蛋白質的提取與檢測

1、蛋白質的提取與檢測第一節(jié) 細胞總蛋白的提取及含量測定【基本原理】蛋白質含量測定法是生物化學研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四種經典的方法，即定氮法、雙縮脲法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。另外還有兩種近年普遍使用起來的測定法，即考馬斯亮藍法（Bradford法）與二辛可寧酸法（BCA法）。值得注意的是，上述方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質，因為一種蛋白質溶液用這幾種方法測定有可能得出不同的結果。每種測定法都不是完美無缺的，都有其優(yōu)缺點。在選擇方法時應考慮：實驗對測定所要求的靈敏度和精確度；蛋白質的性質；溶液中存在的干擾物質；測定

2、所要花費的時間。Lowry法：蛋白質與堿性銅溶液中的二價銅離子絡和使得肽鍵伸展，從而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在堿性銅條件下與磷鉬鎢酸反應并產生深藍色，在750nm有最大光吸收值。在一定濃度范圍內，反應液顏色的深淺與蛋白質中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比,由于各種蛋白質中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在測定時需使用同種蛋白質作標準。Bradford法：蛋白質與染料考馬斯亮藍G-250結合，使得染料最大吸收峰從465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色由棕黑色變?yōu)樗{色。在一定的線性范圍內，反應液595nm處吸光度的變化量與反應蛋白量成正比，測定595nm處吸光度的增加即可進行蛋白定量。BCA（Bic

3、inchoninic acid）法：二價銅離子在堿性的條件下，可以被蛋白質還原成一價銅離子（Biuret reaction）并與BCA相互作用產生敏感的顏色反應。兩分子的BCA螯合一個銅離子，形成紫色的反應復合物。該水溶性的復合物在562nm處顯示強烈的吸光性，吸光度和蛋白濃度在廣泛范圍內有良好的線性關系，根據吸光值可以推算出蛋白濃度?！驹噭┡渲啤?. 1.74mg/ml（10mmol/L）PMSF：0.174g PMSF溶解于100ml異丙醇，分裝于1.5ml離心管中，-20保存。2. 細胞裂解液：50mM Tris-HCl（pH 7.4），150mM NaCl，1mM PMSF，1mM E

4、DTA，1% Triton X-100，4保存。3. 100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）：BSA 0.1g，0.15mol/L NaCl 1ml，充分溶解后-20保存。4. 0.15mol/L NaCl：0.877g NaCl溶解于100ml去離子水，高溫滅菌后室溫保存。5. 考馬斯亮藍G250溶液：考馬斯亮藍G250 100mg，95%乙醇 50ml，磷酸 100ml，加去離子水至1L。先用乙醇溶解考馬斯亮藍染料，再加入磷酸和去離子水，混勻后濾紙過濾，4保存。6. PBS緩沖液（pH 7.4）：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO412H2O 3.63g，KH2PO4 0.2

5、4g，溶解于900ml雙蒸水中，用鹽酸調pH值至7.4，加去離子水定容至1L，常溫保存?zhèn)溆?。【操作步驟】一、細胞總蛋白的提取1. 人乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231與食道癌細胞系EC109于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，37、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。2. 去除培養(yǎng)液后以預冷的PBS沖洗23遍。3. 加入適量的預冷的裂解液后置于冰上2030 min，不時搖動。4. 用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側，轉移將細胞碎片和裂解液至預冷的1.5ml離心管中；。 5. 4、12 000 rpm離心15min。 6. 將上清分裝至1.5ml的EP管中，-20凍存?zhèn)溆谩?二、 蛋白含量測定

6、（BCA法）（碧云天P0012）1. 根據樣品數量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻。BCA工作液室溫24小時內穩(wěn)定。2. 完全溶解蛋白標準品，取10uL稀釋至100uL，使終濃度為0.5mg/ml。蛋白樣品在什么溶液中，標準品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡便起見，也可以用0.9%NaCl或PBS稀釋標準品。3. 將標準品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20uL加到96孔板的標準品孔中，加用于稀釋標準品的溶液補足到20uL。4. 加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中，加用于稀釋標準品的溶液（PBS）到20uL。每個樣品三個重復。

7、5. 各孔加入200uLBCA工作液，37放置30分鐘。也可以室溫放置2小時，或60放置30分鐘。BCA法測定蛋白濃度時，吸光度會隨著時間的延長不斷加深。并且顯色反應會因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或延長孵育時間。6.酶標儀測定A562，540-595nm之間的波長也可接受。根據標準曲線計算出蛋白濃度。標準品OD值標準品濃度ug/uL0.07800.0990.0250.1180.050.1540.10.2130.20.2830.30.3290.40.4040.5第二節(jié) SDS-PAGE電泳【基本原理】SDS-PAGE電泳技術（SDS polyacrylamede gel

8、electrophoresis）首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn進一步完善。當在樣品介質和聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS后，則蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小，其它因素可以忽略不計。SDS是一種陰離子去污劑，它能破壞蛋白質分子之間以及其它物質分子之間的非共價鍵（氫鍵和疏水鍵）。在強還原劑如巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）的存在下，蛋白質分子內的二硫鍵被打開并解聚成多肽鏈。解聚后的蛋白質分子或其亞基與SDS充分結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS復合物，復合物所帶的負電荷大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，這就消除了不同蛋白質分子之間原有的電荷差異

9、，蛋白質-SDS復合物在溶液中的形狀像一個長橢圓棒。橢圓棒的短軸對不同的蛋白質-SDS復合物基本上是相同的，但長軸的長度則與蛋白質分子量的大小成正比，因此這種復合物在SDS-PAGE系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受蛋白質原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒的長軸長度即蛋白質分子量的大小。當蛋白質的分子量在15200kD之間時，電泳遷移率與分子量的對數呈線性關系。因此，SDS-PAGE不僅可以分離鑒定蛋白質，而且可以根據遷移率大小測定蛋白質的分子量?！驹噭┡渲啤?. 10%SDS：10g SDS加入100ml去離子水中，50水浴下溶解，室溫保存。2. 1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8）：Tr

10、is-base 45.43g，加入200ml去離子水溶解后，用濃鹽酸調pH至8.8，加去離子水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。3. 1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）：Tris-base 30.29g，加入200ml去離子溶解后，用濃鹽酸調pH至6.8，加去離子水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。4. 電泳緩沖液：Tris-base 3.03g，Glycine 18.77g，SDS 1g，加入適量去離子水溶解后定容至1L，室溫保存。5. 5×Loading buffer：50%甘油，250 mM Tris-HCl（pH6.8），10% -巰基乙醇，2.5溴

11、酚藍，10% SDS?；靹蚝螅盅b于1.5ml離心管中，4保存。6. 10%過硫酸胺（AP）：0.1g過硫酸胺溶解于1.0ml去離子水，4保存，保存時間為2周。7. 四甲基乙二胺（TEMED）：分裝少量原液于棕色瓶，4避光保存。8. 30% Acr/Bic（37.5:1）：丙烯酰胺（Acr）29.2g，甲叉雙丙烯酰胺（Bic）0.8g，加入適量去離子水于37下充分溶解并定容至100ml，4保存。注意：Acr/Bic均具有毒性，易吸附和積累，應戴手套進行操作。9. 凝膠脫色液：500ml乙醇，100ml冰醋酸，加去離子水定容至1L，室溫保存。10. 考馬斯亮藍G250蛋白染色液：0.1g考馬斯亮

12、藍G250溶解于100ml脫色液中，混勻后濾紙過濾去除顆粒性物質，置于棕色瓶中室溫保存。11. 凝膠保存液：450ml脫色液中加入50ml甘油，混勻后室溫保存。12. SDS-PAGE濃縮膠（5% Acrylamide）配方：13. 分離膠配方【操作步驟】一、凝膠的配制與電泳（1）凝膠配制與上樣1. 玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。 2. 配制10%濃度的分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產生，待灌入2/3的分離膠后應立即封膠，用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。3. 膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干

13、。 4. 配制5%濃度的濃縮膠，將剩余空間灌滿后立即將梳子插入濃縮膠中；插梳子時要使梳子保持水平，濃縮膠凝固的過程中要補膠12次。5. 待到濃縮膠凝固后，豎直向上輕輕拔出梳子，用水沖洗一下濃縮膠，將其放入加有電泳緩沖液的電泳槽中。 6. 取出含50g蛋白樣品與5×Loading buffer按比例充分混合，煮沸5min。7. 加足夠的電泳液后用微量加樣器貼壁上樣，注意不要吸進氣泡。（2）電泳1. 以初始電壓為80V進行電泳, 30min，樣品進入分離膠后改為120150V。2. 在溴酚蘭泳動至距膠下緣約1cm時即可終止電泳（目的蛋白條帶一般跑過分離膠的1/3，可根據預染蛋白Marke

14、r調整電泳時間）。二、考馬斯亮藍染色1. 電泳后的凝膠于染色液中振蕩染色4h或40染色1h，然后用蒸餾水將凝膠淋洗一次。2. 多次變換脫色液直至凝膠背景脫凈為止，為加快脫色，可略加溫度。3. 凝膠保存：脫去背景色的凝膠在保存液中浸泡30min，然后將凝膠放在玻璃板上，用保存液浸濕玻璃紙包住凝膠在室溫下干燥即可。第三節(jié) 免疫印跡（Western Blot）【基本原理】Western Blot中文一般稱為蛋白質免疫印跡，是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的

15、細胞或組織中的表達情況的信息。Western Blot與Southern印跡雜交或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素/NC膜或聚偏二氟乙烯/PVDF膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色、化學發(fā)光或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測

16、蛋白水平的表達?！驹噭┡渲啤?. 電轉液：Tris-base 5.8g，Glycine 2.9g，SDS 0.37g，甲醇200 ml，去離子水定容至1L，室溫保存。2. TBS：20mM Tris-HCl （pH7.4），150mM NaCl，室溫保存；3. TBST：即含0.05% Tween20的TBS緩沖液。4. 封閉液與抗體稀釋液：均為含5%脫脂奶粉的TBST，溶解后4保存。【操作步驟】一、 轉膜1. 將PVDF膜在甲醇中浸泡3min，完全浸濕后置于入轉膜液中。2. 將膠平鋪于海綿上，按圖示順序鋪上膜與每側12張濾紙，注意用玻璃棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過多部分。從負極（黑色板）依次

17、鋪海綿-濾紙（3層）-膠-PVDF膜-濾紙（3層）。3. 將夾子放入轉移槽中，要使夾子的黑面對轉移槽的黑面，夾的白面對紅面。4. 將轉移槽置于冰水混合物中，300mA， 1.5h(同時放入冰袋，外面包冰)。 5. 以預染蛋白Marker觀察轉移效果。注意： 轉移液含甲醇，操作時要戴手套； 整個操作均在轉移液中進行，要不斷的搟去氣泡； 膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路；注意轉膜時電極方向是“膜正膠負”。二、免疫反應 1. 封閉：將PVDF膜從電轉槽中取出，去離子水與TBST稍加漂洗，浸沒于封閉液(脫脂奶粉5%)中緩慢搖蕩2h。傳統(tǒng)上有兩種封閉液：脫脂奶粉或BSA，脫脂奶粉成本低但不能用

18、于磷酸化蛋白（因脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白），使用脫脂奶粉會結合磷酸化抗體從而易產生高背景。某些抗體用BSA封閉時因不明原因可能會產生比脫脂奶粉更強的信號。2. 結合一抗：將-Actin一抗（兔抗人、鼠）用封閉液稀釋至適當濃度（1：2000），室溫下作用2h或4過夜。3. 洗滌：TBST漂洗PVDF膜后再浸洗三次，每次510 min。4. 結合二抗：按適當比例（1：5000）稀釋HRP標記的二抗（羊抗兔），室溫作用2h。5. 洗滌：TBST漂洗膜后再浸洗2次，每次510 min。二、 DAB顯色（按產品說明書操作）二氨基聯苯胺（3，3-diaminobenzidine，DAB）是過氧化物酶HRP（Peroxidase）的生色底物，在過氧化氫的存在下失去電子而呈現出顏色變化和積累，形成棕褐色不溶性產物。用于檢測過氧化物酶的活性，靈敏度高，特異性好。其適用于蛋白質雜交和免疫化學，以及原位雜交染色等。將配好的DAB直接滴加在目的片段位置，避光顯色至蛋白目的條帶明顯出現。將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。 發(fā)光鑒定Western blot檢測系統(tǒng)中常用交聯酶兩大家族就是辣根過氧化物酶HRP-ECL或堿性磷酸