蛋白的分離純化詳解

1、一、蛋白質(zhì)的分離純化概述與蛋白質(zhì)分離純化相關(guān)的理化特性 分子大小 分子形狀 帶電特性 溶解特性 與配體特異性結(jié)合不同 吸附性質(zhì) 變性和復(fù)性n哪些技術(shù)、原理分子大小 重點 大小：蛋白質(zhì)的分子大小主要取決于蛋白質(zhì)肽鏈的數(shù)目及每條肽鏈的氨基酸殘基數(shù)目。 常用方法 透析 超濾 凝膠過濾 離心分子形狀 重點 形狀：蛋白質(zhì)在離心通過溶液、膜、凝膠顆?；螂娪灸z中的小孔運動時，都會受到它的形狀的影響。 方法密度梯度離心電泳 分子篩層析（三格寫，兩格不寫）電荷 原理：蛋白質(zhì)的凈電荷取決于氨基酸殘基所帶正、負(fù)電荷總和。 方法電泳離子交換層析溶解度 原理：由于蛋白質(zhì)分子表面親水性和疏水性帶電基團(tuán)不同，因此在溶劑中

2、的溶解度不同。 方法：鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法等電點沉淀法配體特異性結(jié)合 重點 原理：將具有親和結(jié)合的兩個分子中的一個固定在不溶性基質(zhì)上，來分離另一個分子。 分類免疫親和層析生物親和層析金屬螯合親和層析擬生物親和層析吸附性質(zhì) 原理：根據(jù)次級鍵相互作用。 方法：吸附層析變性和復(fù)性 原理：蛋白質(zhì)在一定的理化條件下失去原有的空間結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及部分理化特性等稱為變性。當(dāng)變性條件去除后恢復(fù)原有的空間結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能即為復(fù)性。 方法：尿素變性復(fù)性從包涵體中純化原核表達(dá)蛋白二、蛋白質(zhì)的分離純化細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎蛋白溶解蛋白溶解酸、堿醇去垢劑尿素粗粗 提提沉淀相分離分子篩精精 提提各種色譜電泳分離差速離心研磨超

3、聲滲透壓酶保保 存存預(yù)處理（沉淀）原材料的獲取濃縮保存狀態(tài)保存條件保存期限n純化 預(yù)處理（沉淀、粗分離）-純化（離子交換）機(jī)械方法：攪拌、振動研磨壓濾超聲勻漿非機(jī)械方法：干燥滲透壓凍融酶體積離子強(qiáng)度 pH溫度蛋白質(zhì)的穩(wěn)定蛋白質(zhì)的粗分離 使用蛋白質(zhì)提取緩沖液提取實驗材料后，蛋白提取液中目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度往往較低，采取一些簡單的方法使目標(biāo)蛋白質(zhì)濃縮，同時去除大量的雜質(zhì)，這些純化方法就屬于蛋白質(zhì)的粗分級。 硫酸銨分級沉淀、有機(jī)溶劑分級沉淀、超速離心、等電點等電點沉淀(重點)、透析、超過濾、蛋白質(zhì)結(jié)晶等。蛋白質(zhì)的純化 粗分離只是使蛋白質(zhì)得到濃縮和初步分離純化，多數(shù)情況下還要根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小、分子形狀、

4、分子表面特征或分子帶電狀況進(jìn)一步純化，這就是蛋白質(zhì)細(xì)分級。 常用的實驗技術(shù)：層析（離子交換等）和電泳 常用蛋白質(zhì)電泳技術(shù) 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE） SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） 等電聚焦電泳（等電聚焦電泳（ Isoelectric focusing- IEF） 雙向電泳（雙向電泳（ Two Dimensional Electrophoresis ）n雙向凝膠電泳的原理：第一向基于蛋白質(zhì)的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。凝膠中蛋白的檢測凝膠中蛋白的檢測

5、圖像采集和分析圖像采集和分析蛋白鑒定蛋白鑒定分離蛋白質(zhì)組所有蛋白分離蛋白質(zhì)組所有蛋白圖像分析圖像分析在用雙向電泳進(jìn)行差別表達(dá)蛋白質(zhì)組分析時，在用雙向電泳進(jìn)行差別表達(dá)蛋白質(zhì)組分析時，需要利用需要利用軟件對產(chǎn)生的軟件對產(chǎn)生的2D膠進(jìn)行差別分析膠進(jìn)行差別分析，以尋找差別表達(dá)蛋白。以尋找差別表達(dá)蛋白。常用的軟件如安瑪西常用的軟件如安瑪西亞公司的亞公司的Image Master 2D Elite或或Image Master 2D Planium分析軟件分析軟件。原理（問度娘） Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE(聚丙

6、烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。膜種類 硝酸纖維素NC膜 PVDF膜 尼龍膜膜的特點 轉(zhuǎn)膜方法轉(zhuǎn)膜方法 重點重點半干法半干法 將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤濾紙之間，電轉(zhuǎn)1030min。濕法濕法 將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)45min或過夜。 電轉(zhuǎn)儀蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。兩種常用檢測酶系統(tǒng)的比較內(nèi)參的選擇 原因：校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實驗誤差 種類：GAPDH、beta-actin、beta-tubulin 化學(xué)顯色法 : 方便、便宜、有毒、靈敏度較低、費抗體、反應(yīng)慢、線性窄、不易保存、不能重新剝離檢測 化學(xué)發(fā)光法 : 靈敏、快速、節(jié)省抗體、線性寬、無害、特異性高、可重新剝離檢測 同位素法 : 靈敏度高、不安全、環(huán)境污染、半衰期短 熒光底物法： Krypton 熒光底物抗體的選擇 單抗比多抗的特異性要好，但單抗種類較少價