薄層色譜及柱色譜

1、LOGO薄層色譜及柱色譜劉雪麗劉雪麗 劉菲劉菲 李喜梅李喜梅 鐘家吉鐘家吉LOGO一、實驗目的1、掌握色譜法的基本原理及其應用。、掌握色譜法的基本原理及其應用。2、掌握薄層色譜及柱色譜的操作技能。、掌握薄層色譜及柱色譜的操作技能。LOGO二、色譜法基本原理1.色譜法色譜法又稱為層析法，是又稱為層析法，是分離分離，純化純化和和鑒定鑒定有機化合物的重要有機化合物的重要方法之一。方法之一。 2.色譜法的基本原理是利用混合物各組分在兩相間（流動相色譜法的基本原理是利用混合物各組分在兩相間（流動相和固定相）的和固定相）的吸附或分配（溶解性能）的差異吸附或分配（溶解性能）的差異。即當混合。即當混合物隨流動

2、相流經(jīng)固定相時，由于固定相對各組分的吸附或物隨流動相流經(jīng)固定相時，由于固定相對各組分的吸附或溶解性能的不同，經(jīng)過溶解性能的不同，經(jīng)過兩相間反復多次的吸附或分配兩相間反復多次的吸附或分配，使，使吸附較弱或溶解度較小的組分在固定相中移動較快，從而吸附較弱或溶解度較小的組分在固定相中移動較快，從而使各組分得到分離。使各組分得到分離。3.色譜法的應用色譜法的應用主要包括以下幾個方面：主要包括以下幾個方面：（1）分離混合物）分離混合物（2）精致提純化合物）精致提純化合物（3）鑒定化合物）鑒定化合物（4）跟蹤反應進程）跟蹤反應進程LOGO三、色譜法的分類（1）薄層色譜：將）薄層色譜：將固定相均勻涂布在表面

3、光滑的平板固定相均勻涂布在表面光滑的平板上，形上，形成薄層來進行物質分離及分析的方法。成薄層來進行物質分離及分析的方法。 按其按其操作不同操作不同，可分為薄層色譜、柱色譜、紙色譜、氣相，可分為薄層色譜、柱色譜、紙色譜、氣相色譜和高效液相色譜。色譜和高效液相色譜。 （2）柱色譜：將）柱色譜：將固定相裝在色譜柱固定相裝在色譜柱中，使樣品沿著色譜柱移中，使樣品沿著色譜柱移動，通過各組分隨流動相流動而得到分離的方法。動，通過各組分隨流動相流動而得到分離的方法。（3）紙色譜：）紙色譜：用濾紙等作為液體的載體用濾紙等作為液體的載體，將樣品點在紙上隨，將樣品點在紙上隨后展開而達到分離鑒定的方法。后展開而達到

4、分離鑒定的方法。（4）氣相色譜：是）氣相色譜：是以氣體為流動相以氣體為流動相的色譜法的色譜法。LOGO N NN NHO展開劑選用9:1的無水苯乙酸乙脂偶氮苯蘇丹LOGO有關化合物的物理性質：LOGO四、薄層色譜1.薄層板的制備：薄層板的制備：（1）固定相的選擇：）固定相的選擇：吸附色譜：吸附色譜： 氧化鋁氧化鋁、硅膠硅膠 （H不含黏合劑不含黏合劑）分配色譜的支持劑：硅藻土、纖維素分配色譜的支持劑：硅藻土、纖維素 （F含熒光物質含熒光物質） （G含煅石膏含煅石膏 2CaSO4H2O黏合劑黏合劑) 薄層板的薄層板的制制備備點樣點樣展開展開顯色，計算、分析顯色，計算、分析LOGO四、薄層色譜（2）

5、制板：）制板： 干法和濕法干法和濕法取取3g硅膠硅膠G與與6-7mL0.5%-1%的的羧甲基纖維素鈉羧甲基纖維素鈉的水溶液在燒杯的水溶液在燒杯中中調成糊狀物調成糊狀物平鋪平鋪或或浸漬浸漬室溫晾干室溫晾干后后，放入烘箱內放入烘箱內加熱活化加熱活化通常用通常用六中染料確定活性六中染料確定活性LOGO四、薄層色譜2.點樣點樣（2）通常將）通常將樣品溶于低沸點溶劑樣品溶于低沸點溶劑（丙酮，甲醇、乙醚等），（丙酮，甲醇、乙醚等），根據(jù)使用的固定相配成根據(jù)使用的固定相配成0.5%-5%的溶液，用內徑小于的溶液，用內徑小于1mm管口平整的管口平整的毛細管毛細管，在，在起始線上小心點樣起始線上小心點樣，斑點直

6、徑一般，斑點直徑一般不超過不超過2-3mm。（1）點樣前，先在薄層板上）點樣前，先在薄層板上據(jù)底端據(jù)底端1cm處處，用尺子、鉛筆輕，用尺子、鉛筆輕畫一橫線作為起始線。畫一橫線作為起始線。（3）同一塊板可點）同一塊板可點幾個樣品點幾個樣品點，但是，但是間距應為間距應為1-1.5cm。點點樣要輕，不可刺破薄層樣要輕，不可刺破薄層?。ǎ。ㄗⅲ阂蛉芤禾』驑狱c太小，可注：因溶液太稀或樣點太小，可重復點樣。但應在前次點樣的溶劑揮發(fā)后，方可重點，以防重復點樣。但應在前次點樣的溶劑揮發(fā)后，方可重點，以防樣點被溶解掉。樣點過大，造成尾擴散等現(xiàn)象，影響分離效樣點被溶解掉。樣點過大，造成尾擴散等現(xiàn)象，影響分離效果

7、）果） （4）點樣結束，）點樣結束，必須待樣品點干燥后必須待樣品點干燥后，方可進行展開方可進行展開。LOGO四、薄層色譜3.展開展開（2）展開操作：）展開操作：a.先在密閉的展開槽內倒入少量配好的展開劑，先在密閉的展開槽內倒入少量配好的展開劑，高度不能超高度不能超過過1cm。待其蒸氣飽和，以達到平衡。（約。待其蒸氣飽和，以達到平衡。（約5min）b.將點樣后的薄層板放入展槽中，將點樣后的薄層板放入展槽中，先不要接觸展開劑先不要接觸展開劑，讓，讓薄層板吸附蒸氣以達飽和。（約薄層板吸附蒸氣以達飽和。（約3min）c.將點樣的一端放入展開劑中，墊高薄層板，始終使薄層板將點樣的一端放入展開劑中，墊高薄

8、層板，始終使薄層板浸入展開劑為浸入展開劑為0.5cm，展開劑高度絕對不能浸過起始線！展開劑高度絕對不能浸過起始線?。ㄕ归_劑若高于樣品點，會使本就少量的樣品溶于展開劑，展開劑若高于樣品點，會使本就少量的樣品溶于展開劑，難以隨展開劑的展開而分離。達不到分析的目的難以隨展開劑的展開而分離。達不到分析的目的 ?。。ヾ.待待溶劑前沿離頂端溶劑前沿離頂端1cm左右，就應取出薄層板左右，就應取出薄層板，待展開劑，待展開劑揮干后，觀察分析。絕對不能使展開劑漫過薄層板的端！揮干后，觀察分析。絕對不能使展開劑漫過薄層板的端?。?）展開劑的選擇：根據(jù)樣品的極性、溶解度和吸附劑的活性）展開劑的選擇：根據(jù)樣品的極性、

9、溶解度和吸附劑的活性等因素考慮等因素考慮。LOGO四、薄層色譜4.顯色、計算及分析顯色、計算及分析（1）若）若樣品樣品本身是本身是有色有色的，可以的，可以直接觀察直接觀察到分離的過程及結果。到分離的過程及結果。 若無色，則可通過以下幾種方法顯色：若無色，則可通過以下幾種方法顯色：碘熏碘熏、紫外光燈紫外光燈、噴顯色劑噴顯色劑。（2）計算比移值（）計算比移值（Rf）：）：LOGO四、薄層色譜（3）良好的分離，）良好的分離，Rf值應在值應在0.15-0.75之間之間，否則應更換展開劑，否則應更換展開劑重做。重做。通常樣品的極性越大，通常樣品的極性越大，Rf值越小。值越小。（4）在一定的操作條件下，即

10、）在一定的操作條件下，即色譜條件一定，比移值（色譜條件一定，比移值（Rf）只與組分性質有關，因此可用來鑒定化合物只與組分性質有關，因此可用來鑒定化合物。（定性）。（定性）但是但是Rf值除了決定于物質的結構外，還與吸附劑的含水量、值除了決定于物質的結構外，還與吸附劑的含水量、薄層厚度，展開劑純度、溫度等外界因素有關，因此薄層色薄層厚度，展開劑純度、溫度等外界因素有關，因此薄層色譜幾乎不用于定性，譜幾乎不用于定性，常用來分析樣品中的組分常用來分析樣品中的組分。LOGO注意事項：1.一根點樣管只能點一種樣品，否則有交叉污染。2,軟板點樣需很輕，否則固定相會粘到點樣管下。3,樣品點直徑應不超過2mm，

11、距離薄層板底部約1cm，樣之間間距約11.5 cm，展開時薄層板底部浸入展開劑的高度約0.5 cm。注意樣品點決不能浸到開劑中。4.展開劑離薄層板上緣約1 cm時應停止走板，取出晾干。不可使展開劑走到板的盡頭。板取出后要及時標記展開劑前沿，否則展開劑揮發(fā)后難以確定。LOGO五、柱色譜在色譜柱中填入表面積很大、在色譜柱中填入表面積很大、經(jīng)過活化的多孔性粉狀固體吸經(jīng)過活化的多孔性粉狀固體吸附劑（硅膠、氧化鋁）。附劑（硅膠、氧化鋁）。分離的混合物溶液流過吸附分離的混合物溶液流過吸附柱時，各種成分同時被吸附在柱時，各種成分同時被吸附在柱的上端。柱的上端。當洗脫劑流下時，由于不同當洗脫劑流下時，由于不同

12、化合物吸附能力不同，往下洗化合物吸附能力不同，往下洗脫的速度也不同，即溶質在柱脫的速度也不同，即溶質在柱中自上而下按對吸附劑親和力中自上而下按對吸附劑親和力大小分別形成若干色帶。大小分別形成若干色帶。再用溶劑洗脫時，已經(jīng)分開再用溶劑洗脫時，已經(jīng)分開的溶質可以從柱上分別洗出收的溶質可以從柱上分別洗出收集。集。吸附柱色譜的工作原理：吸附柱色譜的工作原理：在色譜柱中填入表面積很大、經(jīng)過活化的多孔性粉狀固體吸附劑（硅膠、氧化鋁）。分離的混合物溶液流過吸附柱時，各種成分同時被吸附在柱的上端。當洗脫劑流下時，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脫的速度也不同，即溶質在柱中自上而下按對吸附劑親和力大小分別形成

13、若干色帶。再用溶劑洗脫時，已經(jīng)分開的溶質可以從柱上分別洗出收集。LOGO吸附劑的選擇：常用的吸附劑：常用的吸附劑：氧化鋁氧化鋁、硅膠、氧化鎂、碳酸鈣和活性炭、硅膠、氧化鎂、碳酸鈣和活性炭吸附劑要求：吸附劑要求： 不能與被分離的物質和展開劑發(fā)生化學作用；不能與被分離的物質和展開劑發(fā)生化學作用； 吸附劑的粒度大小要均勻。吸附劑的粒度大小要均勻。粒度小，表面積大，吸附能力強，分離效果好，但流速慢粒度小，表面積大，吸附能力強，分離效果好，但流速慢粒度大，表面積小，吸附能力弱，分離效果差，但流速快。粒度大，表面積小，吸附能力弱，分離效果差，但流速快。 酸性酸性（分離酸性物質，如有機酸類化合物）（分離酸性

14、物質，如有機酸類化合物） 中性中性（分離中性物質，如醛、酮、醌和酯類化合物）（分離中性物質，如醛、酮、醌和酯類化合物） 堿性堿性（分離堿性物質，如碳氫化合物、生物堿、胺等）（分離堿性物質，如碳氫化合物、生物堿、胺等） 本實驗吸附劑：本實驗吸附劑：中性氧化鋁中性氧化鋁（150目）目）氧化鋁對各種化合物的吸附性大小：氧化鋁對各種化合物的吸附性大?。核釅A醇胺硫酸酯醛酮芳香族化合物鹵代物醚烯飽和烴酸堿醇胺硫酸酯醛酮芳香族化合物鹵代物醚烯飽和烴LOGO1.裝柱：是柱色譜最關鍵的操作，裝柱的好壞直接影響分離效果。裝柱：是柱色譜最關鍵的操作，裝柱的好壞直接影響分離效果。（1）裝柱前，應先將玻璃柱洗凈，干燥，

15、垂直固定在鐵架臺上。在）裝柱前，應先將玻璃柱洗凈，干燥，垂直固定在鐵架臺上。在柱柱底鋪一小塊脫脂棉，再鋪約底鋪一小塊脫脂棉，再鋪約0.5cm厚的石英砂，然后進行裝柱厚的石英砂，然后進行裝柱。有。有濕法和濕法兩種方式，濕法裝柱效果更好。濕法和濕法兩種方式，濕法裝柱效果更好。五、柱色譜（2）濕法裝柱：將固定相（如硅膠）用洗脫劑調成糊）濕法裝柱：將固定相（如硅膠）用洗脫劑調成糊狀，在狀，在柱內先加入約柱內先加入約3/4柱高的洗脫劑柱高的洗脫劑，再將糊狀物，再將糊狀物邊震蕩邊倒入柱中，同時，打開下旋塞，用一干凈干邊震蕩邊倒入柱中，同時，打開下旋塞，用一干凈干燥的燒杯接收洗脫劑。燥的燒杯接收洗脫劑。 待

16、糊狀物全部裝完后，用接收到的洗脫劑轉移殘留的待糊狀物全部裝完后，用接收到的洗脫劑轉移殘留的固定相，并將柱壁上的固定相淋洗下去。固定相，并將柱壁上的固定相淋洗下去。 裝柱過程中，裝柱過程中，應不斷輕敲色譜柱應不斷輕敲色譜柱，以使固定相填充，以使固定相填充均勻、無氣泡！均勻、無氣泡！ 整個裝柱過程中，整個裝柱過程中，柱內洗脫劑的高度始終不能低于柱內洗脫劑的高度始終不能低于固定相最上端固定相最上端，否則柱內會出現(xiàn)裂痕和氣泡！，否則柱內會出現(xiàn)裂痕和氣泡！LOGO五、柱色譜2.展開及洗脫：展開及洗脫： 將將樣品溶解在樣品溶解在最少量的最少量的洗脫劑洗脫劑中。滴加前，打開下旋塞中。滴加前，打開下旋塞 使洗

17、脫劑流出，使洗脫劑流出，恰好下降到固定相表面時，關閉旋塞恰好下降到固定相表面時，關閉旋塞，開，開 將樣品迅速全部滴加于柱頂端將樣品迅速全部滴加于柱頂端后，用一事先后，用一事先戳孔的圓形濾戳孔的圓形濾 蓋住樣品表面，以防加洗脫劑時攪動柱頂表蓋住樣品表面，以防加洗脫劑時攪動柱頂表 面。面。 樣品加完后，打開下旋塞，再立即加入洗樣品加完后，打開下旋塞，再立即加入洗 脫劑進行洗脫脫劑進行洗脫。色譜帶的展開過程就是樣。色譜帶的展開過程就是樣 品的分離過程，品的分離過程，可按顏色段收集各組分可按顏色段收集各組分。LOGO五、柱色譜洗脫過程中的注意事項：洗脫過程中的注意事項：1. 1.洗脫劑應連續(xù)平穩(wěn)地加入

18、，不能中斷洗脫劑應連續(xù)平穩(wěn)地加入，不能中斷。2 2. .洗脫劑流出速度洗脫劑流出速度應控制在應控制在每分鐘每分鐘5-105-10滴滴。下移速。下移速度太快，分離效好，太慢，會造成色譜擴散或成度太快，分離效好，太慢，會造成色譜擴散或成分破壞，影響分離效果分破壞，影響分離效果 注：色譜柱裝的好壞，將嚴重影響分離效果。得注：色譜柱裝的好壞，將嚴重影響分離效果。得 色譜柱，不得使吸附劑有裂縫和氣泡，且不得色譜柱，不得使吸附劑有裂縫和氣泡，且不得 使液面低于吸附劑或砂層表面。使液面低于吸附劑或砂層表面。思考題1.為什麼在用有機溶劑做洗脫劑時，要求他們必須干燥？為什麼在用有機溶劑做洗脫劑時，要求他們必須干燥？ 柱色譜上用的吸附劑顆粒一般比柱色譜上用的吸附劑顆粒一般比TLC上用的吸附劑顆粒上用的吸附劑顆粒大，柱色的洗脫劑也應比大，柱色的洗脫劑也應比TLC的展開劑極性略小，才能的展開劑極性略小，才能得到較好的分離效果。為此，所用溶劑必須干燥，否則得到較好的分離效果。為此，所用溶劑必須干燥，否則將嚴重影響分離效果（需要含水溶脫時除外）將嚴重影響分離效果（需要含水溶脫時除外）2.裝柱時如果柱中留有氣泡，暗溝，斷層或填裝不均勻，對裝柱時如果柱中留有氣泡，暗溝，斷層或填裝不均勻，