發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離方法(-64)

1、發(fā)酵液的預(yù)處理和固液別離方法山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 孫中濤 預(yù)處理和固液別離的目的： 1、別離細(xì)胞、菌體和其它懸浮顆粒(細(xì)胞碎片、核酸和蛋白質(zhì)的沉淀物)。 2、除去局部可溶性雜質(zhì)。 3、改變?yōu)V液的性質(zhì)降低粘度等，以利于后繼操作?？偛呗裕?1、胞外產(chǎn)物：應(yīng)盡可能轉(zhuǎn)移到液相中，常用調(diào)pH至酸性或堿性的方法來(lái)到達(dá)。 2、胞內(nèi)產(chǎn)物：首先收集細(xì)胞、破壁，生化物質(zhì)釋放到液相，再別離細(xì)胞碎片。 3、通常，以含生化物質(zhì)的液相為出發(fā)點(diǎn)，進(jìn)行后繼操作。一、發(fā)酵液的預(yù)處理 1、改變液體物理性質(zhì)，促進(jìn)固液別離。 細(xì)菌及某些放線菌菌體細(xì)小，發(fā)酵液粘度大，不能直接過(guò)濾，由于菌體自溶，核酸、蛋白質(zhì)及其它有機(jī)粘性物質(zhì)的存在會(huì)造成濾液渾

2、濁，濾速極慢，因此，在預(yù)處理中應(yīng)采用絮凝或凝聚的方法，設(shè)法增大懸浮報(bào)中固體粒子的大小，提高其沉降速度，或采用稀釋、加熱等方法降低粘度，以利于過(guò)濾。必要性： 2、發(fā)酵液雜質(zhì)很多，其中影響最大的是高價(jià)無(wú)機(jī)離子和雜蛋白，預(yù)處理時(shí)，應(yīng)盡量除去。 高價(jià)無(wú)機(jī)離子危害： 在采用離子交換法提煉時(shí)，影響樹(shù)脂的交換容量。雜蛋白質(zhì)的危害：離子交換法和大網(wǎng)格樹(shù)脂吸附法提煉時(shí)，會(huì)降低吸附能力，萃取時(shí)，易產(chǎn)生乳化。過(guò)濾或膜過(guò)濾時(shí)，使濾速下降，膜受到污染。(一)、高價(jià)無(wú)機(jī)離子的去除方法 宜參加草酸。草酸溶解度小，用量大時(shí)，可用其鹽，如草酸鈉。 草酸鈣能促使蛋白質(zhì)凝固，提高濾液質(zhì)量。 草酸的回收：四環(huán)類(lèi)抗生素廢液中，參加硫酸

3、鉛，在60下生成草酸鉛。后者在90-95下用硫酸分解經(jīng)過(guò)濾、冷卻、結(jié)晶后可回收草酸。1、去除鈣離子： 2、除去鎂離子： 參加三聚磷酸鈉，它和鎂離子形成可溶性絡(luò)合物： 用磷酸鹽處理，也能大大降低鈣離子和鎂離子的濃度。此法可用于環(huán)絲氨酸的提煉。3、除去鐵離子： 可參加黃血鹽，使形成普魯士藍(lán)沉淀。二、雜蛋白的去除方法 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)多在一5.5，此時(shí)溶解度最小。但單靠等電點(diǎn)法不能將大局部蛋白質(zhì)除去。 在酸性溶液中，蛋白質(zhì)能與一些陰離子如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、蹂酸鹽、過(guò)氯酸鹽等形成沉淀。 在堿性溶液，蛋白質(zhì)能與一些陽(yáng)離子，如Ag1+，Cu2+，Zn2+，F(xiàn)e3+和Pb2+等形成沉淀。等

4、電點(diǎn)法： 變性蛋白質(zhì)溶解度較小。最常用方法是加熱。 加熱還能使液體粘度降低，加快過(guò)濾速度。 但熱處理常對(duì)原液質(zhì)量有影響，特別是會(huì)使色素增多。 只適于熱穩(wěn)定的物質(zhì)。熱變性法：應(yīng)用舉例：1、鏈霉素發(fā)酵液，調(diào)至酸性(pH 3.0)，加熱至70，維持l2h，能去除蛋白質(zhì)，使過(guò)濾速度增大10一100倍，濾液粘度可降低1/6。2、檸檬酸發(fā)酵液，加熱至80C以上，使蛋白質(zhì)變性凝固，降低發(fā)酵液鉆度，大大提高過(guò)濾速度。 大幅度改變pH，加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或外表活性劑等。 在抗生素生產(chǎn)中，常將發(fā)酵液pH調(diào)至偏酸性范圍(pH23)或較堿性范圍(pH 89使蛋白質(zhì)凝固，一般以酸性下除去的蛋白質(zhì)較多。 加有機(jī)溶劑法

5、通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場(chǎng)合。使蛋白質(zhì)變性的其它方法： 舉例： 1、四環(huán)類(lèi)抗生素生產(chǎn)中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀的膠狀沉淀來(lái)吸附蛋白質(zhì)，取得很好的效果。 2、枯草桿菌發(fā)酵液，常參加氯化鈣和磷酸氫二鈉，生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，從而加快了過(guò)濾速度。利用吸附作用除去蛋白質(zhì)：三、凝聚和絮凝技術(shù) 凝聚：在中性鹽作用下，由于雙電層排斥電位的降低，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。 絮凝：指在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大的絮凝團(tuán)的過(guò)程，是一種以物理的集合為主的過(guò)程。 根本概念： 凝聚和絮凝技術(shù)能有效地改變細(xì)胞、菌體和蛋白

6、質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，使聚集起來(lái)，增大體積，以便于過(guò)濾。 常用于菌體細(xì)小而且粘度大的發(fā)酵液的預(yù)處理。 菌體或蛋白質(zhì)等膠體粒子外表一般都帶有電荷，帶電原因主要是吸附溶液中的離子或自身基團(tuán)的電離。 通常菌體帶負(fù)電荷，由于靜電作用使帶正電荷的粒子被吸附在周?chē)?，在界面上形成了雙電層。 但這些正離子還受到熱運(yùn)動(dòng)的影響，具有離開(kāi)膠粒外表的趨勢(shì)，在相距膠核外表約一個(gè)離子半徑的stern平面以內(nèi)，正離子被緊密柬縛在膠核外表，稱為吸附層或緊密層，在stern平面以外，剩余的正離子那么在溶液中擴(kuò)散開(kāi)去，距離越遠(yuǎn)，濃度越小，最后到達(dá)主體溶液的平均濃度，稱為擴(kuò)散層。雙電層理論：1、凝聚技術(shù) 當(dāng)膠粒在溶液中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)

7、時(shí)，總有一薄層液體，隨著它一起滑移，這一薄層，厚度比吸附層稍大，滑移面(剪切面)在圖141中用波紋線表示。雙電層結(jié)構(gòu)的電位： 1、擴(kuò)散雙電層的結(jié)構(gòu)：一旦由于布朗(Brown)運(yùn)動(dòng)使粒子間距離縮小到它們的擴(kuò)散層局部重疊時(shí)，即產(chǎn)生電排斥作用，阻止了粒子的聚集。 電位越大，電排斥作用就越強(qiáng)，膠粒的分散程度也越大。 2、水化層：由于膠粒外表的水化作用，形成了水化層，也能阻礙直接聚集。水化膜主要是伴隨膠粒帶電而引起，一旦電位降低或消失，水化層也會(huì)隨之減弱或消失。 膠粒保持分散狀態(tài)的原因電位數(shù)學(xué)表達(dá)式： 電位與擴(kuò)散層厚度和電動(dòng)電荷密度成正比，而擴(kuò)散層厚度又與溶液中離子強(qiáng)度有關(guān)，因此，對(duì)帶負(fù)電性菌體的發(fā)酵液

8、，高價(jià)陽(yáng)離子的存在，可壓縮擴(kuò)散層厚度，促使電位迅速降低，而且，化合價(jià)越高這種影響越顯著，當(dāng)雙電層的排斥力缺乏以抗衡膠粒間的范德華引力時(shí)，由于熱運(yùn)動(dòng)的結(jié)果導(dǎo)致膠粒的互相碰撞而聚集起來(lái)。 由式(141，2)知： 電解質(zhì)的凝聚能力可用凝聚價(jià)或凝聚值來(lái)表示。 使膠粒發(fā)生凝聚作用的最小電解質(zhì)濃度(毫摩爾升)，稱為凝聚價(jià)或凝聚值。 反離子的價(jià)數(shù)越高，該值就越小，即凝聚能力越強(qiáng)。陽(yáng)離子對(duì)帶負(fù)電荷的膠粒凝聚能力的次序：常用的凝聚劑電解質(zhì)有：凝聚價(jià)或凝聚值： 有機(jī)高分子聚合物絮凝劑具有長(zhǎng)鏈線狀結(jié)構(gòu)，是水溶性聚合物，分子量高達(dá)數(shù)萬(wàn)至一千萬(wàn)以上，在長(zhǎng)的鏈節(jié)上含有相當(dāng)多的活性功能團(tuán)，可以帶有多價(jià)電荷，也可以不帶電性。

9、 它們通過(guò)靜電引力、范德華分子引力或氫鍵的作用，強(qiáng)烈地吸附在膠粒的外表，一個(gè)高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同顆粒的外表上，產(chǎn)生架橋聯(lián)接，生成粗大的絮團(tuán)，這就是絮凝作用。2、絮凝作用聚丙烯酰胺類(lèi)衍生物聚苯乙烯類(lèi)衍生物無(wú)機(jī)高分子聚合物絮凝劑，如聚合鋁鹽和聚合鐵鹽等。天然有機(jī)高分子絮凝劑：多聚糖類(lèi)膠粘物，海藻酸鈉，明膠、骨膠、殼多糖和脫乙酰殼多糖等。絮凝劑 根據(jù)活性基團(tuán)在水中解離情況不同，可分為非離子型、陰離子型(含有羧基)和陽(yáng)離子型(含有胺基)三類(lèi)。 優(yōu)點(diǎn)：用量少，般以ppm計(jì)，絮凝體粗大，別離效果好，絮凝速度快、種類(lèi)多，適用范圍廣。 缺點(diǎn)：存在一定的毒性，特別是陽(yáng)離子型聚丙烯酰胺，因此，當(dāng)用

10、于食品及醫(yī)藥工業(yè)時(shí)，應(yīng)謹(jǐn)慎使用，要考慮這些物質(zhì)最終能否從產(chǎn)品中去除。 近年來(lái)還開(kāi)展了聚丙烯酸類(lèi)陰離子聚凝劑，它們無(wú)毒，可用于食品和醫(yī)藥工業(yè)中。聚丙烯酰胺類(lèi)絮凝劑： 陽(yáng)離子型高分子絮凝劑對(duì)帶負(fù)電菌體或蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，同時(shí)具有降低粒子排斥電位和產(chǎn)生吸附架橋的雙重機(jī)理，所以可以單獨(dú)使用， 非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，主要通過(guò)分子間引力和氫鍵產(chǎn)生吸附架橋，常與無(wú)機(jī)電解質(zhì)凝聚劑搭配使用。 首先參加無(wú)機(jī)電解質(zhì)，使懸浮粒子脫穩(wěn)而凝聚，然后，再參加絮凝劑。凝聚作用為絮凝劑的架橋創(chuàng)造了良好的條件，從而，提高了絮凝效果。 這種包括凝聚和絮凝機(jī)理的過(guò)程，常稱為混凝。混凝： 絮凝劑濃度絮凝劑分子量絮凝劑類(lèi)型溶液的pH

11、攪拌速度和時(shí)間助凝劑影響絮凝效果的因素：A. 絮凝劑濃度 濃度增加有助于架橋充分，但是過(guò)多的加量會(huì)引起吸附飽和，在膠粒上形成覆蓋層而產(chǎn)生再次穩(wěn)定現(xiàn)象。 分子量提高、鏈增長(zhǎng)，可使架橋效果明顯，但分子量不能超過(guò)一定的限度，因?yàn)殡S分子量提高，高分子絮凝劑的水溶性降低，因此，分子量的選擇應(yīng)適當(dāng)，B. 高分子絮凝劑分子量 C. 溶液pH的變化會(huì)影響絮凝劑功能團(tuán)的電離度，從而影響分子鏈的伸展形態(tài)。 電離度增大，鏈節(jié)上相鄰離子基團(tuán)間的電排斥作用，使分子鏈從卷曲狀態(tài)變?yōu)樯煺範(fàn)顟B(tài)，架橋能力提高。二、 發(fā)酵液的過(guò)濾 發(fā)酵液中含有大量菌體、細(xì)胞或細(xì)胞碎片以及剩余的固體培養(yǎng)基成分，過(guò)濾就是將懸浮在發(fā)酵液中的固體顆粒與

12、液體進(jìn)行別離的過(guò)程。 在過(guò)濾操作中，要求濾速快，濾液澄清，并且有高的收率，但發(fā)酵液往往很難過(guò)濾，目前生產(chǎn)中還是一個(gè)薄弱環(huán)節(jié)。 一、發(fā)酵液的過(guò)濾特性和濾餅的重量比阻 發(fā)酵液大多數(shù)屬于非牛頓型液體，濾渣為可壓縮性的。 衡量過(guò)濾特性的主要指標(biāo)是濾餅的重量比阻r B，表示單位濾餅厚度的阻力系數(shù)，與濾餅的結(jié)構(gòu)特性有關(guān)。 對(duì)于不可壓縮性濾餅，比阻值為常數(shù)，但對(duì)于可壓縮性濾餅， r B是操作壓力差的函數(shù)、一般可用下式表示： 由此可見(jiàn)濾餅的比阻值是隨操作壓力差的提高而增大的。因此開(kāi)始過(guò)濾時(shí)應(yīng)注意不能很快提高壓差，通?？恳褐淖匀粔翰钸M(jìn)料，并應(yīng)緩慢地逐步地升高壓力，一般在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，壓力差不要超過(guò)0.05M

13、Pa，最后的壓差(不包括榨濾)也不超過(guò)一0.4MPa。 恒壓下，可壓縮性濾餅的比阻值應(yīng)為常數(shù)。如過(guò)濾介質(zhì)的阻力相對(duì)較小可以忽略不計(jì)，那么恒壓下的過(guò)濾方程式如下：二、影響過(guò)濾速度的因素 菌種 發(fā)酵條件(培養(yǎng)基的組成，未用完培養(yǎng)基的數(shù)量，消沫油，發(fā)酵周期)。 過(guò)濾條件：壓力等 菌種對(duì)過(guò)濾速度影響很大。 真菌：菌絲粗大，容易過(guò)濾，不需特殊處理。濾渣呈緊密餅狀物，易從濾布上刮下，可采用鼓式真空過(guò)濾機(jī)過(guò)濾。 放線菌：菌絲細(xì)而分枝，交織成網(wǎng)絡(luò)狀，還含有很多多糖類(lèi)物質(zhì)，粘性強(qiáng)，重量比阻r B值高，過(guò)濾困難，一般需經(jīng)預(yù)處理，以凝固蛋白質(zhì)等膠體。 細(xì)菌：菌體更細(xì)小，過(guò)濾十分困難，如不用絮凝等方法預(yù)處理發(fā)酵液，往

14、往難以采用常規(guī)過(guò)濾的設(shè)備來(lái)完成過(guò)濾操作。1、菌種 培養(yǎng)基的組成對(duì)過(guò)濾速度影響也很大。 黃豆粉、花生餅作氮源、淀粉作碳源會(huì)使過(guò)濾困難。 舉例：a 、在鏈霉素發(fā)酵液的培養(yǎng)基中，加以黃豆粉代替玉米漿，那么比阻值增大倍。 b、 在青霉素發(fā)酵的培養(yǎng)基中，參加酵母蛋白，rB值也提高很多。 此外，發(fā)酵后期加消沫油或剩余大量末用完的培養(yǎng)基都會(huì)使過(guò)濾困難。2、培養(yǎng)基 正確選擇發(fā)酵終了時(shí)間對(duì)過(guò)濾影響很大。 在菌絲自溶前必須放罐，因?yàn)榧?xì)胞自溶后的分解產(chǎn)物很難過(guò)濾。 有時(shí)延長(zhǎng)發(fā)酵周期雖能使發(fā)酵單位有所提高，但嚴(yán)重影響發(fā)酵液質(zhì)量，使色素和膠狀雜質(zhì)增多、過(guò)濾困難，最終造成成品質(zhì)量降低。3、發(fā)酵時(shí)間三、改善過(guò)濾性能的方法

15、對(duì)于難過(guò)濾的發(fā)酵液，必須設(shè)法改善過(guò)濾性能、降低濾餅的比阻值，以提高過(guò)濾速度。 改善過(guò)濾性能的方法： 1、預(yù)處理發(fā)酵液。等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)變性、吸附以及凝聚和絮凝等方法。 2、參加助濾劑，直接在發(fā)酵液中形成填充一凝固劑。 3、酶解作用 助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，能使濾餅疏松，濾速增大。 常用的助濾劑：硅酸鹽粉末(硅藻土、紙漿、珠光石 (即珍珠巖，成分為二氧化硅。 要求：助濾劑必須不吸附或很少吸附生化物質(zhì)。1、參加助濾劑 參加方式： 1、在濾布上預(yù)先鋪一層助濾劑(12mm)，采用此種方法，會(huì)使濾速降低，但濾液透明度很快增加。 2、直接參加發(fā)酵液中。助濾劑用量假設(shè)等于懸浮液中固體含量時(shí)，濾速最快。

16、 反響劑相互作用，或和溶解性鹽發(fā)生反響，生成沉淀。能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)。 沉淀本身即可作為助濾劑，并且還能使膠狀物和懸浮物凝固。 正確選擇反響劑和反響條件，能使過(guò)濾速度提高310倍。2、參加反響劑舉例：新生霉素發(fā)酵液中參加氯化鈣和磷酸鈉，生成的磷酸鈣可作為填充凝固劑。一方面作為助濾劑，另一方面還可使某些蛋白質(zhì)凝固。環(huán)絲氨酸發(fā)酵液用氧化鈣和磷酸處理，生成的磷酸鈣沉淀，熊使懸浮物凝固。多余的磷酸根離子，還能除去鈣、鎂離子。 如果發(fā)酵液中有不溶解的多糖存在，那么最好用酶將它轉(zhuǎn)化為單糖，以提高過(guò)濾速度。 例如：萬(wàn)古霉素用淀粉作培養(yǎng)基，參加淀粉酶后，能使過(guò)濾速度加快。3、采用酶制劑分解黏

17、性物質(zhì) 發(fā)酵液染菌后，會(huì)含很多細(xì)菌菌體，雜質(zhì)也增多，造成過(guò)濾困難。 雜菌的種類(lèi)不同，對(duì)過(guò)濾的影響也不同。一般染霉菌尚可，染產(chǎn)氣桿菌那么很難過(guò)濾。 處理方法：升高溫度、增加純化劑用量、加助濾劑等。 舉例：四環(huán)素染菌發(fā)酵液可以采用加溫至40一50，增加黃血鹽、硫酸鋅用量，以正常批號(hào)的濾渣作為助濾劑等方法。4、染菌發(fā)酵液的處理方法 四、固液別離設(shè)備的選擇 不同性狀的發(fā)酵液應(yīng)選擇不同的固液別離設(shè)備。 常用別離設(shè)備：板框壓濾機(jī)，鼓式真空過(guò)濾機(jī)和心沉降別離機(jī)等。1、板框壓濾機(jī) 優(yōu)點(diǎn)：過(guò)濾面積大，過(guò)濾推動(dòng)力(壓力差)能較大幅度地進(jìn)行調(diào)整，并能耐受較高的壓力差，故對(duì)不同過(guò)濾特性的發(fā)酵液適應(yīng)性強(qiáng)，同時(shí)還具有結(jié)構(gòu)

18、簡(jiǎn)單，價(jià)格低，動(dòng)力消托少等優(yōu)點(diǎn)。 缺點(diǎn)：不能連續(xù)操作，設(shè)備笨重，勞動(dòng)強(qiáng)度大，衛(wèi)生條件差，非生產(chǎn)的輔助時(shí)間長(zhǎng)(包括解框、卸餅、洗濾餅，洗濾布，重新壓緊板框等)，阻礙了過(guò)濾效率的提高。 自動(dòng)板框過(guò)濾機(jī)： 是一種較新型的壓濾設(shè)備，板框的拆裝，濾渣的脫落卸出和濾布的清洗等操作都能自動(dòng)進(jìn)行，大大縮短了非生產(chǎn)的輔助時(shí)間和減輕了勞動(dòng)強(qiáng)度。 對(duì)于菌體較細(xì)小、粘度較大的發(fā)酵液，可參加助濾劑或采用絮凝等方法預(yù)處理后進(jìn)行壓濾。 對(duì)于難過(guò)濾的枯草桿菌發(fā)酵液，可設(shè)計(jì)一種特別薄的濾框以減小濾餅的阻力。 另外，也可采用帶有橡皮隔膜的壓濾機(jī)，過(guò)濾結(jié)束時(shí)，在濾板和橡皮膜之間通入壓縮空氣來(lái)壓札濾餅，將液體擠壓出來(lái)。常用技術(shù)措施2、鼓式真空過(guò)濾機(jī) 鼓式真空過(guò)濾機(jī)能連續(xù)操作，并能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制，但是壓差較小，主要適用于霉菌發(fā)酵液的過(guò)濾。而對(duì)菌體較細(xì)或粘稠的發(fā)酵液不太適用。 一種較好的解決方法是，過(guò)