環(huán)境課件】第三章環(huán)境毒理學(xué)的基本研究方法

1、第三章 環(huán)境毒理學(xué)的基本研究方法毒理學(xué)試驗(yàn)調(diào)查研究毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ) 研究方法 流行病學(xué)研究 受控的臨床研究 毒理學(xué)體內(nèi)試驗(yàn) 毒理學(xué)體外試驗(yàn)優(yōu)點(diǎn) 真實(shí)的暴露條件 規(guī)定的限定暴露條 易于控制暴露條件 影響因素少，易于控 在各化學(xué)物之間發(fā)生相 在人群中測定反應(yīng) 能測定多種效應(yīng) 制 互作用 對某組人群(如哮喘) 能評價(jià)宿主特征的作用 可進(jìn)行某些深入的研 測定在人群的作用 的研究是有力的 (如：性別、年齡、遺 究(如：機(jī)制，代謝) 表示全部的人敏感性 能測定效應(yīng)的強(qiáng)度 傳特征等和其他調(diào)控因 人力物力花費(fèi)較少 素飲食等) 能評價(jià)機(jī)制缺點(diǎn) 耗資、耗時(shí)多 耗資多 動物暴露與人暴露相關(guān) 不能全面反映毒作用 多為回

2、顧性，無健康 較低濃度和較短時(shí) 的不確定性 不能作為毒性評價(jià)和 保護(hù) 間的暴露 受控的飼養(yǎng)條件與人的 危險(xiǎn)性評價(jià)的最后依 難以確定暴露，有混雜 限于較少量的人群 實(shí)際情況不一致 據(jù) 暴露問題 (一般50) 暴露的濃度和時(shí)間的模 難以觀察慢性毒作用 可檢測的危險(xiǎn)性增加必 限于暫時(shí)、微小、 式顯著地不同于人群的 需達(dá)到2倍以上 可逆的效應(yīng) 暴露 測定指標(biāo)較粗(發(fā)病率， 一般不適于研究最 死亡率) 敏感的人群 毒理學(xué)研究方法的優(yōu)缺點(diǎn)1 實(shí)驗(yàn)動物和人對外源化學(xué)物的反應(yīng)敏感 性不同，有時(shí)甚至存在著質(zhì)的差別2 高劑量向低劑量外推的不確定性3 小數(shù)量實(shí)驗(yàn)動物到大量人群外推的不確 定性4 成年健康動物向年老體

3、弱及患病個體外 推的不確定性實(shí)驗(yàn)動物的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)資料外推到人群接觸的安全性時(shí)的不確定性1 化學(xué)物在實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生的作用，可以外推 于人?；炯僭O(shè) 人是最敏感的動物物 種；人和實(shí)驗(yàn)動物的生物學(xué)過程與體重 (或體表面積)相關(guān)。2 實(shí)驗(yàn)動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對 人潛在危害的必需的和可靠的方法。 3 成年的健康(雄性和雌性未孕)實(shí)驗(yàn)動物和 人可能的暴露途徑是基本的選擇。描述毒理學(xué)試驗(yàn)的基本原則1 受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì) 2 劑量反應(yīng)(效應(yīng))研究 3 確定毒作用的靶器官 4 確定損害的可逆性 毒理學(xué)毒性評價(jià)試驗(yàn)的基本目的實(shí)驗(yàn)動物（laboratory animal）指經(jīng)人工培育，對其攜帶微生物實(shí)

4、行控制，遺傳背景明確，來源清楚，可用于科學(xué)研究的動物。實(shí)驗(yàn)動物的選擇實(shí)驗(yàn)動物的選擇物種選擇 選擇對外液化學(xué)物的毒性反應(yīng)及代謝特點(diǎn)與人類接近的物種；選擇自然壽命不太長的物種；選擇易于飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作的物種；選擇經(jīng)濟(jì)并易于獲得的物種。 近交系動物 連續(xù)20代以上兄妹交配或親子交配培育突變系動物 突變的基因可世代相傳并保持遺傳基因特性雜交群動物 兩個不同近交系之間有目的進(jìn)行交配，所產(chǎn)生的第一代動物， 亦稱雜交一代動物。封閉群動物 5年以上不從外部引進(jìn)新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所保存繁殖的動物群 實(shí)驗(yàn)動物的選擇品系選擇無菌動物 體內(nèi)外均無任何微生物和寄生蟲無特定病原體動物（SPF）體內(nèi)無特定微生

5、物和寄生蟲存在的動物(無傳染病)。飼養(yǎng)于封閉的系統(tǒng)。清潔動物 與SPF的不同：抗體檢查常有腦脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒等抗體滴度，但不應(yīng)有臨床癥狀、病理改變及自然死亡。飼養(yǎng)在半屏蔽系統(tǒng)。微生物控制的選擇實(shí)驗(yàn)動物的選擇個體選擇 1 年齡2 性別 3 生理狀態(tài) 4 健康狀況 實(shí)驗(yàn)動物的選擇 品 系周齡 Wistar SD雌性雄性雌性雄性 354565052 4919786101 5134134130150 6166187172206 7209233210262 8214297240318 923232525836510246370272399大鼠體重與周齡的關(guān)系 小鼠體重與周齡的關(guān)系 品 系 周齡 昆

6、明 BALB/c C57BL/6 615 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 01.95 2.10 1.40 1.46 1.40 1.44 1.58 1.58 15.54 5.82 3.35 3.50 3.42 3.50 4.64 4.64 27.90 8.35 5.50 5.60 5.55 5.60 7.96 7.96 313.55 14.80 7.32 7.40 6.40 6.90 9.83 9.83 421.35 22.6011.6012.4512.2012.5715.7519.00 527.90 33.2514.7516.1016.9018.1020.7522.58 632

7、.80 39.2515.6017.4018.4020.5021.8825.96 734.70 39.9016.1018.6519.0021.6023.1227.96 834.80 40.0518.1620.2520.2522.4024.1628.831 未處理對照組(空白對照組)：本底值， 質(zhì)量控制2 陰性(溶劑賦形劑)對照：與染毒組比 較的基礎(chǔ) 3 陽性對照：檢測試驗(yàn)體系的有效性4 歷史性對照：檢查試驗(yàn)體系的穩(wěn)定性， 即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和保證 毒理學(xué)試驗(yàn)常用對照 對各個毒理學(xué)試驗(yàn)應(yīng)該用同一種、同一批號受 試物 受試物成分和配方必須固定 如是異構(gòu)體混合物，異構(gòu)體比例必須固定 活性成分的百分含

8、量和可檢測的雜質(zhì)的濃度也 應(yīng)固定 受試物在貯存期內(nèi)穩(wěn)定性和在飼料中的穩(wěn)定性 必須進(jìn)行研究并報(bào)告 受試物應(yīng)一次備齊全部實(shí)驗(yàn)的用量受試樣品毒理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求 隨機(jī)、重復(fù)、對照原則 對常規(guī)毒理學(xué)試驗(yàn)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料：一般用t檢驗(yàn)或ANOVA 記數(shù)資料：卡方檢驗(yàn)毒理學(xué)試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)1 處理組與對照組比較差別有無顯著性 2 有無劑量-反應(yīng)關(guān)系3 是否伴有其他相關(guān)參數(shù)的改變4 是否在 “正?！敝捣秶?實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷第一節(jié) 急性毒性試驗(yàn)一、急性毒性試驗(yàn)的目的： 1、確定供試化學(xué)物急性毒性的劑量反應(yīng)關(guān)系和中毒特征； 2、求LD50或LC50,為急性毒性評價(jià)提供依據(jù)。 3、研究毒物的毒動學(xué)和毒效

9、學(xué)過程。表示急性毒性大?。?LD50(對受試物的個體感受性影響較小，有更高的重現(xiàn)性)二、試驗(yàn)程序與評價(jià) 1動物選擇：首選受試物在體內(nèi)代謝情況與人體內(nèi)相近的或?qū)κ茉囄镒蠲舾械钠废怠?一般：以哺乳動物為主，常用大鼠、小鼠； 經(jīng)皮：兔、豚鼠、豬 應(yīng)對兩種性別、成年和幼年動物進(jìn)行測定。 選擇兩種以上的實(shí)驗(yàn)動物，最好一為嚙齒類，一為非嚙齒類。(目的：核對種間差異) 2染毒途徑與方式： 一般與人的接觸途徑相同。 (1)經(jīng)口染毒：常用灌胃法，也可將受試物放在飲水中由動物自由攝取。 (2)經(jīng)呼吸道染毒： 將實(shí)驗(yàn)動物放在有毒氣或粉塵的染毒柜內(nèi)進(jìn)行染毒。急性吸入染毒采用靜式染毒瓶(柜)，染毒24h。 (3)經(jīng)皮膚

10、染毒：主要用于化學(xué)物經(jīng)皮(或粘膜)吸收所引起的急性毒性。正式給藥前24h，背部脫毛，勿傷皮膚。將受試物均勻涂布于皮膚表面，用紗布覆蓋，共敷24h。3試驗(yàn)程序： （1）劑量與分組 預(yù)試驗(yàn)：找出受試物大致致死量范圍(死亡率為10%90%)；例：欲做化合物A的經(jīng)口預(yù)試驗(yàn)。 化合物B的化學(xué)結(jié)構(gòu)與A相似，已知B的=LD50 =40(預(yù)期毒性中值)。 則預(yù)試驗(yàn)取2.5、10、40、160、640 (上下各推12組，組距應(yīng)較大，初始4倍差) 求LD50正式試驗(yàn)：在LD100與LD0之間設(shè)57個劑量組。 組距(對數(shù)) 或 式中：n-設(shè)計(jì)的劑量組數(shù)（2）癥狀觀察 時(shí)間：24h或兩周內(nèi)的反應(yīng)三、 LD50的計(jì)算與

11、結(jié)果評價(jià) 計(jì)算方法：概率單位法和寇氏法。 LD50值愈小，毒性愈大。 概率單位法存在正態(tài)曲線關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)差d=(x-)/ 式中：x劑量對數(shù)； 劑量對數(shù)均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差d=0，左邊面積(死亡率)為50，右邊面積(存活率)50 d=1，死亡率為84.13，d=2，死亡率為97.73,d2，死亡率接近100。d=一1，死亡率為15.87。d=一2，死亡率為2.27。d一3，死亡率接近0。從上表，可以任一死亡率換算為相應(yīng)的概率單位。A：劑量對數(shù)死亡百分率B：劑量對數(shù)概率單位LC50計(jì)算步驟如下： a.根據(jù)死亡率查概率單位(死亡率為100或0不計(jì))b.繪圖求回歸方程。c.求y=5的濃度對數(shù)（m），其反對數(shù)

12、即為LC50y=2.78x-2.76同理可得LC5、 LC10、d.求LC50的可信限 先求LC50的標(biāo)準(zhǔn)誤差(Sm)： S(校準(zhǔn)差)=1/k 本例中：S=1/2.78 平均致死量法（又名寇氏法） 試驗(yàn)要求：每個試驗(yàn)組動物數(shù)相同；各組劑量按等比級數(shù)分組；最大劑量的死亡率最好為100或與之接近，最小劑量的死亡率最好為0或與之接近。式中：Xm最大劑量的對數(shù)值；i相鄰劑量比值的對數(shù)； 各組死亡率的總和（以小數(shù)表示）。例小鼠腹腔注射致百蟲急性毒性試驗(yàn)結(jié)果如下表所示，求 LD50式中：p一個組死亡率；q一個組存活率；i相鄰劑量比值的對數(shù)；h各組動物數(shù)。第二節(jié) 亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)一、蓄積試驗(yàn)及其方法：（

13、一）蓄積作用：某些物質(zhì)以較小劑量反復(fù)作用于機(jī)體，可使機(jī)體對該物質(zhì)的反應(yīng)性增強(qiáng)，即一次染毒不引起明顯中毒反應(yīng)或死亡的劑量，經(jīng)分次重復(fù)染毒后，可引起明顯中毒或死亡，此種現(xiàn)象稱為蓄積作用(accumulation)?？煞謨煞N： 物質(zhì)蓄積：毒物在體內(nèi)的排出量小于進(jìn)入量，以致毒物在體內(nèi)的貯留量增多為物質(zhì)蓄積； 功能蓄積：毒物進(jìn)入機(jī)體后，并未發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)明顯貯留，但可引起機(jī)體功能改變的逐漸累積，導(dǎo)致對該毒物的反應(yīng)性增強(qiáng)。 耐受性(tolerance)：機(jī)體多次接觸化學(xué)物質(zhì)后對該物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)性減弱的現(xiàn)象，顯示不易發(fā)生慢性中毒。 （二）蓄積作用的測定方法 有多種，常用蓄積系數(shù)法。 蓄積系數(shù)(accumulati

14、on coefficient)K： ED50(n) 多次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)某種效應(yīng)的總劑量; ED50(1) 一次染毒引起同一效應(yīng)半數(shù)效量。若以死亡為毒效應(yīng)指標(biāo)，上式為K越小，受試化合物的蓄積毒性越大。K蓄積作用強(qiáng)度1高度蓄積13明顯蓄積35中度蓄積5輕度蓄積 1固定劑量法 ：固定每天染毒劑量為1/201/5 LD50，連續(xù)染毒，直至實(shí)驗(yàn)動物半數(shù)死亡。如果染毒劑量累計(jì)已達(dá)5個LD50 動物死亡仍末達(dá)半數(shù)，實(shí)驗(yàn)均可告結(jié)束，計(jì)算蓄積系數(shù)，作出評價(jià)。 2遞增劑量法 ：先測定LD50（1），然后對另一組動物每天染毒，以4天為一期，開始給予0.1LD50。以后每期按1.5倍遞增劑量，直至動物半數(shù)死亡，或

15、實(shí)驗(yàn)已達(dá)28天，可結(jié)束實(shí)驗(yàn)，計(jì)算系數(shù)。 3. 二十天試驗(yàn)法 ：選用大鼠或小鼠每個劑量組雌雄各10只，以1/2、l/5、1/10、1/20 LD50分別對每組進(jìn)行染毒，每日1次，共20天。如l/20LD50組動物有死亡，且有劑量反應(yīng)關(guān)系，則有較強(qiáng)蓄積作用；如1/20 LD50組無死亡，則為弱蓄積。蓄積系數(shù)的測定二、亞慢性毒性作用及其試驗(yàn)方法：1、目的：確定化學(xué)物亞慢性毒性的閾劑量和NOEL。2、試驗(yàn)期限：3-6月； 呼吸道吸收：30-90天； 皮膚毒性：30天。3、試驗(yàn)動物的選擇、飼養(yǎng)環(huán)境及染毒途徑： 試驗(yàn)動物選擇：對受試化學(xué)物敏感的物種或品系； 環(huán)境：營養(yǎng)合理，飲水清潔、充足、溫、光、濕適宜；

16、 染毒途徑：盡量模擬人類在環(huán)境中接觸受試化學(xué)物的途徑，與急性毒性試驗(yàn)相似。4、劑量選擇與分組 劑量：180I50LD50，對于在體內(nèi)不產(chǎn)生蓄積作用而排泄又快的物質(zhì)可適當(dāng)加大劑量，反之則可減少劑量。 設(shè)34個實(shí)驗(yàn)組和1個對照組。 實(shí)驗(yàn)組要求：在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí) 最低劑量組不產(chǎn)生可觀察到的毒性反應(yīng)； 最高劑量組能引起明顯毒性反應(yīng)，但不引起死亡； 中間劑量組產(chǎn)生輕微毒性反應(yīng)。5、癥狀觀察一般性指標(biāo)(非特異) 一般綜合性指標(biāo)： 動物體重增長率、食物消耗率、活動能力等。 一般化驗(yàn)性指標(biāo)：主要指血和肝、腎功能的檢測。(2)特異指標(biāo)： 測定特異性反應(yīng)。 更確切闡明該物質(zhì)的閾劑量(濃度)及無作用劑量(濃度)。(3)

17、 病理組織學(xué)檢查： 實(shí)驗(yàn)中死亡動物的病理檢查及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的尸檢。三、慢性毒性作用及其試驗(yàn)方法1、目的：評價(jià)化學(xué)物在長期小劑量作用的條件下對機(jī)體產(chǎn)生的損害及其特點(diǎn)確定閾劑量和最大無作用劑量。2、試驗(yàn)方法：（1） 動物選擇、染毒方法、觀察指標(biāo)等與亞慢性毒性試驗(yàn)相似；（2）染毒期限：1-2年或終身染毒，也有人提出6月。（3）劑量分組： 3個染毒組和一個對照組。 高劑量組：1/51/2亞慢性試驗(yàn)閾值； 中間劑量：1/501/10； 低劑量組：1/100。第四節(jié) 致突變實(shí)驗(yàn)一、目的 確定外源化學(xué)物對生物體是否具有致突變作用。 基因點(diǎn)突變試驗(yàn)、染色體畸變試驗(yàn)、DNA損傷試驗(yàn)。二、供試生物： 微生物、動物細(xì)

18、胞、昆蟲、動物或植物三、試驗(yàn)方法 體外基因突變試驗(yàn)、細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)、體內(nèi)基因突變試驗(yàn)、DNA損傷試驗(yàn)（一）體外基因突變試驗(yàn)1、Ames試驗(yàn)（鼠傷寒沙門氏菌/動物肝細(xì)胞微粒體試驗(yàn)） （1）原理： 利用一種突變微生物菌株與被檢測化學(xué)物接觸，使突變型微生物回復(fù)突變，重新成為野生型微生物。 突變型微生物不具備合成組氨酸的能力，不能在不含（或低濃度）組氨酸培養(yǎng)基上生長。（2）方法： 將突變型沙氏菌在不含（或低濃度）組氨酸培養(yǎng)基上培養(yǎng),以其生長狀況作為指標(biāo)。 在培養(yǎng)基中加入哺乳動物的肝細(xì)胞微粒體：提高靈敏度。（3）特點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)： 簡便、靈敏、快速（48h）、費(fèi)用低； 檢測結(jié)果與對動物的致癌性的相符率達(dá)約9

19、0%。 缺點(diǎn)： 利用微生物作為供試物，不能全面反映哺乳動物的遺傳信息，僅1/6； 微生物的DNA修復(fù)系統(tǒng)與動物有差異； 微生物無免疫功能。 2、哺乳動物體細(xì)胞突變試驗(yàn) （1）方法原理與微生物突變類似。 常用的細(xì)胞株： 中國地鼠肺細(xì)胞V79 中國地鼠肺卵巢細(xì)胞(CHO） 小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞株。V79、CHO細(xì)胞株正常細(xì)胞：缺乏利用嘌呤堿的酶HGPRT，不能在加入類嘌呤堿類物質(zhì)的培養(yǎng)基上生長；突變細(xì)胞：可在加入類嘌呤堿類物質(zhì)的培養(yǎng)基上生長。L5178Y突變細(xì)胞株正常細(xì)胞：缺乏胸苷激酶（TK），不可在含有細(xì)胞毒物5-溴脫氧尿苷的培養(yǎng)基上生長。突變細(xì)胞：可在此種培養(yǎng)基上生長。（二）細(xì)胞遺傳學(xué)試

20、驗(yàn)染色體畸變試驗(yàn)： 直接在顯微鏡下觀察染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的改變情況。生殖細(xì)胞或體細(xì)胞、體外或體內(nèi)試驗(yàn)。 體外：CHO細(xì)胞: 分裂快、數(shù)目適中、形態(tài)清晰；人類外周血淋巴細(xì)胞 體內(nèi)：受試動物骨髓細(xì)胞或其他（胸腺、脾、精原細(xì)胞）染色體畸變率的變化。（1）試驗(yàn)方法： a. 體外培養(yǎng)： CHO細(xì)胞或人類外周血淋巴細(xì)胞與化學(xué)物，在細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM, RPM, 1640或1999）中，370C下培養(yǎng)24h(CHO)或72h(人類細(xì)胞）。觀察前2h加入秋水仙堿（中期分裂阻斷劑），制片，鏡檢觀察。 b. 體內(nèi)染色體畸變分析：大鼠、小鼠，染毒飼養(yǎng)，觀察骨髓細(xì)胞染色體畸變情況。第四節(jié) 環(huán)境流行病學(xué)方法一、概念和特

21、點(diǎn)：流行病學(xué)：研究特定人群中有關(guān)健康的狀態(tài)和事件的分布以及影響這些分布的決定因素；環(huán)境流行病學(xué)：應(yīng)用流行病學(xué)的原理和方法，重點(diǎn)研究人們在生活和工作環(huán)境中各種因素與人群健康的關(guān)系。 一般流行病學(xué)研究的內(nèi)容是疾病在人群中的分布，它要回答三個問題： (1)疾病在時(shí)間、地點(diǎn)、不同人群中是怎樣分布的? (2)什么因素是該病的主要決定因素? (3)怎樣控制該病的流行?環(huán)境流行病學(xué)除了上述一般內(nèi)容，還有它本身的特點(diǎn)。 (1)它不僅研究疾病的分布規(guī)律，而且更經(jīng)常地研究疾病前的狀態(tài)，即包括無異常健康)、微弱的功能改變、疾病的前期(亞臨床狀態(tài))等各種健康狀況，揭示環(huán)境污染或某些微量元素的健康效應(yīng)。 (2)環(huán)境流行

22、病學(xué)研究的暴露因素主要是理化因素。已知暴露因素，研究其對健康的影響；環(huán)境毒理學(xué)工作者所進(jìn)行的大量工作就屬于這種。例如金屬冶煉廠鉛污染大氣對居民健康影響，磷肥廠氟污染大氣對居民健康影響的調(diào)查等。出現(xiàn)健康異常，追究引起異常的暴露因素，這屬于探討病因的研究。例如，近年來我國學(xué)者對于鼻咽癌、食道癌病因的研究，對克山病、大骨節(jié)病病因的研究，均屬于此種類型。日本的水誤病和痛痛病的病因是重金屬污染造成的公害病領(lǐng)域里的研究成果，影響深遠(yuǎn)。 (3) 環(huán)境流行病學(xué)研究的最終日的是為消除污染、改造環(huán)境、保護(hù)居民健康服務(wù)。 (4)直接以人群為研究對象，研究結(jié)果最具有說服力。二、環(huán)境流行病學(xué)研究的內(nèi)容 環(huán)境流行病學(xué)主要研究兩方面的內(nèi)容一是暴露，二是健康；同時(shí)還要研究二者的聯(lián)系。 (一) 暴露測量： 環(huán)境暴露水平是人群接觸的環(huán)境因素的平均水平，是通過對環(huán)境因子在環(huán)境中的時(shí)空分布的實(shí)測結(jié)果求出的平均值。 暴露水平是估算人體接觸劑量的依據(jù)，因此要求測量結(jié)果精確、可靠、有