法。 目的：提高分離效率目的：提高分離效率 控制因素：碳源、氮源、控制因素：碳源、氮源、pH、溫度、需氧量、溫度、需氧量1.1.控制培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分控制培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分 營(yíng)養(yǎng)成分：碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽類、生長(zhǎng)因子等。營(yíng)養(yǎng)成分：碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽類、生長(zhǎng)因子等。成分成分用量

5、用量K2 HPO41gMgSO47H 2O0.2gFeSO47H 2O0.05gCaCl20.02g微量元素溶液0.1ml蒸餾水1L 表1:基礎(chǔ)培養(yǎng)及成分基礎(chǔ)培養(yǎng)及成分1.1.控制培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分控制培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分 控制增值培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分控制增值培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分,特別適合分離特別適合分離水解酶類水解酶類(纖纖維素酶、淀粉酶類等維素酶、淀粉酶類等)的生產(chǎn)菌，可在富集培養(yǎng)基中以的生產(chǎn)菌，可在富集培養(yǎng)基中以相應(yīng)底物作為唯一碳源，加入含菌樣品，并給目的微相應(yīng)底物作為唯一碳源，加入含菌樣品，并給目的微生物以最佳的培養(yǎng)條件培養(yǎng)，能利用該底物的菌類得生物以最佳的培養(yǎng)條件培養(yǎng)，能利用該底物的菌類得以繁殖，

6、而其他微生物則因得不到碳源而無(wú)法生長(zhǎng)。以繁殖，而其他微生物則因得不到碳源而無(wú)法生長(zhǎng)。 但是許多的碳源、氮源可被多種多種微生物利用，不但是許多的碳源、氮源可被多種多種微生物利用，不適于用作控制條件。適于用作控制條件。2.2.控制培養(yǎng)條件控制培養(yǎng)條件 （1）pH：一般通過(guò)添加磷酸鹽緩沖液體系、碳酸鈣，：一般通過(guò)添加磷酸鹽緩沖液體系、碳酸鈣，必要時(shí)加酸、堿方式進(jìn)行調(diào)節(jié)；必要時(shí)加酸、堿方式進(jìn)行調(diào)節(jié)； （2）培養(yǎng)溫度和熱處理：耐高溫菌株，）培養(yǎng)溫度和熱處理：耐高溫菌株，5060溫度溫度培養(yǎng)；如細(xì)菌芽孢；培養(yǎng)；如細(xì)菌芽孢； （3）通風(fēng)：一般篩選的微生物都是好氧菌，有時(shí)也分）通風(fēng)：一般篩選的微生物都是好氧菌

7、，有時(shí)也分離厭氧菌，對(duì)于嚴(yán)格厭氧菌，除了配置特殊的培養(yǎng)基離厭氧菌，對(duì)于嚴(yán)格厭氧菌，除了配置特殊的培養(yǎng)基外，還需要厭氧培養(yǎng)箱、厭氧罐等設(shè)備。外，還需要厭氧培養(yǎng)箱、厭氧罐等設(shè)備。3.3.添加抑制劑添加抑制劑被分離的微生物添加物質(zhì)及其質(zhì)量濃度/(mgmL-1)被抑制的微生物放線菌放線菌酮（50），抑霉菌素（50），環(huán)己亞胺（50），匹馬霉素（50），丙酸鈉（4）霉菌環(huán)己亞胺+多粘菌素+枯草菌素，多粘菌素B（50）+青霉素（1）細(xì)菌放線菌酮（50500），制霉菌素（100），曲骨霉菌素（500）霉菌、酵母菌原蟲(chóng)霉素（5）原生動(dòng)物革蘭氏陽(yáng)性菌多粘菌素B（5）革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌青霉素（1），月桂酸鈉

8、（2）革蘭氏陽(yáng)性菌酵母菌氯霉素（100），青霉素（20）+鏈霉素（40），玫瑰紅（50）+放線菌酮（10）細(xì)菌放線菌酮霉菌霉菌氯霉素（100），青霉素（20）+鏈霉素（40），玫瑰紅（3567）細(xì)菌細(xì)菌、酵母菌（三）分離純化（三）分離純化 為了獲得某一特定的微生物菌種，必須進(jìn)行微生物的為了獲得某一特定的微生物菌種，必須進(jìn)行微生物的分離純化，把最需要的菌株直接從樣品中分離出來(lái)；分離純化，把最需要的菌株直接從樣品中分離出來(lái)；（1 1）常規(guī)的分離方法）常規(guī)的分離方法獲得的菌落均勻，獲得純種的概率大，特別適合分離具有蔓延性的微生物操作簡(jiǎn)單，方便快捷稀釋涂布法劃線分離法 將待測(cè)樣品適當(dāng)稀釋，使其中的微生

9、物充分分散成單個(gè)細(xì)將待測(cè)樣品適當(dāng)稀釋，使其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋液接種到培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)繁殖每個(gè)單細(xì)菌胞，取一定量的稀釋液接種到培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)繁殖每個(gè)單細(xì)菌長(zhǎng)成肉眼可見(jiàn)的菌落，即一個(gè)菌落代表樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。長(zhǎng)成肉眼可見(jiàn)的菌落，即一個(gè)菌落代表樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。 根據(jù)菌落數(shù)，稀釋倍數(shù)，接種量可推算出原樣品中的含菌數(shù)。根據(jù)菌落數(shù)，稀釋倍數(shù)，接種量可推算出原樣品中的含菌數(shù)。&稀釋涂布分離法稀釋涂布分離法一般用菌落形成單位（一般用菌落形成單位（colony forming units， CFU）來(lái)表示）來(lái)表示原樣品中的細(xì)胞數(shù)。原樣品中的細(xì)胞數(shù)。&劃線分離法劃線分

10、離法 固體培養(yǎng)基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營(yíng)養(yǎng)成分，造成不透明的培養(yǎng)基背景。菌落利用此物質(zhì)形成透明圈。利用某種營(yíng)養(yǎng)缺陷型微生物作為工具菌，若待篩選菌具有將前體物轉(zhuǎn)化成營(yíng)養(yǎng)物的能力，工具菌就能圍繞該菌生長(zhǎng)。待篩選的菌株能分泌產(chǎn)生某些能抑制工具菌生長(zhǎng)的物質(zhì) 指示劑直接摻入或噴灑固體培養(yǎng)基，菌落周圍形成變色圈。（2）平皿反應(yīng)快速檢出法）平皿反應(yīng)快速檢出法菌種分離篩選流程菌種分離篩選流程確定采樣環(huán)境采樣設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案充分查閱資料增殖培養(yǎng)確定增殖條件純種分離 劃線、稀釋與組織分離菌種篩選純種鑒定、生產(chǎn)能力考查毒性試驗(yàn)其他鑒定微生物遺傳變異與育種微生物遺傳變異與育種 微生物遺傳學(xué)微生物遺傳學(xué)現(xiàn)代發(fā)酵技

11、術(shù)主要內(nèi)容主要內(nèi)容一、遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)一、遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)Q：蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)還是還是核酸核酸？（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（二）噬菌體感染實(shí)驗(yàn)（二）噬菌體感染實(shí)驗(yàn)（三）植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)（三）植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)經(jīng)典轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)經(jīng)典轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 研究對(duì)研究對(duì)象：肺象：肺炎鏈球炎鏈球菌菌 結(jié)論：結(jié)論：DNA是遺傳是遺傳物質(zhì)物質(zhì)分別加入到培養(yǎng)分別加入到培養(yǎng)R R型細(xì)菌的培養(yǎng)基中型細(xì)菌的培養(yǎng)基中只得到只得到R R型型既有既有R R型型, ,也有也有S S型型DNADNADNA DNA +DNA+DNA酶酶蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)RNA多糖多糖只得到只得到R R型型只得到只得到R R型型只得到只得到R R型型R

12、R型型S S型型噬菌體感染實(shí)驗(yàn)噬菌體感染實(shí)驗(yàn) 研究對(duì)象：研究對(duì)象：大腸桿菌大腸桿菌T2 噬菌體噬菌體 結(jié)論：結(jié)論：DNA是遺傳物質(zhì)是遺傳物質(zhì)植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)植物病毒的重建實(shí)驗(yàn) 研究對(duì)研究對(duì)象：象：TMV 結(jié)論：結(jié)論：RNA是是遺傳物遺傳物質(zhì)質(zhì)大多數(shù)生物DNA某些RNA一、遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)一、遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)核酸核酸 絕大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)是絕大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)是DNA，所以說(shuō)，所以說(shuō)核酸核酸是主要是主要的遺傳物質(zhì)；的遺傳物質(zhì)；DNA主要存在于細(xì)胞核內(nèi)的主要存在于細(xì)胞核內(nèi)的染色體染色體上，所上，所以說(shuō)染色體是遺傳物質(zhì)的主要以說(shuō)染色體是遺傳物質(zhì)的主要載體載體。二、微生物的染色體分子結(jié)構(gòu)二、

13、微生物的染色體分子結(jié)構(gòu) 染色體概述染色體概述 染色體（染色體（Chromosome ）是細(xì)胞內(nèi)具有遺傳性質(zhì)的物）是細(xì)胞內(nèi)具有遺傳性質(zhì)的物體，易被堿性染料染成深色，所以叫染色體。其本質(zhì)體，易被堿性染料染成深色，所以叫染色體。其本質(zhì)是脫氧核甘酸，是細(xì)胞核內(nèi)由核蛋白組成、能用堿性是脫氧核甘酸，是細(xì)胞核內(nèi)由核蛋白組成、能用堿性染料染色、有結(jié)構(gòu)的線狀體，是遺傳物質(zhì)基因的載體。染料染色、有結(jié)構(gòu)的線狀體，是遺傳物質(zhì)基因的載體。細(xì)胞核染色體棒狀可染色結(jié)構(gòu)生命的基本單位。細(xì)胞有絲分裂時(shí)可見(jiàn)（一）原核微生物擬核體（一）原核微生物擬核體 與真核生物相比，原核微生物的染色體要簡(jiǎn)單的多，與真核生物相比，原核微生物的染色

14、體要簡(jiǎn)單的多，其染色體通常只有一個(gè)核酸分子（其染色體通常只有一個(gè)核酸分子（DNA或或RNA），其），其遺傳信息的含量也比真核生物少的多；遺傳信息的含量也比真核生物少的多； 病毒染色體只含有一個(gè)病毒染色體只含有一個(gè)DNA或者或者RNA分子，可以是單分子，可以是單鏈也可以是雙鏈，大多呈環(huán)狀，少數(shù)呈線性分子；鏈也可以是雙鏈，大多呈環(huán)狀，少數(shù)呈線性分子； 細(xì)菌染色體均為環(huán)狀的細(xì)菌染色體均為環(huán)狀的DNA分子；分子；原核微生物染色體原核微生物染色體原核細(xì)胞擬核體染色體一條閉環(huán)雙鏈分子原核生物染色體：并不是“裸露”的DNA分子，其DNA分子同樣與蛋白質(zhì)和RNA等其他分子結(jié)合。如：大腸桿菌DNA與集中DNA結(jié)

15、合蛋白相結(jié)合，此外，還結(jié)合有RNA。（二）真核微生物染色體（二）真核微生物染色體1.染色質(zhì)：染色質(zhì)： 染色質(zhì)是染色體在細(xì)胞分裂的間期所表現(xiàn)的形態(tài)，染色質(zhì)是染色體在細(xì)胞分裂的間期所表現(xiàn)的形態(tài)，是是DNA和蛋白質(zhì)以及少量的和蛋白質(zhì)以及少量的RNA組成的復(fù)合物，蛋白組成的復(fù)合物，蛋白質(zhì)包括組蛋白和非組蛋白兩類；質(zhì)包括組蛋白和非組蛋白兩類；2.核小體：核小體： 染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位是核小體，由染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位是核小體，由DNADNA和組蛋白和組蛋白組成；組成；32 DNA在組蛋白核心外盤繞1.75圈，共146個(gè)bp，平均每個(gè)核小體的重復(fù)單位約為200 bp。組蛋白H1在核小體外面，結(jié)合于連接DNA

16、上，使核小體能彼此相連形成念珠狀結(jié)構(gòu) 核小體中組蛋白和DNA的比例左手螺旋332nm DNA壓縮比為6核小體的形成是染色體DNA壓縮的第一階段離子強(qiáng)度低、無(wú)H1200bp DNA10nm 核小體長(zhǎng)度縮短7倍離子強(qiáng)度較高且有H1核小體鏈30nm 螺線管(每圈6個(gè)核小體)染色體壓縮比： 764058400染色質(zhì)的第二級(jí)組織150nm 突環(huán)(75000 bp)形成超螺旋300nm 玫瑰花結(jié)(6個(gè)突環(huán))700nm 螺旋圈(30個(gè)玫瑰花結(jié))超螺旋圓筒壓縮比為40壓縮5倍形成染色單體1400nm 染色體(每個(gè)染色單體含10個(gè)螺旋圈) （二）真核微生物染色體（二）真核微生物染色體3.染色體的結(jié)構(gòu)模型染色體的

17、結(jié)構(gòu)模型 染色體染色體 兩條染色單體兩條染色單體 每條染色單體每條染色單體 染色質(zhì)染色質(zhì)+染色粒染色粒（二）真核微生物染色體（二）真核微生物染色體4.著絲粒和端體著絲粒和端體（1）著絲粒：）著絲粒：（2）端體：）端體： 三、微生物基因組三、微生物基因組 （一）概念（一）概念 1.基因組的概念：基因組的概念：DNA是巨大的生物高分子，一般將是巨大的生物高分子，一般將細(xì)胞內(nèi)遺傳信息的攜帶者在染色體所包含的細(xì)胞內(nèi)遺傳信息的攜帶者在染色體所包含的DNA總體總體稱為基因組。稱為基因組。 2.細(xì)菌在一般情況下是一套基因，即單倍體；真核微生細(xì)菌在一般情況下是一套基因，即單倍體；真核微生物通常有兩套基因，又稱二倍體；物通常有兩套基因，又稱二倍體； 3.基因組通常是指全部的一套基因；基因組通常是指全部的一套基因；（二）原核微生物基因組的概念（二）原核微生物基因組的概念 1.基因組較小，沒(méi)有核膜包裹，且形式多樣；基因組較小，沒(méi)有核膜包裹，且形式多樣； 2.具有操縱子結(jié)構(gòu)；具有操縱子結(jié)構(gòu)； 3.DNA分子絕大部分用于編碼蛋白質(zhì)，不編碼的部分分子絕大部分用于編碼蛋白質(zhì)，不編碼的部分通常包含控制基因表達(dá)的順序；通常包含控制基因表達(dá)的順序； 4.基因重疊是病毒基因組的特點(diǎn)；基因重疊是病毒基因組的特點(diǎn)； 5.除真核細(xì)胞病毒外，基因是連續(xù)的，即不含內(nèi)含子序除真核細(xì)胞病毒外，基因