細胞生物學(xué)實驗材料

1、實驗一 熒光顯微鏡的原理和使用實驗二 葉綠體的分離與熒光觀察實驗三 線粒體的活體染色與觀察實驗四 細胞膜的通透性實驗五 DNA的細胞化學(xué)Feulgen反應(yīng)實驗六 植物染色體標本的制備和觀察實驗七 細胞計數(shù)實驗八 植物細胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察實驗九 植物原生質(zhì)體的分離和活性鑒定實驗十 環(huán)境因素誘變?nèi)旧w改組的觀察 實驗一 熒光顯微鏡的原理和使用一、實驗?zāi)康牧私鉄晒怙@微鏡的構(gòu)造及其維護方法；掌握熒光顯微鏡的使用方法和使用中的注意事項。二、實驗原理圖1 熒光顯微鏡熒光顯微鏡是選擇由高壓汞燈或類似光源發(fā)出一定波長的激發(fā)光，激發(fā)標本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，觀察細胞某種特異成分的分布狀態(tài)的

2、顯微鏡。與普通光學(xué)顯微鏡一樣，熒光顯微鏡也有物鏡、目鏡、調(diào)焦裝置、光源、聚光器、載物臺、鏡身等組成部分。所不同的是，熒光顯微鏡增加了激發(fā)光源和濾片系統(tǒng)，它投射到樣品上的是特定波長的激發(fā)光而不是普通的可見光。在激發(fā)光的作用下，樣品中的熒光物質(zhì)產(chǎn)生發(fā)射光（即熒光）。因此，熒光顯微鏡觀察到的是樣品中能產(chǎn)生熒光的部分所呈現(xiàn)的熒光映象，普通光學(xué)顯微鏡則是整個樣品的可見光透射和折射影像。某些物質(zhì)在定短波長的光（如紫外光）的照射下吸收光能進入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，就能在極短的時間內(nèi)放射出比照射光波長更長的光(如可見光)，這種光就稱為熒光。若停止供能熒光現(xiàn)象立即停止。有些生物體內(nèi)的物質(zhì)受激發(fā)光照射后直接

3、發(fā)出熒光，稱為自發(fā)熒光（或直接熒光），如葉綠素的火紅色熒光和水質(zhì)素的黃色熒光等。有的生物材料本身不發(fā)熒光，但它吸收熒光染料后同樣也能發(fā)出熒光，這種熒光稱為次生熒光（或間接熒光），如葉綠體吸附吖啶橙后可發(fā)桔紅色熒光。利用熒光顯微鏡對可發(fā)熒光物質(zhì)進行檢測時，將受到許多因素的影響，如溫度、光、淬滅劑等。因此在熒光觀察時應(yīng)抓緊時間，有必要時立即拍照。三、實驗用品熒光顯微鏡、鑷子、載玻片、蓋玻片、解剖刀、0.01%吖啶橙染色液（acridine orange）、蒸餾水、水葫蘆葉片四、實驗內(nèi)容與方法（一）熒光顯微鏡的構(gòu)造1、基本裝置熒光顯微鏡的基本裝置是由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件（如熒光光源 、激發(fā)濾片

4、、二向色鏡和阻斷濾片等）的基礎(chǔ)上組成的。熒光光源一般采用高壓汞燈（50-200W），它可發(fā)出各種波長的光，但每種熒光物質(zhì)都有一個產(chǎn)生最強熒光的激發(fā)光波長 ，所以需加用激發(fā)濾片（一般有紫外、紫色、藍色和綠色激發(fā)濾片），僅使一定波長的激發(fā)光透過照射到標本上，而將其他光都吸收掉。每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在極短時間內(nèi)發(fā)射出較照射波長更長的可見熒光。熒光具有專一性，一般都比激發(fā)光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷（或壓制）濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛，二是選擇并讓特異的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。2、光路熒光顯微鏡就

5、其光路來分有兩種： 透射式熒光顯微鏡：激發(fā)光源是通過聚光鏡穿過標本材料來激發(fā)熒光的。常用暗視野集光器，也可用普通集光器，調(diào)節(jié)反光鏡使激發(fā)光轉(zhuǎn)射和旁射到標本上這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點是低倍鏡時熒光強，而缺點是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱所以對觀察較大的標本材料較好。圖2 落射式光路 落射式熒光顯微鏡：這是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡，與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上一個二向色鏡，它與光鈾呈45°角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時進入物鏡，返回到二

6、向色鏡，使激發(fā)光和熒光分開，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片二向色鏡阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈強。（二）熒光顯微鏡的使用1、使用方法：熒光顯微鏡使用時，一般先用普通的低壓光源觀察樣品，確定了觀察的部位后，再切換至激發(fā)光觀察熒光，如配有照相裝置還可進行顯微攝影。 接通電源，按壓穩(wěn)壓器按鈕，使汞燈點亮；推上擋光板，濾片轉(zhuǎn)換撥桿調(diào)至“O”，打開底座白光光源；裝片放上載物臺，用低倍至高倍白光觀察，將需觀察的樣品置于光圈中央；關(guān)上底座光源，濾片轉(zhuǎn)換撥桿調(diào)至“B”，推開擋光板，觀察樣品發(fā)出的熒光。2、注

7、意事項： 最好在暗室中進行檢驗。汞燈接通電源后需要1015 min預(yù)熱，汞才能充分汽化并形成汞弧，產(chǎn)生高亮度而穩(wěn)定的激發(fā)光。待光源發(fā)出強光并穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開始觀察標本。 檢查時間以一次12 h為宜，如果超過90 min，高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受激發(fā)光照射35 min后，標本熒光也明顯減弱，因此在使用激發(fā)光與可見光觀察之間轉(zhuǎn)換或暫停觀察時，可拉動擋光板阻擋光線；標本染色后立即觀察，時間久了熒光會逐漸減弱。 高壓汞燈達到最大發(fā)光效率后，燈箱會發(fā)燙，操作需注意避免燙傷；燈箱上端為散熱口，一定不能放置物品。 汞燈的使用壽命一般只有100 h，使用得當(dāng)可達150 h，使用

8、壽命與開關(guān)的次數(shù)成反比，標本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間，保護光源。天熱時，應(yīng)打開電扇或空調(diào)散熱降溫。換新燈泡應(yīng)從開始使用就記錄時間。 關(guān)掉汞燈電源后，必須等待1520 min待汞燈自然冷卻后才可再次接通電源，違反這一操作規(guī)定時，將會造成嚴重后果?。ㄝp則燒斷保險絲或燒毀汞燈電源中的扼流圈，重則汞燈爆炸）一天中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源。（三）簡易熒光標本制作與觀察1、裝片制作用鑷子撕取水葫蘆葉片表皮（帶綠色）置于載片上，滴加12滴蒸餾水或吖啶橙染液，加蓋片后置顯微鏡下觀察。 在普通光鏡下觀察。 在熒光顯微鏡下觀察自發(fā)熒光和次生熒光。2、實驗結(jié)果（1）在普通光鏡下可以看到兩種細胞 保衛(wèi)細胞：為構(gòu)成氣孔的成對存

9、在的腎形細胞。 葉肉細胞：為排成柵狀的長方形和橢圓形細胞。 葉綠體呈綠色橄欖形，在高倍鏡下還可以看到綠色的基粒。 （2）在熒光顯微鏡下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光，但其熒光強度要比游離葉綠體弱。氣孔發(fā)綠色熒光，兩保衛(wèi)細胞內(nèi)的火紅色葉綠體則環(huán)繞氣孔排列成一圈。表皮細胞內(nèi)葉綠體數(shù)量要比葉肉細胞少。（3）用吖啶橙染色后，葉綠體則發(fā)出枯紅色熒光，細胞核可發(fā)出綠色熒光，氣孔仍為綠色。圖3 普通光鏡下的保衛(wèi)細胞和葉肉細胞 圖4 熒光顯微鏡觀察到的葉肉細胞五、思考題1、在熒光顯微鏡下觀察葉綠體的自發(fā)熒光時，更換濾片系統(tǒng)，葉綠體的顏色是否有變化? 2、普通光鏡與熒光顯微鏡有何異同點? 實驗二 葉綠體的分離與熒光觀察

10、一、實驗?zāi)康?、通過植物細胞葉綠體的分離，了解細胞器分離的一般原理和方法。2、觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光并熟悉熒光顯微鏡的使用方法。二、實驗原理葉綠體是植物細胞所特有的能量轉(zhuǎn)換細胞器，光合作用就是在葉綠體中進行的。由于具有這一重要功能，所以它一直是細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的重要研究對象。葉綠體是植物細胞中較大的一種細胞器，利用低速離心即可分離集中進行各種研究。將組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進行差速離心，是分離細胞器的常用方法，一個顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離心力以及懸浮介質(zhì)的粘度有關(guān)。在一給定的離心場中，同一時間內(nèi)，密度和大小不同的顆粒其沉降速度不同。依

11、次增加離心力和離心時間，就能夠使非均一懸浮中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，分批收集即可獲得各種亞細胞組分。差速離心是利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，使一個非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級分離出所需要的物質(zhì)。差速離心的分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。例如用差速離心法分離已破碎的細胞各組份。葉綠體的分離應(yīng)在等滲溶液(0.35

12、mol/L氯化鈉或0.4mol/L蔗糖溶液)中進行，以免滲透壓的改變使葉綠體受到損傷。分離過程最好在 05的條件下進行，如果在室溫下，要迅速分離和觀察。三、實驗用品普通離心機、攪拌機、粗天平、熒光顯微鏡、250 ml燒杯、50 ml燒杯、200ml量筒、滴管、10 ml刻度離心管、玻棒、紗布、載玻片、蓋玻片、新鮮韭菜、0.35mol/L氯化鈉、0.01%吖啶橙、蒸餾水四、實驗內(nèi)容與方法1、選取新鮮的韭菜葉，洗凈擦干后去除葉梗，稱30 g于150 ml0.35 mol/L NaCl 溶液中，裝入攪拌機。2、利用攪拌機2檔（10000r/min）勻漿30 s。 3、將勻漿用8層紗布過濾于250 m

13、l燒杯中。4、取濾液8ml 在1000r/min 下離心2min，棄去沉淀。5、將上清液在 3000r/min 下離心 5 min，棄去上清液，沉淀即為葉綠體(混有部分細胞陔)。 6、將沉淀用15 ml的0.35mol/L NaCl 溶液懸浮。 7、取葉綠體懸液一滴于載片上，另取葉綠體懸液一滴滴在載片上，再滴加一滴 0.01%吖啶橙熒光染料，加蓋片后即可在普通光鏡和熒光顯微鏡下觀察。 在普通光鏡下觀察。 在熒光顯微鏡下觀察。 8、實驗結(jié)果圖5 葉綠體的自發(fā)熒光 普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。 在選用B(blue)激發(fā)濾片，B雙色鏡

14、和O530(orange)阻斷濾片的條件下， 葉綠體發(fā)出火紅色熒光。 加入吖啶橙染色后，葉綠體可發(fā)出桔紅色熒光，而其中混有的細胞核則發(fā)綠色熒色。五、思考題1、游離葉綠體和整體細胞內(nèi)的葉綠體，在熒光顯微鏡下，其顏色和強度有無差異？2、兩次離心第一次去掉沉淀，第二次去掉上清液，分別去掉的是什么物質(zhì)？3、葉綠體分離的實驗原理是什么？在分離葉綠體時應(yīng)注意些什么問題？ 實驗三 線粒體的活體染色與觀察一、實驗?zāi)康?、觀察動、植物活細胞內(nèi)線粒體的形態(tài)、數(shù)量與分布。2、學(xué)習(xí)一些細胞器的超活染色技術(shù)。二、實驗原理活體染色是指對生活有機體的細胞或組織能著色但又無害毒的一種染色方法。它的目的是顯示生活細胞內(nèi)的某些結(jié)

15、構(gòu)，而不影響細胞的生命活動和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以致引起細胞的死亡?；钊炯夹g(shù)可用來研究生活狀態(tài)下的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法的不同，通常把活體染色分為體內(nèi)活染與體外活染兩類。體內(nèi)活染是以膠體狀的染料溶液注入動、植物體內(nèi)，染料的膠粒固定、堆積在細胞內(nèi)某些特殊結(jié)構(gòu)里，達到易于識別的目的。體外活染又稱超活染色，它是由活的動、植物分離出部分細胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色?；铙w染料之所以能固定、堆積在細胞內(nèi)某些特殊的部分，主要是染料的“電化學(xué)”特性起重要作用。堿性染料的膠粒表面帶陽離子，酸性染料的膠粒表現(xiàn)帶有陰離子，而被染的部

16、分本身也是具有陰離子或陽離子，這樣，它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作為活體染色劑之用，應(yīng)選擇那些對細胞無毒性或毒性極小的染料，而且總是要配成稀淡的溶液來使用。一般足以堿性染料最為適用，可能因為它具有溶解在類脂質(zhì)(如卵磷脂、 膽固醇等)的特性，易于被細胞吸收。線粒體是細胞內(nèi)的一個重要細胞器，是細胞進行呼吸作用的場所。細胞的各項活動所需要的能量，主要是通過線粒體呼吸作用來提供的。不同細胞中線粒體的形態(tài)和數(shù)目不同。線粒體的數(shù)目與細胞類型和細胞的生理狀態(tài)有關(guān)，線粒體多聚集在細胞生理功能旺盛的區(qū)域。詹納斯綠B（Janus green B）對線粒體具有專一性的染色，是毒性最小的堿性染料

17、。Janus green B 染色是由于線粒體中的細胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)，呈藍綠色，而周圍的細胞質(zhì)被還原成無色的色基。三、實驗用品洋蔥鱗莖、新鮮豬肝、普通光學(xué)顯微鏡、凹面載玻片、鑷子、剪刀、載玻片、蓋玻片、培養(yǎng)皿、滴管、解剖刀1、Ringer溶液： 氯化鈉 8.5g （變溫動物用 6.5g） 氯化鈣 0.12g 碳酸氫鈉 0.20g 氯化鉀 0.14g 磷酸氫二鈉 0.01g 葡萄糖 2.0g 加蒸餾水 至1000ml 2、1%1/5000 詹納斯綠B（Janus green B）溶液 稱取0.5g 詹納斯綠B溶于50 ml Ringer溶液中，稍加熱（3040）使之很

18、快溶解，用濾紙過濾，即成1%原液。臨用前，取1%原液，加入49 ml Ringer溶液混勻，即成1/5000工作液，裝入棕色瓶備用，以保持它的充分氧化能力。四、實驗內(nèi)容與方法（一） 動物細胞線粒體活體染色的觀察1、取樣染色：取豬肝邊緣較薄的肝組織一小塊，放入盛有Ringer液的培養(yǎng)皿內(nèi)，用吸管吸取Ringer液，反復(fù)浸泡沖洗肝臟，洗去血液。 圖6 肝細胞線粒體活體染色2、在干凈的凹面載玻片的凹穴中滴加 1/5000 詹納斯綠 B（Janus green B）溶液，再將肝組織塊移入染液，但不可將組織塊完全浸沒，要讓組織上面部分半裸露在外面，這樣細胞內(nèi)的線粒體酶系可充分得到氧化，易被染色。當(dāng)組織塊

19、邊緣被染成藍綠色即可（一般需染2030 min）。3、分離細胞：染色后，吸去染液，滴加Ringer溶液，用眼科剪將組織塊著色部分剪碎，使細胞或細胞群散出。圖7 洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞線粒體4、裝片：用吸管吸取分離出的細胞懸液，滴一滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察。在低倍鏡下選擇不重疊的肝細胞，在高倍鏡下觀察，可見具有l(wèi)2個核的肝細胞質(zhì)中，有許多被染成藍綠色的線粒體，呈顆粒狀或線條狀，在細胞核周圍分布特別多。（二）植物細胞線粒體的活體染色1、用吸管吸取 1/5000 詹納斯綠B 染液，滴一滴在干凈的載玻片上，然后用鑷子撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮一小塊，置于染液中，染色 1015 min。2、吸去染液，加

20、一滴 Ringer液，注意使內(nèi)表皮展平，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察。在高倍鏡下，可見表皮細胞中央被一大液泡所占據(jù)，細胞核被擠至旁邊，線粒體染成藍綠色，呈顆粒狀或線條狀。五、思考題1、肝細胞線粒體活體染色實驗的注意事項有哪些？2、線粒體為何在細胞核周圍分布較多？ 實驗四 細胞膜的通透性一、實驗?zāi)康?、了解細胞膜的滲透性及各類物質(zhì)進入細胞的速度，分析影響細胞膜的滲透性的因素。2、了解溶血現(xiàn)象及其發(fā)生機制。二、實驗原理細胞膜是細胞與環(huán)境進行物質(zhì)交換的選擇通透性屏障。它是一種半透膜，可選擇性控制物質(zhì)進出細胞。各種物質(zhì)出入細胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶劑，水分子可以按照物質(zhì)濃度梯度從滲透壓低的一側(cè)

21、通過細胞膜向滲透壓高的一側(cè)擴散，這種現(xiàn)象就是滲透。滲透作用是細胞膜的主要功能之一。將紅細胞放在低滲鹽溶液中，水分子大量滲到細胞內(nèi)，可使細胞脹破，血紅蛋白釋放到介質(zhì)中，由不透明的紅細胞懸液變?yōu)榧t色透明的血紅蛋白溶液，這種現(xiàn)象稱為溶血。將紅細胞放在某些等滲鹽溶液中，由于紅細胞膜對各種溶質(zhì)的通透性不同，膜兩側(cè)的滲透壓平衡會發(fā)生改變，也會發(fā)生溶血現(xiàn)象。因此，發(fā)生溶血現(xiàn)象所需時間長短可作為測量物質(zhì)進入紅細胞速度的一種指標。滲透壓相等的兩種溶液稱為等滲溶液。滲透壓不同的兩種溶液，把滲透壓相對高的溶液叫做高滲溶液，把滲透壓相對低的溶液叫做低滲溶液。對同一類型的溶質(zhì)來說，濃溶液的滲透壓比較大，稀溶液的滲透壓比

22、較小。因此，在發(fā)生滲透作用時，水會從低滲溶液（即稀溶液）進入高滲溶液（即濃溶液），直至兩溶液的滲透壓達到平衡為止。給傷病員進行大量補液時，常用與血漿等滲的0.154mol/L NaCl溶液（生理鹽水），而不能用0.256 mol/L NaCl的高滲溶液或0.068 mol/L NaCl的低滲溶液。圖8紅細胞在不同濃度NaCl溶液中的形態(tài)示意圖影響細胞膜的通透性的主要因素是跨膜轉(zhuǎn)運物質(zhì)自身的理化性質(zhì)，脂溶性大、分子量小、不帶電荷或非極性的分子比脂溶性小、分子量大、帶有電荷或極性的分子更容易穿膜。一般認為，在簡單擴散的跨膜轉(zhuǎn)運中，涉及物質(zhì)溶解在膜脂中，再從膜脂的一側(cè)擴散到另一側(cè)，最后進入細胞質(zhì)水相

23、中。所以，其通透性主要取決于分子大小和分子極性。本實驗選用紅細胞作為細胞膜透性的實驗材料，將其放入不同的介質(zhì)溶液中，觀察紅細胞的變化。由于細胞對各種溶質(zhì)的滲透性不同，有的溶質(zhì)可滲入， 有的溶質(zhì)不可以滲入，滲入的紅細胞溶質(zhì)可提高紅細胞的滲透壓，促使水分進入細胞，引起溶血。由于溶質(zhì)分子的大小、極性不同，溶質(zhì)滲入速度不同，因此溶血時間也不同。分子的極性、大小對物質(zhì)透過細胞的速度有影響。當(dāng)溶質(zhì)不能自由透過細胞膜時，溶液的滲透壓成為影響水分進出細胞的因素。當(dāng)溶液滲透壓小于細胞滲透壓時，則水分進入細胞，使細胞膨脹甚至溶血；反之，細胞失水。三、實驗用品新鮮雞血（加抗凝劑）、50ml燒杯、試管、試管架、刻度吸

24、管、秒表、載玻片、蓋玻片、普通光學(xué)顯微鏡、記號筆、0.85%NaCl、0.15mol/L NaCl、0.065mol/L NaCl、0.035mol/L NaCl、0.005mol/L NaCl、0.8mol/L甲醇、0.8mol/L乙醇、0.8mol/L乙二醇、0.8mol/L丙醇、0.8mol/L丙二醇、0.8mol/L丙三醇四、實驗內(nèi)容與方法 1、血細胞懸液的制備取1份雞血，加入10份的0.85%的NaCl（生理鹽水），即為稀釋的動物紅細胞懸液（不透明的紅色液體）。2、低滲溶血觀察取試管1支，加入5mL蒸餾水，然后再加入0.5 ml紅細胞懸液，晃動試管使之混勻，注意觀察溶液的顏色變化，溶

25、液由不透明的紅色變?yōu)槌吻?，說明紅細胞發(fā)生破裂，造成所有紅細胞溶血，使光線容易通過（可以通過試管壁看清書上的字為標準）。記錄溶血時間，顯微鏡下觀察溶血前后紅細胞的形態(tài)。3、血紅細胞的滲透性實驗 A組:0.15mol/L NaCl、0.065mol/L NaCl、0.035mol/L NaCl、0.005mol/L NaClB組:0.8mol/L甲醇、0.8mol/L乙醇、0.8mol/L乙二醇、0.8mol/L丙醇、0.8mol/L丙二醇、0.8mol/L丙三醇將試管編號，分別取A組試劑各5ml，加雞血0.5ml，立即混勻，觀察溶血與否，記錄溶血時間，重復(fù)以上實驗過程二次。制片進行顯微鏡觀察。再

26、分別取B組試劑各5ml，加雞血0.5 ml，方法同上。由于有的醇溶血時間較快，并且溶血時間較接近，所以2支試管一組重復(fù)以上實驗過程。五、思考題1、血紅細胞的滲透性實驗中，是否存在物質(zhì)跨膜的主動運輸現(xiàn)象？為什么？2、常用的抗凝劑的種類和作用機理是什么？3、已知四種等滲鹽溶液分別為0.17 mol/L醋酸銨、0.17 mol/L硝酸鈉、0.17mol/L氯化銨、0.12 mol/L草酸銨，試劑瓶上的標簽被蓋住了。如果用它們進行血紅細胞的滲透性實驗，你能否根據(jù)該實驗結(jié)果確切判斷出每一瓶中所裝的是哪一種試劑？為什么？ 實驗五 DNA的細胞化學(xué)Feulgen反應(yīng)一、實驗?zāi)康牧私?Feulgen反應(yīng)的原理

27、，掌握有關(guān)的操作方法。二、實驗原理DNA是由許多單核苷酸聚合成的多核苷酸，每個單核苷酸又由磷酸、脫氧核糖和堿基構(gòu)成。DNA經(jīng) 1 mol/L 鹽酸水解，其上的嘌呤堿和脫氧核糖之間的雙鍵打開，使脫氧核糖的第一碳原子上形成游離的醛基，這些醛基與Schiff試劑反應(yīng)。Schiff試劑是由堿性品紅和偏重亞硫酸鈉相作用，形成無色的品紅液，當(dāng)無色品紅與醛基結(jié)合即形成紫紅色的化合物。因此凡有DNA的地方，都能顯示紫紅色。紫紅色的產(chǎn)生，是由于反應(yīng)產(chǎn)物的分子內(nèi)含有醌基，醌基是一個發(fā)色基團，所以具有顏色。材料不經(jīng)過水解或預(yù)先用熱的三氯醋酸或DNA酶處理，得到的反應(yīng)是陰性的，從而證明了Feulgen反應(yīng)的專一性。圖

28、9 Feulgen反應(yīng)三、實驗用品普通光學(xué)顯微鏡、恒溫水浴箱、溫度計、試管、燒杯、載玻片、蓋玻片、吸水紙、洋蔥鱗莖1、Schiff試劑稱取 0.5 g堿性品紅加入到 100 ml煮沸的蒸餾水中（用三角燒瓶） ，時時振蕩，繼續(xù)煮 5 min（勿使之沸騰） ，使之充分溶解。然后冷卻至 50 時用濾紙過濾，濾液中加入 10 ml1mol/L HCl HCl，冷卻至 25 時，加入 0.5 g Na2S2O5（偏重亞硫酸鈉或鉀） ，充分振蕩后，塞緊瓶塞，在室溫暗處靜置至少 24 小時（有時需 23 天） ，使其顏色退至淡黃色，然后加入 0.5 g活性炭，用力振蕩 1min，最后用粗濾紙過濾于棕色瓶中，

29、封嚴瓶塞，外包黑紙。濾液應(yīng)為無色也無沉淀，貯于 4 冰箱中備用。如有白色沉淀，就不能再使用，如顏色變紅，可加入少許偏重亞硫酸鈉或鉀，使之再轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色時，仍可再用。2、亞硫酸水溶液取200ml自來水，加10ml10%偏重亞硫酸鈉（或偏重亞硫酸鉀）水溶液和 10ml1mol/L HCl，混勻。此溶液在使用前配制，否則會因SO2的逸出而失效。四、實驗內(nèi)容與方法1、酸解：將洋蔥鱗莖內(nèi)表皮放在60 1mol/L HCl中解離10 min。2、染色：用蒸餾水洗幾次，Schiff試劑遮光染色30 min。3、制片：回收Schiff試劑，用新鮮配制的亞硫酸水洗3次，每次1 min，洗完后水洗5 min，在載玻

30、片上鋪平表皮，蓋上蓋玻片。4、觀察：顯微鏡觀察，細胞核或染色體被染成紅色，細胞其余部分無色透明。 圖10 洋蔥鱗莖內(nèi)表皮Feulgen反應(yīng) 圖11Feulgen反應(yīng)對照結(jié)果對照片：方法一先將材料放在5 %三氯醋酸中90 水浴15 min，主要把DNA抽提掉，然后按步驟1-4制片觀察。方法二材料不經(jīng)1mol/L HCl水解，直接放在Schiff試劑中染色，然后按步驟3-4制片觀察。五、思考題1、Feulgen反應(yīng)中最關(guān)鍵的步驟是什么？為什么？2、用Schiff試劑對DNA進行染色與染料吸附的方法相比有什么優(yōu)勢？3、為什么Feulgen染色法不對RNA染色？ 實驗六 植物染色體標本的制備和觀察一、

31、實驗?zāi)康?、掌握常規(guī)壓片法制備植物染色體標本的基本原理和方法2、觀察有絲分裂過程中染色體的形態(tài)特征和動態(tài)變化二、實驗原理植物染色體標本的制備，常用分生組織，如根尖、莖尖和嫩葉做材料。Belling(1921)提出植物染色體壓片技術(shù)后，壓片已成為植物染色體研究中最廣泛應(yīng)用的常規(guī)技術(shù)，其程序包括取材、預(yù)處理、固定、解離、染色和壓片等步驟，是以人工外加機械壓力使染色體分散。該方法操作快速簡便、省材省時，但是由于植物細胞有堅實的細胞壁，染色體很難像動物染色體那樣平整地貼在載玻片上，染色體很難分散開，染色體容易變形和斷裂。三、實驗用品普通顯微鏡、剪刀、鑷子、刀片、培養(yǎng)皿、濾紙、吸水紙、載玻片、蓋玻片、恒

32、溫水浴鍋、燒杯、洋蔥（2n=16）或蠶豆種子（2n=12）、甲醇、冰醋酸、秋水仙素（或?qū)Χ缺剑?、無水乙醇、1mol/LHCl。改良苯酚品紅染色液的配制：母液A：稱取3g堿性品紅，溶于100ml 70%乙醇中（此液可于4冰箱中長期保存）。母液B：取A液10ml，加入90ml 5%苯酚水溶液（兩周內(nèi)使用）。取B液45ml，加入6ml冰醋酸和6ml 37%甲醛。此為苯酚品紅染色液。取苯酚品紅染色液10ml，加入90ml45%的醋酸和1.8g山梨醇。放置兩周后，染色效果較好。此液稱為改良苯酚品紅染色液。四、實驗內(nèi)容與方法1、材料培養(yǎng)：把洋蔥置于盛有清水的小燒杯口上，使生根部位與水接觸，2528條件下

33、培養(yǎng)，根長11.5cm時，于上午9時11時把根尖約0.5cm剪下備用。把干燥的蠶豆種子置水中浸種1天，種子吸水膨脹后轉(zhuǎn)到鋪有幾層吸水紙的培養(yǎng)皿或瓷盤中，上蓋雙層濕紗布并加少許水，2528條件下培養(yǎng)，待根長約11.5cm時，于上午911時或下午36時剪下根尖備用。2、預(yù)處理：將剪下的根尖置對二氯苯飽和水溶液，或0.1%秋水仙素溶液中，浸泡處理4小時。3、固定：用水洗凈處理過的根尖，經(jīng)甲醇-冰醋酸（31）固定612小時， 再經(jīng) 95%、85%乙醇各半小時，最后轉(zhuǎn)入70%乙醇中，4保存?zhèn)溆谩?、解離：取出根尖，用蒸餾水洗凈，放入1mol/LHCl中60解離810min，再用蒸餾水洗2次，每次35mi

34、n。5、染色：把處理好的根尖放在載玻片上，切取乳白色的分生區(qū)，用鑷子輕輕搗碎，滴上一滴改良苯酚品紅染液，染色 510min后，蓋上蓋玻片。 6、壓片：在蓋玻片上面鋪上吸水紙，固定好蓋玻片，用拇指垂直壓片，再用鉛筆橡皮頭輕敲擊，使材料壓成均勻的薄層，細胞和染色體分散。圖12 洋蔥根尖染色體裝片 7、鏡檢：先用中倍鏡觀察壓片中細胞分散狀況和中期分裂相的多少，再檢查分裂中期細胞中的染色體是否完全分開，然后轉(zhuǎn)用高倍鏡尋找分散開的中期染色體，要求數(shù)出相應(yīng)的染色體數(shù)?？梢钥吹?，染色質(zhì)和染色體被染成紫紅色。如若染色體分散不好而難以分辨和計數(shù)，可取下片子，平放桌面上，用手指隔著吸水紙在蓋玻片上稍施壓力再觀察。

35、如果操作細心，用力適度，便可很容易得到染色體分散良好的壓片標本。五、思考題1、固定液的作用是什么？在使用固定液時應(yīng)注意什么？2、預(yù)處理中秋水仙素的作用是什么？ 實驗七 細胞計數(shù)一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)、掌握細胞培養(yǎng)中最基本的細胞計數(shù)方法。二、實驗原理細胞計數(shù)法是細胞培養(yǎng)的一項基本技術(shù)。它是了解細胞生長狀態(tài)，繪制生長曲線等的重要手段。在動物細胞原代與傳代培養(yǎng)、細胞冷凍與復(fù)蘇等眾多技術(shù)中需要進行細胞計數(shù)；植物細胞進行懸浮培養(yǎng)也需要測定細胞數(shù)目。細胞計數(shù)就是從需要計數(shù)的細胞懸液中取一定量的細胞進行計數(shù)，并通過計數(shù)得知原始細胞懸液中的細胞密度以及細胞總數(shù)。在細胞計數(shù)時，若細胞濃度太高，可進行必要的稀釋。常用的

36、細胞計數(shù)有電子細胞計數(shù)儀計數(shù)法和細胞板計數(shù)法，但電子計數(shù)儀計數(shù)法在許多實驗室尚未完全推廣，細胞板計數(shù)法仍是普通實驗室目前常用的方法。三、實驗用品雞血紅細胞懸液、0.17mol/L NaCl溶液、細吸管、乙醇、細胞計數(shù)板、計數(shù)器、普通顯微鏡四、實驗內(nèi)容與方法1、制備雞血紅細胞懸液：取50ml小燒杯1只，以1份雞血加10份的0.17mol/L NaCl溶液稀釋，形成一種不透明的紅色液體，此為雞血紅細胞懸液。2、準備計數(shù)板：用乙醇清潔計數(shù)板及專用蓋玻片，然后用綢布輕輕拭干。3、加樣：先將特制的蓋玻片放在細胞計數(shù)板上，使兩側(cè)均現(xiàn)帶色牛頓環(huán)。用細吸管取少量待測細胞懸液，沿蓋玻片邊緩緩滴入，讓其自由滲入，

37、待整個蓋玻片下均充滿細胞懸液為宜。注意不要使液體流到旁邊的凹槽中。4、計數(shù)：在顯微鏡下，用10×物鏡觀察計數(shù)板四角大方格（每個大方格又分16個小方格）中的細胞數(shù)。計數(shù)時，只計數(shù)完整的細胞，若聚成一團的細胞則按一個細胞進行計數(shù)。（如細胞團10%，說明分散不充分；若細胞數(shù)200個/10mm2或500個/10mm2時，說明稀釋不當(dāng)，需重制備細胞懸液、計數(shù)）在一個方格中，如果有細胞位于線上，一般計上線細胞不計下線細胞，計左線細胞不計右線細胞，計數(shù)誤差不能超過±5%。 圖14 細胞計數(shù)原則及順序（計數(shù)黑點，不計數(shù)白點） 5、計算：將計數(shù)結(jié)果代入下式，得出細胞密度： 細胞數(shù)/ml懸液=

38、（4大方格細胞數(shù)之和/4）×104五、思考題1、計算細胞密度所用的公式是如何推導(dǎo)出來的？試利用計數(shù)板上給出的數(shù)據(jù)進行推導(dǎo)。2、為什么細胞計數(shù)時，細胞懸液逸出凹槽外或有氣泡時要重做？ 實驗八 植物細胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察一、實驗?zāi)康?掌握用光學(xué)顯微鏡觀察植物細胞骨架的原理和方法，觀察光學(xué)顯微鏡下植物細胞骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。二、實驗原理細胞骨架（cytoskeleton）是由蛋白質(zhì)絲組成的復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)其組成成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)可分為微管、微絲和中間纖維。它們對細胞形態(tài)的維持，細胞的生長、運動、分裂、分化，物質(zhì)運輸，能量轉(zhuǎn)換，信息傳遞，基因表達的起到重要作用。目前觀察細胞骨架的手段主要有電鏡、

39、間接免疫熒光技術(shù)、酶標和組織化學(xué)等。微絲是球形肌動蛋白單體構(gòu)成的纖維結(jié)構(gòu)，單根微絲直徑7nm，在光學(xué)顯微鏡下看不到該細胞骨架的結(jié)構(gòu)，本實驗觀察的是植物細胞中由微絲平行排列形成的微絲束。常用的觀察微絲的方法主要是考馬斯亮藍R-250染色法。當(dāng)用適當(dāng)濃度的TritonX-100處理細胞時，可將細胞質(zhì)膜中和細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)和全部脂質(zhì)被溶解抽提，但細胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)不受破壞而被保存，經(jīng)用戊二醛固定，考馬斯亮藍R250染色后，可在光學(xué)顯微鏡下觀察到由微絲組成的微絲束為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這就是細胞骨架。三、實驗用品洋蔥鱗莖、普通光學(xué)顯微鏡、50ml燒杯、載玻片、蓋玻片、刀片、小剪刀、吸水紙、擦鏡紙、鑷子、滴管1

40、、6mmol/L（pH6.8）磷酸緩沖液（用NaHCO3調(diào)pH）：Na2HPO4.12H2O 1.18g；KH2PO4 0.45g溶解于蒸餾水中至1000ml。2、M-緩沖液：用1mol/L HCl調(diào)pH至7.2。M緩沖液的配方試劑所需濃度相對分子質(zhì)量每升加量備注咪唑50mmol/L68.083.40g KCl50mmol/L74.553.73g MgCl2.6H2O0.5mmol/L203.300.10g EGTA（乙二醇四乙酸）1mmol/L380.400.38g EDTA.2H2O0.1mmol/L372.240.04g 巰基乙醇1mmol/L78.1370ld=1.114g/ml，14

41、.3mol/L*甘油（可不加）4.0mol/L92.09294.8mld=12.5g/ml，13.57mol/L3、1%TritonX-100：用M-緩沖液配制。4、3%戊二醛；用6mmol/L磷酸鹽緩沖液配制。5、0.2%考馬斯亮藍R250，其溶劑為：甲醇 46.5ml、冰醋酸 7ml、蒸餾水 46.5ml。四、實驗內(nèi)容與方法1、取材：撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞（約1cm2大?。┲糜谘b有6mmol/L磷酸鹽緩沖液的燒杯中，使其下沉。2、抽提：吸去磷酸鹽緩沖液，用1% TritonX-100處理2030min.。3、沖洗：吸去TritonX-100，用M緩沖液洗3次，每次10min。4、固定：3%

42、戊二醛固定30min。5、沖洗：6mmol/L磷酸鹽緩沖液洗3次，每次10min。6、染色：0.2%考馬斯亮藍R-250染色20min。7、制片：用蒸餾水洗1-2次，將標本置于載玻片上，加蓋片。8、觀察：光鏡下可見表皮細胞的輪廓，細胞內(nèi)存在著染成藍色、粗細不等的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，即為構(gòu)成細胞骨架的微絲束。圖15 洋蔥表皮細胞骨架五、思考題1、戊二醛、考馬斯亮蘭R250、TritonX-100是什么？在本實驗中各起什么作用？ 2、什么是細胞骨架？它有何主要功能？ 3、列舉你所知道的動、植物細胞中由微絲組成的結(jié)構(gòu)。 實驗九 植物原生質(zhì)體的分離和活性鑒定一、實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)植物細胞原生質(zhì)體分離純化的方法

43、。2、了解原生質(zhì)體活性鑒定的原理。二、實驗原理植物原生質(zhì)體是去除了細胞壁的裸露的細胞。在適宜的培養(yǎng)條件下，分離的原生質(zhì)體，又可重新合成新的細胞壁，經(jīng)過細胞分裂并再生成完整的植株。原生質(zhì)體可從培養(yǎng)的單細胞、愈傷組織和植物器官（葉、下胚軸等）獲得。原生質(zhì)體的分離通常采用酶解法，其原理是植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶配制而成的溶液能降解細胞壁成分，使原生質(zhì)體釋放出來。原生質(zhì)體培養(yǎng)的條件和對營養(yǎng)的要求與組織、細胞培養(yǎng)相似。但原生質(zhì)體由于是除去了細胞壁，其內(nèi)部與外界環(huán)境之間僅隔一層薄薄的細胞膜，所以培養(yǎng)基中要有一定濃度的滲透壓穩(wěn)定劑來保持原生質(zhì)體的穩(wěn)定

44、，以使原生質(zhì)體在分離前細胞處于質(zhì)壁分離狀態(tài)，分離之后不致膨脹破裂。常用的滲透壓穩(wěn)定劑包括甘露醇、山梨醇、蔗糖等。酶液中還應(yīng)含一定量的鈣離子，來穩(wěn)定原生質(zhì)膜。培養(yǎng)基中添加的生長素、細胞分裂素也是必須的。測定原生質(zhì)體的活性有多種方法。熒光素雙醋酸酯（FDA）染色是常用的一種方法，F(xiàn)DA本身無熒光，無極性，可透過完整的原生質(zhì)膜。一旦進入原生質(zhì)體后，由于受到酯酶分解而產(chǎn)生具有熒光的極性物質(zhì)熒光素。它不能自由出入原生質(zhì)膜，因此有活力的細胞能產(chǎn)生熒光，無活力的原生質(zhì)體不能分解FDA，無熒光產(chǎn)生。高等植物原生質(zhì)體除了用于細胞融合的研究以外，還能通過它們裸露的質(zhì)膜攝入外源DNA、細胞器、細菌或病毒顆粒。原生質(zhì)

45、體的這些特性與植物細胞的全能性結(jié)合在一起，已經(jīng)在遺傳工程和體細胞遺傳學(xué)中開辟了一個理論和應(yīng)用研究的嶄新領(lǐng)域。三、實驗用品超凈工作臺、低速離心機、倒置顯微鏡、高壓滅菌鍋、細胞計數(shù)板、帶蓋離心管、細菌過濾器、200目鎳絲網(wǎng)、解剖刀、鑷子、刻度吸管、培養(yǎng)皿、燒杯、綠豆、70%乙醇、0.1%升汞溶液（加入少許吐溫80）、20%蔗糖。1、0.1%2-N-嗎啡啉乙磺酸鈉（MES）或三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液：內(nèi)含20%蔗糖，pH6.0。2、酶解液：用0.1%MES或Tris配制1%(WV)纖維素酶，1% (WV)果膠酶，0.7molL甘露醇，10mmol/L CaCl2.2H2O，0.7mmol/L

46、 KH2PO4，pH 6.87.0。3、13% CPW洗滌液：用0.1%MES或Tris配制27.2mg/L KH2PO4，101.0mg/L KNO3，1480.0mg/L CaCl2.2H2O，246.0mg/L MgSO4，0.16mg/L KI，0.025mg/L CuSO4.5H2O，13%(W/V)甘露醇，pH 6.0。4、0.02%二乙基熒光素(FDA)：5mg FDA溶于1ml丙酮中，避光4下貯存，使用時取0.22ml FDA貯存液加入5ml 0.65mol/L甘露醇中，使用時使最終濃度為0.01%。四、實驗內(nèi)容和方法1、綠豆種子用70 %乙醇消毒，自來水流水浸泡4 h左右，于濕濾紙上萌發(fā)。25 黑暗